皂苷测定方法

1 三萜皂苷

三萜皂苷主要分布在植物界的石竹科、桔梗科、五加科、豆科中。桔梗、南沙参、党参、人参、三七、瞿麦、甘草、远志、紫菀、地榆等许多中草药都含有此类皂苷。不同的中草药其三萜皂苷的皂苷元或活性成分不同，比如人参皂苷的皂苷元为人参皂苷Rg1、Re 和Rb[9]；女贞子中三萜皂苷的皂苷元为齐墩果酸[10]。三萜皂苷的定量测定方法主要有比色法、薄层色谱法、高效液相色谱－紫外检测器法、高效液相色谱－二极管阵列检测器法。

1.1 比色法

比色法的原理是：三萜皂苷分子中缺少发色团和助色基，需要某种试剂与其反应形成发色基团后显色，在某个波长下测定其吸光度，再根据吸光度与浓度的关系（标准曲线），计算出样品的浓度，从而计算出样品中总皂苷的含量。常见的显色剂有香草醛－冰醋酸溶液和高氯酸体系或浓硫酸。比如徐睿庸等人利用分光光度法测定青钱柳叶中总三萜皂苷的含量，所采用的显色剂就是0.3mL的50g/L 香草醛一冰醋酸与0.6mL 的高氯酸。在显色剂与样品中的三萜皂苷反应后，80℃水浴10min，在波长550nm 处测定青钱柳叶中总三萜皂苷的吸光度，从而计算出含量。其化学反应原理是：强酸使羟基脱水而使其双键数目增加，又经双键位移后与显色剂缩合等反应形成共轭结构，最后在酸作用下形成碳正离子盐而显色[11]。而杨文志等人则认为显色机理是因为皂苷元中C3 和C12上的羟基与香草醛上的醛基发生反应，形成缩醛，成为新的共轭体系而显色[12]。孔燕君则采用浓硫酸作为显色剂，分别测定了人参、三七和男壮胶囊中三萜皂苷的含量。他认为人参皂苷分子上的糖基能被浓硫酸氧化脱水成糠醛衍生物，在60℃水浴2h 后在322nm 处有紫外吸收，测其吸光度，进而计算出人参、三七和男壮胶囊中的三萜皂苷含量[13] [14]。

1.2 薄层扫描法

傅强等人依据五加科植物人参三萜皂苷中人参皂苷Rg1 在薄层板上分离效果较好和荧光分光光度法高灵敏度的特点，建立了薄层色谱-荧光分光光度法测定人参中人参皂苷Rg1 薄层色谱法。展开剂为氯仿：醋酸乙酯：甲醇：水＝16∶2∶11∶12 的下层液体，显色剂为10的硫酸乙醇溶液，喷雾显色，95℃水浴中加热5min，在双波长薄层扫描仪下扫描，激发波长Ex=320nm，发射波长Em=400nm。实验表明：薄层色谱显色是定量的关键，用10%硫酸乙醇溶液喷雾显色要均匀，否则定量洗脱后测定荧光强度值有较大差异。在105℃加热5min，效果良好[15]。

1.3 高效液相色谱法

近年来，随着高效液相色谱仪的普及，越来越多的皂苷成分开始使用到了这项技术。由于它能有效处理非挥发性和极性较强的化合物，可以较好分离出主成分峰和杂质峰，能反映样品的真实含量，方法简便、准确、灵敏有利于产品质量的控制，从而使它成为了测定皂苷的一种最有效最常用的方法，但HPLC 仪器昂贵，而且要求有对照品。

1.3.1 高效液相色谱－紫外检测器法

该方法是HPLC 中测定有紫外吸收的皂苷常用方法，广泛应用于三萜皂苷如人参皂苷、女贞子中齐墩果酸含量的测定中。紫外检测器由于对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗，但它非通用检测器，它要求被测物质有较强的紫外吸收或本身无紫外吸收但转化后有吸收紫外线的基团。战佩英等人使用岛津高效液相色谱仪－紫外检测器（SPD-10A UV-V IS）工作站对女贞子药材中的齐墩果酸进行了含量测定。色谱条件是：C18 色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-0.05%乙酸胺水溶液(86：14)；流速：0.8mL /min；检测波长：220nm；柱温25℃[10]。

1.3.2 高效液相色谱－二极管阵列检测器法

戚志华等人采用600 高效液相色谱仪－2996 二极管阵列检测器对不同产地、不同生长期的女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量进行了测定。其实验色谱条件如下：色谱柱：Lichrospher

C18(250mm×416mm，5μm)；流动相：乙腈-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50∶30∶20∶0；流速：1mL·min-1；检测波长：205nm；柱温：室温；进样量：20μL[16]。Fang LIU 等人对绞骨蓝皂苷的高效液相色谱技术进行了研究。他们认为，皂苷的紫外吸收较弱，紫外检测器

设置的最大吸收波长一般在203nm 左右，在这个波长范围内，黄酮和色素等杂质也有紫外吸收，从而带来杂峰。因此，他们选用了二极管阵列检测器作为检测工具[17]。其色谱条件是：Agilent 1100 系列工作站，G1315A二极管阵列检测器，AlltimaC18 柱(4.6mm×250mm，5mm)，流动相：水：乙腈梯度洗脱（5—100%），流速0.8ml/min，波长203nm，进样量20ml。Muhammad K.Saeed 等人对中国粗榧提取物进行了高效液相色谱分析，他们为了获得尽可能多的可检测到的强峰，而选用了二极管阵列检测器，这样一来，所有峰的光谱就都可以被检测显示出来。他们的色谱条件是：HPLC Elite P230 系列工作站，二极管阵列检测器(DAD-230)，Kromasil C18 柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相是水-乙腈(1：1)，5～40min 内线性洗脱，流速0.7ml/min，波长254nm，进样量10μl[18]。二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。和普通的紫外—可见分光检测器相比，二极管阵列检测器进入流动池的光不再是单色光。它具有以下优点：⑴可极为方便地得任意波长的色谱图；⑵可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用；⑶提供组分的定性信息。也就是说，二极管阵列检测器不仅可用于定量检测，还具有辅助定性、峰纯度评估等功能，可得到立体的光谱-色谱图，对有特征紫外吸收的化合物的定性很有帮助。

1.3.3 高效液相色谱－蒸发光散射检测器法

蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector，ELSD) 是一种基于溶质的光散射性质的通用检测器，由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。流动相由热气流使之热气化喷雾，再进入加热管，溶剂在加热管中挥发。被分析检测的物质颗粒通过一束狭窄的散射光由光电倍增管收集，色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。ELSD 的响应取决于被分析的质粒的数量和大小，而不依赖于被测物的光学特性。ELSD 可消除因温度变化引起的基线漂移，即使是在梯度洗脱时也能提供平稳的基线。和紫外检测器相比，它排除了用UV 检测器时的溶剂干扰，大大地提高了分离效果。和二极管阵列检测器相比，蒸发光散射检测器基线噪音小，不受梯度影响，能够获得较好的峰形，且仅对不挥发被分析物质产生响应，因此杂质峰较少。和示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比，高灵敏度比RID 高二个数量级，且与梯度洗脱兼容。对无紫外吸收或仅有紫外末端吸收的物质如糖类、皂苷类，蒸发光散射检测器具有良好的稳定性，较高的灵敏度和重现性。因此，越来越多的中草药中皂苷类成分的测定使用到了蒸发光散射检测器。王举涛等人用高效液相色谱－蒸发光散射检测器法对常用中药黄芪中的功效成分黄芪甲苷进行了含量测定。由于黄芪甲苷仅在200 nm 处有弱的末端吸收，因而操作条件十分严格，噪音对结果影响较大，灵敏度也较差；如果用柱前衍生化高效液相色谱－紫外检测器进行测定，虽可克服黄芪甲苷仅在200nm 处有弱的末端吸收的弱点，但试验结果表明操作繁琐，重现性差。而高效液相色谱－蒸发光散射检测器进行测定黄芪甲苷，不受流动相溶剂的干扰，不要求被检测组分特定的化学结构，亦可用于不挥发性成分的检测。试验结果表明分离度好、干扰少、前处理简便。灵敏度、稳定性及重现性均符合含量测定要求。其色谱条件如下：色谱柱：ODS 柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈-水(40∶60)，流速：1.0ml/min；漂移管温度：105℃，载气流速为2.8 L/min[19]。

2 甾体皂苷

甾体皂苷主要存在于薯蓣科、百合科植物中，如各种薯蓣、七叶一枝花、土茯苓、知母、麦

冬等。甾式皂苷因可作为合成甾体激素的原料而有重要意义。不同的中草药其甾体皂苷的皂苷元或活性成分不同，比如知母、天冬中甾体皂苷的皂苷元主要为菝葜皂苷元[20] [21]；黄姜或盾叶薯蓣中甾体皂苷的主要皂苷元则为薯蓣皂苷元[22] [23]。甾体皂苷的定量测定方法主要有比色法、高效液相色谱－示差折光检测器法、高效液相色谱－蒸发光散射检测器法。

2.1 比色法

比色法测定甾体皂苷的含量其原理同三萜皂苷相同，但因其化学结构与三萜皂苷不同，故所选用的显色剂不同。一般来说，测定总甾体皂苷的显色剂是浓硫酸或香草醛－冰乙酸溶液和高氯酸。薛小娟等人利用知母中菝葜皂苷元能与浓硫酸发生显色反应的原理，通过测定总皂苷水解产物中菝葜皂苷元的含量来测定知母总皂昔含量[24]。李敏等人在测定天冬中总皂苷含量时，对不同的显色剂；①0.2ml 香草醛－冰醋酸和0.8ml 高氯酸；②8%香草醛－乙醇液和77%硫酸；③高氯酸；④94%硫酸进行了比较，发现高氯酸的显色效果较好[21]。总的来说，比色法的特点是：①方法灵敏，但显色试剂的专属性较差，通常用于总皂苷的测定；

②要求有特定的显色剂；③要选择合适的对照品。

2.2 高效液相色谱法－二极管阵列检测器法

都述虎等人通过采用waters 高效液相色谱仪和996二极管阵列检测器(DAD)对穿龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元含量进行测定，建立了反相高效液相色谱法测定穿龙薯蓣总皂苷中薯蓣皂苷元的含量的方法[25]。色谱条件如下：Bondapak C18 柱，甲醇为流动相，流速1.0ml ／min，检测波长208nm。刘中博等人同样采用高效液相色谱仪，2996 型和二级管阵列检测器，对薯蓣属植物有效成分甾体皂苷中的原薯蓣皂苷进行了定，该方法不仅灵敏度高、专属性强、操作简单易行，而且将质量控制与活性成分相结合。色谱条件如下：色谱柱为XterraTM ODS(250mm×416mm，5μm)，以乙腈-水(27：73)为流动相，体积流量110mL ／min，柱温35℃，检测波长203nm[26]。

2.3 高效液相色谱－示差折光检测器法

示差折光检测器（differential refractometers detector，RID）是除紫外检测器之外应用最多的检测器。其优点是通用性强，操作简便；缺点是灵敏度低，最小检测浓度达10-6 ～10-7g/mL，不能做痕量分析，线性范围宽小于105，对压力和温度变化敏感，此外，由于洗脱液组成的变化会使折射率变化很大，因此，这种检测器也不适用于梯度洗脱。牛伟等人对采用反相高效液相色谱－示差折光检测器对蒺藜全草和果实中的甾体皂苷元海柯皂苷元、替告皂苷元进行了定量比较的初探。色谱条件如下：色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)。流动相是甲醇；检测器：示差折光检测器(设置)：灵敏度≥0.2min(4s)，样品池温度：35℃。紫外检测器(设置)：灵敏度>=0.1min(2s)，检测波长：209nm；柱温：室温(28.1℃)；流速：1mL/min；分析时间：12min；进样量：10μL[27]。由于甾体皂苷元无紫外吸收或紫外吸收较弱且主要存在于低波区，给HPLC 定量检测带来了一定的困难。而示差折光检测器属于总体性能检测器，是根据不同物质具有不同折射率来进行组分检测的，凡是具有与流动相折射率不同的组分，均可以使用这种检测器，因此是一种通用型检测器，它对没有紫外吸收的物质，如高分子化合物，糖类，某些皂苷等都能检测。

2.4 高效液相色谱－蒸发光散射检测器法

和三萜皂苷的测定相比，高效液相色谱－蒸发光散射检测器法更多地应用在了甾体皂苷的测定中。吴弢等人采用Shimadzu 210A T 高效液相色谱仪和Alltech ELSD500 型检测器对湖北麦冬中主要皂苷的含量进行了测定，色谱条件如下：气化温度93.18℃，气体流速(N2)2.47 SL PM；色谱柱：A lltech V erspapack C18(416mm×250mm)；流速：2mm／min。流动相：乙腈-四氢呋喃-水(45.6∶2.9∶51.5)；流速：0.7mL ／min[28]。唐晓清等人利用HPLC－EL SD 法对麦冬中鲁斯可皂苷元和薯蓣皂苷元进行了分离分析，测定了麦冬中鲁斯

可皂苷元的含量。由于鲁斯可皂苷元为甾体皂苷元，本身没有紫外吸收，且麦冬中糖类含

量较多，故选用EL SD检测器对无紫外吸收的甾体皂苷元的测定具有良好的稳定性，较高的灵敏度和重现性，色谱条件如下：色谱柱：Alltech V ersapark C18(4.6mm×250mm，10μm)；流动相：甲醇-水(88∶12)；流速：1.0ml ／min。平均回收率为98.22%(n=5)，R SD=1.54%，流动相能很好地将鲁斯可皂苷元和薯蓣皂苷元分离，且排除了其它成分的干扰[29]。此外，刘彤焱[30]、祁海宏[31]、成旭东[32]等人分别采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器法对通光藤和蒺藜中的皂苷进行了测定，方法简便，重复性好，结果稳定，均取得了较好的结果。

3 总结

中草药的皂苷成分千差万别，测定方法也因类而宜，每一种方法都有其局限性。总体上来说，紫外分光光度法、高效液相色谱法仍然是测定皂苷类物质的主要方法。通过超声波、大孔吸附树脂、超临界CO2反相微乳萃取、溶剂萃取等手段去除杂质，使皂苷溶解于非极性溶液中后，再测定皂苷的含量是最常见的步骤。一般来讲，紫外分光光度法测定的是总皂苷，涉及到对照品的选择。在没有单体标准品的情况下，选择皂苷元作为对照品或近似类皂苷单体作为对照品；有单体标准品的情况下，选择单体标准品作为对照品；同时有皂苷元

和单体标准品的情况下，优先选择单体标准品作为对照品。对于显色反应来说，显色过程受显色剂种类、浓度、水浴时间、加热温度、放置时间的影响。由于比色法所显颜色随温度和时间的变化而变化，因此采用比色法时须严格控制条件，尽量排除干扰。对HPLC 法来说，分离柱多采用C18 反相柱；检测器则需要因实验室条件和皂苷本身的性质而定。对一些无紫外特征吸收，无法使用紫外检测器检测的皂苷如薯蓣皂苷则应该使用蒸发光散射ELSD 检测器，优点是无需显色，雾化温度低，检测不受外部环境的干扰，其信号响

应与被测物的质量成正比而不依赖于被测物的光学特性，是一种检测甾体皂苷含量的有效方法，但应注意气流量和漂移管温度的调节。除上述这二种方法外，薄层扫描和毛细管电泳在皂苷的测定中也有应用。薄层扫描操作简便，可用于测定单一皂苷的含量，但需要标准品或对照品。毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、样品和试剂消耗量少等优点，

常用来测定中药制剂中的皂苷含量。我国植物种类丰富，皂苷种类也多种多样。一些鲜见

的皂苷如斑鸠菊属的甾体皂苷[33]、匙羹藤中的三萜皂苷[34]、毛莨科银莲花属复伞银莲花富含的三萜皂苷[35]等单体成分复杂，对其含量分析至今还是空白。未来在这一领域的

研究还需要进一步加强，以充分挖掘其在保健食品、药品等方面的可利用性。