鸡蛋清溶菌酶的提取纯化工艺研究
溶菌酶提取
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
溶菌酶
溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究
第7卷第3期大连民族学院学报V ol.7 No.3 2005年5月 JOURNAL OF DALIAN NATIONALITIES UNIVERSITY May 2005 鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究 大连民族学院生命科学学院2001级高威孙纯义 溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶. 因其对人体细胞没有毒性作用，故在医学、食品科学等领域广泛应用. 蛋清中溶菌酶的含量约2‰，但杂蛋白的含量很高，使得在制取高纯度溶菌酶时操作比较复杂，成本较高. 本文介绍的方法操作简便，成本低，收率高. 1 实验材料与方法 1.1 实验材料 实验原料：新鲜的鸡蛋清. 试剂：冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95%乙醇（以上试剂均为国产分析纯级），CM Sepharose FF（Parmacia公司生产）. 仪器：TDL—50B低速台式大容量离心机、752紫外可见分光光度计、TA2104H电子天平、恒温水浴锅等. 1.2 实验方法[1] 取100mL纯净水，用醋酸调pH值为3.5，水浴加热到85℃. 加入50mL新鲜蛋清，搅拌加热5min.将所得液体3000r/min离心10min，收集上清液. 将上清液加入处理好的CM Sepharose FF层析柱中，控制流速在200mL/h 左右. 吸附完毕用纯净水冲洗吸附柱，以除去杂蛋白. 用100mL 0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱溶菌酶，流速200mL/h. 收集洗脱液，检测酶活力. 1.3 检测方法[2] 溶菌酶活力测定：将处理好的黄色小球菌用生理盐水稀释，使其在波长450nm处，吸光度在0.3~0.8之间. 用生理盐水做空白相，在比色皿中加入20μL洗脱液，然后加入3mL稀释好的菌液，于波长在λ450处，测量1min 内的吸光度下降值. 酶活力单位定义：每分钟引起ΔOD450下降0.001为一个酶活力单位. 溶菌酶活力=ΔOD450/0.001×W（W为加入溶菌酶质量）. 蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝染色法. 以溶菌酶标准品为标准蛋白. 2 结果与分析 2.1 溶菌酶的提取及初步纯化 溶菌酶属于碱性蛋白酶，化学性质非常稳定，pH在3.0~7.0时其结构几乎不变，仍保持原酶活性. 在中性介质的条件下，溶菌酶能与鸡蛋清中其他蛋白质形成络合物，大大提高了其稳定性. 在这种情况下，溶菌酶的析出被抑制，但如果在该体系加入酸，降低体系pH值，就可破坏上述络合物的形成，使得溶菌酶与酸作用生成相应的盐，这样溶菌酶就可很好地被水提取. 同时，由于大多数的蛋白质分子的等电点都处在酸性或弱酸性范围内，所以也可去除部分杂蛋白，达到初步纯化的目的. 溶菌酶具有较好的热稳定性，当温度不是很高时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般的杂蛋白分子会在较低的温度下变性沉淀. 将体系温度升高到85℃时，鸡蛋清中大量的其他蛋白质凝聚，而溶菌酶由于其耐热性较高则不会凝聚，仍在上清液中，这样也可以促进溶菌酶与其他蛋白质分开. 这样通过调节体系的pH值及温度，可达到从蛋清中较好地提取溶菌酶的目的. 2.2 用CM Sepharose FF高度纯化 CM Sepharose FF是弱酸性阳离子交换树脂，对溶菌酶有较高的吸附能力，与传统离子交换剂相比具有吸附速度快,能够快速洗脱的特点. 可使溶菌酶比活力由吸附前874U/mg上升到18 830U/mg，蛋白活力提高了22倍，且收率较高. 3 结论 查溶菌酶标准曲线可得洗脱液中溶菌酶的含量为1.05mg/mL，总得率为0.19%. 以黄色小球菌测定，酶活力为18 830U/mg. 所得酶活力与传统提取工艺相比纯度有较大的提高，同时具有操作简便、成本较低、收率较高、生产周期短等优点. 参考文献： [1] 张文会，王艳辉. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J]. 食品工业科 技，2003（6）24：57-59. [2] 林亲录，马美湖. 鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J]. 食品科学， 2002（2）23：43-46.
PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响
2011届本科毕业生毕业论文 题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 作者姓名徐萧苟真汪磊 指导教师刘秀丽 学科专业生物技术 系别生命科学与技术学院 学号2007221121 2007221102 2007221115 提交论文日期2011年6月2日
PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 徐萧苟真汪磊 指导老师：刘秀丽 （陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000） 摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。 关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PH Ph, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme Activity Xuxiao gouzhen wanglei （Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes in Qingyang 745000） Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effect Keywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH; 0引言 溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶
(推荐)溶菌酶作用机理
溶菌酶作用机理 1.溶菌酶：是催化某些细菌细胞壁水解、从而溶解其细胞壁的酶，主要存在于鸡蛋清及动物的眼泪中。 2.细胞壁多糖：是N-乙酰氨基葡萄糖（NGA）-N-乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）的共聚物，其中的NGA及NAM通过b-1，4糖苷键而交替排列： 3.溶菌酶的结构：由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有四对二硫键，一级结构如图所示 4.溶菌酶的催化作用：为葡糖苷酶，能水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG的C1 与NAM的C4之间的糖苷键，水解作用如下： 5.溶菌酶的三维结构：溶菌酶分子内部几乎是非极性的，在分子的表面有一个较深的裂缝，恰好能容纳多糖底物的六个单糖（ABCDEF环），是溶菌酶的活性部位，其中白色所示的是活性部位的Glu35和Asp52。 6.溶菌酶与底物的复合物的三维结构： 7.溶菌酶-底物结合部位示意图：NAG多聚体水解速率表明从5到6聚体增加到最大，活性部位的裂缝正好被六个糖残基所装满，水解部位是D和E之间的糖苷键
8.溶菌酶与底物的复合物的三维结构示意图：第四个糖残基D环由于空间的原因必须由正常的椅式变形为能量较高的半椅式，因此降低了糖苷键的稳定性容易断裂。 9.溶菌酶催化作用机制要点总结： （1）Glu35的-COOH提供一个H+到D环与E环间的糖苷键O原子上。H+的转移使D环的C1键与糖苷键O原子间的键断开，并形成正碳离子过渡中间产物。（2）含有E及F残基的NAG二聚体离开酶分子。 （3）正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的OH-发生反应， Glu35质子化，酶游离出来。
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鸡蛋溶菌酶提取
鸡蛋溶菌酶提取 溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶） 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 性质： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适 pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 作用： 溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。 提取工艺： （一）鸡蛋清中提取溶菌酶 方法一——食盐盐析 一．材料： 原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂） 仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机 二．工艺流程： 原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH 值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
实验二 离子交换法提取谷氨酸
实验二离子交换法提取谷氨酸 一、实验目的 掌握离子交换装置的结构和使用方法。 掌握离子交换法提取谷氨酸的工艺流程。 掌握等电点沉淀法提取谷氨酸。 了解认识离子交换树脂的处理和再生。 二、实验原理 谷氨酸是两性电解质，是一种酸性氨基酸，等电点为pH3.22，当pH＞3.22时，羧基离解而带负电荷，能被阴离子交换树脂交换吸附；当pH＜3.22时，氨基离解带正电荷，能被阳离子交换树脂交换吸附。也就是说，谷氨酸可被阴离子交换树脂吸附也可以被阳离子交换树脂吸附。由于谷氨酸是酸性氨基酸，被阴离子交换树脂的吸附能力强而被阳离子交换树脂的吸附能力弱，因此可选用弱碱性阴离子交换树脂或强酸性阳离子交换树脂来吸附氨基酸。但是由于弱碱性阴离子交换树脂的机械强度和稳定性都比强酸性阳离子交换树脂差，价格又较贵，因此就都选强酸性阳离子交换树脂而不选用弱碱性阴离子交换树脂。目前各味精厂均采用732#强酸性阳离子交换树脂，本实验就是采用732#树脂。 谷氨酸溶液中既含有谷氨酸也含有其他如蛋白质、残糖、色素等妨碍谷氨酸结晶的杂质存在，通过控制合适的交换条件，在根据树脂对谷氨酸以及对杂质吸附能力的差异，选择合适的洗脱剂和控制合适的洗脱条件，使谷氨酸和其他杂质分离，以达到浓缩提纯谷氨酸的目的。 三、实验装置 1、离子交换装置 本实验采用动态法固定床的单床式离子交换装置。离子交换柱是有机玻璃柱，柱底用玻璃珠及玻璃碎片装填，以防树脂漏出。 2、树脂 本实验用苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，编号为732#，其性能如下表：
732#树脂的主要性能常数 3、树脂的处理 对市售干树脂，先经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加3倍量的2mol/L HCL溶液，在水浴中不断搅拌加热到80℃，30min后自水溶液中取出，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2mol/L NaOH溶液，同上洗树脂30min后，用蒸馏水洗至中性，这样用酸碱反复轮洗，直到溶液无黄色为止。用6%（W/W）盐酸溶液转树脂为氢型，蒸馏水洗至中性备用。过剩的树脂浸入1mol/L NaOH溶液中保存，以防细菌生长。 四、试剂配制 1、上柱交换液 谷氨酸发酵液或等电点母液，含谷氨酸2%左右。 配制方法；取工厂购回的谷氨酸干粉20g溶于200ml自来水中，再加进约8ml浓盐酸使谷氨酸粉全部溶解，此时pH值约为1.5，最后稀释至1.0L。 2、洗脱用碱 4%NaOH溶液。其配制方法有两种： ①40gNaOH溶于1000ml自来水中； ②工业用碱配成4%浓度（W/W），（约9°Bx，相对密度1.04） 3、再生用酸 6%（W/W）盐酸溶液。把大约80ml浓盐酸（36%含量）用自来水稀释至500ml。配成约4°Be，相对密度1.027的溶液。 4、0.5%茚三酮溶液 0.5g茚三酮溶于100mL丙酮溶液中配制成。
一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法
(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12 C N 103114082 B (21)申请号 201310069093.9 (22)申请日 2013.03.04 C12N 9/36(2006.01) (73)专利权人浙江工业大学 地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武 张岩 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人黄美娟 王兵 CN 1108381 C,2003.05.14, 陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈 阳化工学院院报》.2008, 卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化 学教学》.1995, M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的 方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0 并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获 得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与 滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物 在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解 离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使 其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原 材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、 生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工 业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件 审查员 孙彦珂 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
第一节 溶菌酶的提取
第一节溶菌酶的提取 一、简介 1.Lz的结构及组成 溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特 别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四 图5-1 溶菌酶的分子结构 对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 2.Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。 （1）Lz的热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件
下稳定，在碱性条件下不稳定。 糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 （2）加工过程中的化学变化 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 （3）络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 3.Lz的用途 溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。 由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。 此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。 4.Lz的来源及分布 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类： （1）动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应
离子交换法提取谷氨酸
离子交换法回收提取谷氨酸 一、实验目的 通过实验掌握新树脂的预处理方法及动态离子交换的基本操作；了解谷氨酸提取的原理和方法。 二、实验原理 树脂的选择，选择离子交换树脂的主要依据是被分离物的性质和分离目的。包括被分离物和主要杂质的解离特性、分子量、浓度、稳定性、所处介质的性质以及分离的具体条件和要求。然后从性质各异的多种树脂中选择出最适宜的品种进行分离操作。 其中最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性弱碱性的树脂。这样有利于提高选择性，并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，往往选用强碱、强酸树脂。如氨基酸的分离多用强酸树脂，以保证有足够的结合力，便于分步洗脱。对于大多数蛋白质，酶和其它生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。 就树脂而言，要求有适宜的孔径，孔径太小交换速度慢，有效交换量下降(尤对生物大分子)，若孔径太大也会导致选择性下降。此外树脂的化学稳定性及机械性能也需考虑．在既定的操作条件下有足够的化学耐受性和良好的物理性能以利操作。一般树脂都有较高的化学稳定性，能经受酸、碱和有机溶剂的处理。但含苯酚的磺酸型树脂及胺型阴离子树脂不宜与强碱长时间接触，尤其是在加热的情况下。对树脂的特殊结合力也要给予足够的注意，如树脂对某些金属离子的结合以及辅助力的作用。 氨基酸为两性电解质，等电点较低的谷氨酸在pH小于pI 3.2时，主要以GA+型式存在，故可用强酸性阳离子交换树脂提取。当发酵液流过交换柱时，发酵液中各成分依亲和力的不同进行交换。吸附GA的树脂再用洗脱液(5%NaOH)洗脱，收集富含GA的流分(高流液)。从而实现与杂质的分离及GA的富集，高流液调等电点pH 3.2，GA结晶析出。用过的树脂用稀酸再生以用于下轮交换（图1）。主要化学反应有： 交换: RSO3H + NH4+ = RSO3NH4+ RSO3H + GA+ = RSO3GA + H+ 洗脱: RSO3-GA+ + NaOH = RSO3Na+ + GA+ + H2O RSO3-GA+ + NH4OH = RSO3HN4+ + GA+ + H2O 再生: RSO3Na+ + HCl = RSO3H + NaCl
溶菌酶的提取-分离纯化-产物纯度鉴定和活性测定
溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定 实验目的： 1、学习和掌握溶菌酶的制备过程 2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程 3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术 4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度 5、测定所提取的溶菌酶的活性 试验原理： 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。 该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 2.1、离子交换层析 离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。本实验分离溶菌酶采用732型弱酸性阳离子交换树脂。 2.2、盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶。当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶解中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO42-和NH4+）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之失水，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析是若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。溶菌酶在32%硫酸铵盐浓度下的沉淀最多，最适宜作为盐析液浓度。经盐析得到的沉淀为溶菌酶的粗制品。 2.3 透析脱盐 将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚
南师大蛋清中提取溶菌酶实验
蛋清中提取溶菌酶 南京师范大学生命科学学院姓名：穆旭学号：09130333 摘要：本实验通过离子交换层析提取蛋清中的溶菌酶，掌握静态和动态离子交换的方法； 和从生物材料中提取活性蛋白质方法，并用超滤法分离溶菌酶和盐析浓缩溶菌酶，掌握超滤分离技术的原理和操作。并且用SDS-PAGE检测溶菌酶的纯度和含量，从而掌握SDS－PAGE的原理和操作。 关键词：溶菌酶，柱层析，离子交换树脂，超滤，盐析，SDS-PAGE 研究材料与实验方法 1.柱层析前的准备工作 实验材料： 树脂：724型阳离子交换树脂、层析柱：φ1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽滤瓶，铁架台，恒流泵，核酸蛋白检测仪等。1.1预处理724型阳离子交换树脂 碱－酸－碱的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（体积约为树脂的2—3倍）浸泡树脂10—15min后，都要用蒸馏水将碱液、酸液冲洗掉。 1.2装填离子交换层析柱（重力沉降法） 固定层析柱，保持层析柱垂直；将蒸馏水倒入层析柱中，以排出管道中的空气，当蒸馏水高度约为层析柱高的一半时，将层析柱下端的塑料管夹紧；用玻璃棒将树脂搅拌均匀，倒入层析柱内，松开下端的塑料管，树脂自然沉降，最后保持蒸馏水面高于树脂表面约2cm。 1.3配制0.1M磷酸钠缓冲液pH7.0 先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4 42.3mL将两者混合后稀释至1000mL，装于试剂瓶中。 1.4平衡离子交换树脂 0.1M磷酸钠缓冲液恒速缓慢流经树脂，直至流出液的pH值与缓冲液相同，平衡结束。 2.柱层析法提取溶菌酶 实验材料： 起始缓冲液：0.1M 磷酸钠缓冲液（pH7.0） 洗脱液：50mM NaCl溶液200mL（溶剂：起始缓冲液）、500mM NaCl溶液150mL （溶剂：起始缓冲液） 再生溶液：0.5M NaOH溶液 仪器：磁力搅拌器等 其他材料：新鲜鸡蛋 2.1样品的预处理 取2个新鲜鸡蛋，在其一端敲一个小洞，收集蛋清，加入约其体积1.5倍的起始缓冲液，搅拌均匀，用4层纱布过滤除去不溶性物质，检查其pH值是否为7.0，否则用0.5M酸、碱调节。
溶菌酶溶液配制及应用
溶菌酶溶液 简介： 华越洋溶菌酶溶液是浓度分别为10mg/ml的蛋清型溶菌酶溶液，可以用于下列分子生物学实验： 1.核酸纯化 2.包涵体蛋白纯化 3.质粒DNA纯化 4.几丁质的水解 5.细胞壁的水解 运输及保存： 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 ============================================================= 溶菌酶存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
用途用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。 生产 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 制备 溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性。该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 优点 1．溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；2．溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；3．溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；4．溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；5．溶菌酶生产成本较低；6．溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G 菌也有抑制效果；7．溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。 应用 医学应用 可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 食品应用 可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。
谷氨酸的发酵和提取工艺综述
综述：谷氨酸的发酵与提取工艺 第一部分谷氨酸概述 谷氨酸非人体所必需氨基酸，但它参与许多代谢过程，因而具有较高的营养价值，在人体内，谷氨酸能与血氨结合生成谷氨酰胺，解除组织代谢过程中所产生的氨毒害作用，可作为治疗肝病的辅助药物，谷氨酸还参与脑蛋白代谢和糖代谢，对改进和维持脑功能有益。另外，众所周知的谷氨酸钠盐即味精有很强烈的鲜味，是重要的调味品。 1996、1997、1998年味精年产量分别为55.0万吨、56.64万吨、59.03万吨。尽管如此，我国人均年消耗味精量还只有400g左右，而台湾省已达2000g。因此，中国将是世界上最大的潜在味精消费市场，也就是说，味精生产会稳步发展。这也意味着谷氨酸的生产不断在扩大[1]。 谷氨酸生产走到今天就生产技术而言已有了长足进步,无论是规模还是产能都今非昔比,与此同时各厂家还在追求完美, 这是行业进步的动力,也是生存之所需。实际上生产工艺是与时俱进的,没有瑕疵的工艺是不存在的。如:配方及提取方法现在是多种多样,有单一用纯生物素的,也有用甘蔗糖蜜加纯生物素的, 还有加玉米浆干粉或麸皮水解液及豆粕水解液等等;提取方法有:等电-离交、等电-离交-转晶、连续等点-转晶等等[2]。 本综述简述谷氨酸生产的流程及发酵机制，着重介绍谷氨酸的提取工艺。 第二部分谷氨酸生产原料及其处理 谷氨酸发酵的主要原料有淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、醋酸、乙醇、正烷烃(液体石蜡)等。国内多数谷氨酸生产厂家是以淀粉为原料生产谷氨酸的，少数厂家是以糖蜜为原料进行谷氨酸生产的，这些原料在使用前一般需进行预处理。 (一)糖蜜的预处理 谷氨酸生产糖蜜预处理的目的是为了降低生物素的含量。因为糖蜜中特别是甘蔗糖蜜中含有过量的生物素，会影响谷氨酸积累。故在以糖蜜为原料进行谷氨酸发酵时，常常采用一定的措施来降低生物素的含量，常用的方法有以下几种:(1)活性炭处理法; (2)水解活性炭处理法;（3）树脂处理法。 (二)淀粉的糖化 绝大多数的谷氨酸生产菌都不能直接利用淀粉，因此，以淀粉为原料进行谷氨酸生产时，必须将淀粉质原料水解成葡萄糖后才能供使用。可用来制成淀粉水解糖的原料很多，主要有薯类、玉米、小麦、大米等，我国主要以甘薯淀粉或大米制备水解糖。 淀粉水解的方法有三种：①酸解法；②酶解法；③酸酶(或酶酸)结合法。 1．酸解法用酸解法生产水解糖，其工艺流程如下： 原料(淀粉、水、盐酸)调浆→糖化→冷却→中和→脱色→过滤除杂→糖液2．酶解法先用α-淀粉酶将淀粉水解成糊精和低聚糖，然后再用糖化酶将糊精和低聚糖进一步水解成葡萄糖的方法，称为酶解法。 与淀粉的酸解相比，酶解法具有以下一些优点：①酶解反应条件比较温和。细菌α-淀粉酶是在pH6.0～7.0、温度85～90℃条件下，将淀粉液化成能溶解于水的糊精和低聚糖；而糖化酶是在pH4.0～4.5、温度58—60℃条件下，完成糖化反应的。②由于酶的作用专一性强，因此水解过程中很少有副反应发生。③淀粉乳
溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨_黄赞良
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液(如淋巴液)、组织(如肝)、肾细胞内等[1]。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作用，是一种安全的天然防腐剂，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等[2]。 作为碱性酶的溶菌酶，其来源不同，水解细胞壁的性能也表现为较大差异[3]。溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖，作用位点是NAM与NAG碳原子间的β-1.4糖苷键[4]。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架)，是NAG 与NAM 通过 β-1，4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。肽聚糖结构中的任何化学键断裂，都能促使细胞壁中的肽聚糖分解，导致细菌细胞壁被破坏，从而体现溶菌酶的溶菌特性[6]。 近年来，根据不同原料及溶菌酶的特性，提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这一传统的方法，是由 Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶[7]。本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料，采用结晶法提取分离溶菌酶，进而利用重结晶的方法反复精制，可提取到所需纯度的溶菌酶晶体[8]。 1 实验 1.1 主要仪器、试剂与材料 1.1.1 主要仪器 UV-29200 紫外可见分光光度计；JJ-a 数控恒温磁力搅拌器；M304781 离心机；DSX-280B蒸气压力灭菌锅；KYC-111 摇床；SW-CJ-2F 超净工作台；FD-1B-50 冷冻干燥机；2X-15D 旋片式真空泵；R201 旋转蒸发仪；Sorvalls Upert-21 高速离心机；YP-5002 电子天平。 1.1.2 主要试剂 R-250、G-250考马斯亮蓝；NaH2PO4；Na2HPO4；1mol/L NaOH；20000 u/mg溶菌酶标准液；3g/L牛肉膏；营养肉汤；10g/L胰蛋白陈；微球菌； 5.1%的 NaCl溶液；HCl；CH3COOH；琼脂。 1.1.3 主要材料 新鲜湖光岩鹌鹑蛋，购置于湖光岩农贸市场。 1.2 实验方法 溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨 黄赞良，谈海玉，邓彩思，张兆霞*，李 泳* （广东海洋大学，广东 湛江 524088） 摘 要：以湖光岩鹌鹑蛋为原料，采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。探讨不同条件对溶菌酶收率及活性的影响，确定溶菌酶最佳的分离提取条件：盐析NaCl质量分数为5.1%，pH=10.7，盐 析时间为120h，收率达到 0.378%，酶活力达到 13700 U/mg。 关键词：盐析法；溶菌酶；酶活力 中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2017）05-083-04 _________________________ 收稿日期：2017-04-25 基金项目：广东海洋大学团队项目（项目编号：C13435）, 大学生创新创业项目（项目编号：CXXL2016152）。 作者简介：黄赞良，广东海洋大学，制药工程专业，大学生。 *通讯作者：张兆霞，李泳，广东海洋大学教师，从事生物酶相关方面的科研工作。