质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析
质粒, 解析
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涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？
参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常?
参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：
1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！
【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：
1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】
未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
参考见解：
1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多
次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。
细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？
参考见解：
1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。
为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？
溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：
1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。
2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．
3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。
4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。
加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？
裂解不完全,参考见解：
1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？
2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。
抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？
参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？
参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），
同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？
乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III 配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。
使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开?
参考见解：
1、确认酶的有效性。
2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3、是否不小心吸入了痕量的酚。
4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。
碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？
参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
提取质粒中RNA没有去除？
可能是RNase失效或效率不高。参考见解：
1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的
2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。
提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？
参考见解：
1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切。
4、 NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。
用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒
DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？
参考见解：
1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。
2、确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。
3、也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。
4、没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染；
5、在没有进行酶切时,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带,这样可以先排除核酸提取的问题. 若是没有酶切时间
过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。
用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少（含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落）大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么？
参考见解：
1、做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。
2、拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.
3、提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。
培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？
参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素
市场常见痛点分析及解决方案
【我问大家几个问题】 1、现在如果有人给你推销产品，说他的产品能解决你的某些问题，效果如何如何好，你会轻易相信或购买，还是只是听听而已？ 2、现在如果有人给你推销项目，说他的项目如何高大上，如何有实力，如何能赚钱，你会马上表现出兴趣、用心去了解，还是几乎不放在心上？ 3、如果别人在群里发项目和产品的广告，或给你发产品或项目广告，或疯狂刷朋友圈，你会认真看，并回复别人表现出兴趣，还是只是扫一眼就过了？ 4、你有很好的产品或项目，现在在网上加陌生人微信，主动去打招呼，想先聊天、熟悉，再分享；有几个人会回复你呢？ 5、你好不容易推荐了几个伙伴，几个月之后，特别是过完这个春节，有几个人在行动呢？ 我想每一个真正用心做过市场的人，在心里面一定已经有了自己的答案。 这些的确是当下困扰在每一个互联网追梦者的难题。
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因为，每个人每天在微信群看到最多的就是吹嘘的广告；每个人的朋友圈最多的就是刷圈卖货的。 开始的时候还觉得新鲜，现在已经麻木；就算你是真好，别人也无法分辨。 每天那么多广告。关键是如何让客户认真看完你的，而且表现出兴趣。 这些就是我们要解决的问题。 如果你已经有了有效的方法，那么我恭喜你，因为你一定会大成功。 如果，还在找方法，那就是我们要讲的。 3、找陌生人聊天越来越难。 想做大事业就一定要开拓陌生市场。 熟人有限，而且往往越是熟人越不相信我们，越是退避三舍。 但是，我们现在明显感觉找陌生人聊天比以前难多了。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
资本市场：常见问题
第9单元资本市场 常见问题 1.与货币市场相比，资本市场的特点及功能有哪些？ 与货币市场进行短期的资金融通相比，资本市场更具有长期投资性，其特点、功能如下： 资本市场的四个特点：第一，交易工具的期限长。中长期债券的期限都在一年以上。第二，筹资目的是满足投资性资金需要，具有很强的投资性。第三，筹资和交易的规模大。第四，二级投资交易的收益具有不确定性。 资本市场的三个功能：第一，资本市场是筹资与投资平台，第二，资本市场是资源有效配置的场所，第三，资本市场能够促进购并与重组。 2.简要介绍资本市场投资分析的主要内容及方法。 在证券投资中为规避风险、获取最大收益，需要对证券投资进行全面分析，投资分析的内容主要包括基本面分析和技术分析。 基本面分析包括四个主要内容：第一，宏观经济周期性运行与证券市场分析，第二，宏观经济政策与证券市场分析，第三，产业生命周期与证券行市分析，第四，公司状况与证券行市分析。 技术分析从不同的角度对市场行为进行分析，寻找和发现其中不直接显露的实质内容，是进行技术分析最基本的出发点。由于侧重点和观测角度不同，技术分析的研究方法也就不同。 按照目前市场流行的说法，技术分析方法大致可以分为技术指标法、切线法、形态法、K线法、波浪法和周期法等六种。 3.资本市场国际化的定义是什么，如何衡量一国资本市场的国际化程度？ 资本市场国际化，指的是资本市场活动在全球范围内进行，资本可以在市场中自由流入或者流出。 衡量一个市场国际化程度的高低，主要可从三个方面进行： （1）市场进入的限制。一般来说，市场准入限制越多，市场的国际化程度越低。 （2）市场机构与品种的丰富程度。金融产品的创新依托一个开放的市场，反映全球不同类型融资者和投资者的偏好。一般来说，市场机构和品种越丰富，国际化程度越高。
公文写作常见问题分析
一、标题常见问题分析 公文标题是公文内容的摄要，在发挥公文效能上起着举足轻重的作用。但受诸多因素的影响，公文标题时常出现一些毛病，现归纳为以下八个方面，并作粗浅分析。 （一）要素不全 完整的、规范的公文标题，一般应具备“三要素”，即发文机关名称、事由、文种，以标明由谁发文、为什么发文和用什文种发文。2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》作出明确规定：“公文标题应当准确简要地概括公文的主要内容（事由）并标明公文种类（文种），一般应当标明发文机关”。当然，特殊情况下，也可省略标题中的一至二个要素，但不可随意省略，要相对规范，否则，将毛病百出。 常见的病例有三种： 一是随意省略事由。如《××县人民政府决定》，由于省略事由，受文者看不出标题所反映的主要内容、事项和基本观点，不利于学习、贯彻、领会、落实文件精神。除一些非重要的、极其简短的通知、通告和特殊机关发出的特定公文外（如中华人民共和国国务院、司法部门发出的国务院“公告”、“主席令”、“布告”等），一般情况下不得省略事由。 二是随意省略发文机关。如：一份没有版头的文件标题《关于加强农村党支部建设的报告》，待上级看完文件后，才从落款处知道文件是哪个机关发出的，既不庄重，也不严肃，更不利于公文运转和办理。具有重大决策和事项的下行文不得省略发文机关；没有版头的下行文、上行文均不得省略发文机关，但有版头（发文机关标识）的，也可不标明发文机关。 三是随意省略文种。使受文者不得要领，失去公文的严肃性。如《××乡人民政府关于召开春耕生产会议的有关事宜》。 （二）乱用文种 主要表现在三个方面：
一是混用文种。如《全国人大常委会党组关于县乡换届选举问题的请示报告》，这里把“请示”、“报告”两个不同的文种混淆在一起使用，不论是已经废止的《国家行政机关公文处理办法》，还是自2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》，都没有“请示报告”这一文种，明显不妥。从该“请示报告”的内容看，应使用批转式“报告”这一文种。 二是错用文种。有的该用“请示”的，却用了“报告”，而该用“报告”的反而用的是“请示”；有的该用“函”的却用“通知”；有的把没列为文种的公文种类作为文种使用，如“条例”、“规定”、“办法”、“总结”、“计划”等，以上这些，都不可作为文种使用，不可直接行文。《党政机关公文处理工作条例》所确定的公文文种共有15种，决议、决定、命令（令）、公报、公告、通告、意见、通知、通报、报告、请示、批复、议案、函、纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为“印发”、“颁发”或“通知”的“附件”行文。 三是生造文种。如《关于调整工资的补充说明》、《关于机构改革中有关问题的解释》等，这里的“补充说明”、“解释”均不应作为文种使用，以上两个标题可修定为《××（发文机关）关于印发调整工资补充说明的通知》、《××（发文机关）关于印发机构改革中有关问题解释的通知》。还有的把“安排”、“要点”、“细则”这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，是错误的。 （三）隶属不清 不该用“批转”的，用了“批转”；该用“批转”的却用了“印发”、“转发”，分不清三者之间的隶属关系和词性。如《××县政府办公室关于批转××市长在××会议上讲话的通知》，这里的“批转”使用不当，应该使用“印发”或“转发”。因为“批转”具有“批准转发”之意，是上级对下级报告的认同并转发下去贯彻落实的。下级对上级机关的文件和上级领导同志的讲话、批示等不可使用“批转”，否则将混淆了上下级的隶属关系。 （四）提炼不精。主要表现在标题冗长上。如《×××（发文机关）关于招收退休退职职工子女就业，进行合理安
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过 对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。 其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。 为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。 实验方案 编号具体方案 号高拷贝质粒的大肠杆菌1 2号号染杂菌的大肠杆菌3 4号全为杂菌（酵母菌）号 5．6号 实验步骤 根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。 实验结果 （一）Buffer II裂解不完全
后溶液变粘稠的澄清液体；而部分BufferII2号为正常的大肠杆菌加入如上图所示1、号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊、64号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5染菌的细菌3、液体。时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变Buffer II 在加入号正常的革兰氏阴性细2等细胞内容物。对于1、性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的DNAII溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒菌，Buffer 溶液能号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II澄清液体，而3、4的细胞壁却不能破裂，真菌）溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、5、6号都为杂菌，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。 （二）拷贝数降低或质粒丢 失． 图2
快消品市场常见问题解析
飘窜货分为哪几种 如何有效避免市场飘窜货问题的发生 发生窜货的原因有哪些 飘窜货危害有哪些 邻近区域向自己负责区域恶意窜货，如何处理 淡季怎么能做好市场，有哪些方法 面对竞品的强势铺市率和高排面，你如何突围 区域里有不听你管理的客户，应如何管控 市场开发应注意哪些方面 你怎么看待促销 如何获取可靠的竞品信息 产品在市场上出现质量问题，如何应对 促销过程中存在恶意截留现象，如何处理 产品上架后卖不动的原因 新品上市要点有哪些 如何看待商场低价销售行为，怎样控制 如何打造有效的口碑效应 如何成为客户心目中的首选资源 如何用“客户不满意调查”对客户进行细分 如何有效防止促销费用被截留 旺季前压仓行动应注意哪些 即期产品和过期产品怎么处理，市场有哪些渠道 分品项操作有何好处 新产品的开发程序 新产品开发的意义 1．飘窜货分为哪几种 答： 1) 恶性窜货：即经销商为牟取利润，故意向非辖区倾销货物； 2) 自然窜货：一般发生在辖区临界处或物流过程中，非经销商故意所为； 3) 良性窜货：经销商的流通性很强，货物经常流向非目标市场和空白市场。2．如何有效避免市场飘窜货问题的发生
1)、将发往不同市场的产品打上不同区域编码； 2)、要求经销商缴纳市场保证金； 3)、实行级差价格体系，保证渠道每个环节都有合理的利润空间；4)、控制促销全程，防止促销过后留下降价后遗症； 5)、明确经销、代理合同双方的权利义务，确保客户遵守合同； 6)、设立市场督查，建立市场巡查员工作制度； 7)、建立严格的惩罚制度 3．发生窜货的原因有哪些 答： 1)、为多拿企业提供的“返利”，抢占市场； 2)、市场发育不均衡，某些市场趋向饱和，供求关系失衡； 3)、供货商给予中间商的优惠政策不同； 4)、供应商对中间商的销货情况把握不准； 5)、辖区销货不畅，造成积压，厂家不退货，经销商只好拿到畅销市场上去销售； 6)、运输成本不同； 7)、厂家规定的销售任务过高，经销商为了完成任务而去窜货； 8)、市场报复，目的是恶意破坏对方市场，往往发生在厂家更换客户阶段。 4．飘窜货危害有哪些 答： 1)、一旦价格出现混乱，中间商的利益将会受损，这将导致中间商对厂家产生不信任感，对经销其产品失去信心，甚至拒售； 2)、损害品牌形象，使先期投入无法取得足够的回报； 3)、竞争品牌会乘虚而入，甚至会取而代之； 4)、产品各级利润较低，其生命周期缩短。 5．邻近区域向自己负责区域恶意窜货，如何处理 答： 1)、进行实地调查，找到恶意窜货证据； 2)、与邻近区域销售的区域经理联系，表明他区域的恶意窜货对自己负责区域造成的危害及
公文常见错误分析及对策
公文常见错误分析及对策 公文写作 公文常见错误分析及对策 公文是公务文书的简称，是处理公务、管理事务的一种书面文字工具。其重要特点就是行文的规范化、制度化和标准化。对于公文格式，国家技术监督局制定了《国家行政机关公文格式》（GB/T9704—1999，以下简称《格式》），国务院办公厅制定了《国家行政机关公文处理办法》（2001年1月1日起施行，以下简称《办法》），中央办公厅制定了《中国共产党各级领导机关文件处理条例（试行）》（以下简称《条例》）。但是不少单位和部门制发文件，并没有严格按照规定、要求去做，而是各行其是，制发文件存在很大的随意性，造成公文格式的不规范，严重影响了公文的严肃性、公正性。更在一定程度上影响了公文的质量和效能，影响了政 府的行政效率，因此必须引起高度重视。 一、存在的问题 （一）文种使用乱。一是生造文种。把没列为文种的公文种类作为文种使用。《办法》所确定的公文文种共有13类14种，即：命名、令，决定，公告，通告，通知，通报，议案，报告，请示，批复，意见，函，会议纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为"印发"、"颁发"式"通知"的"附件"行文。例如，《关于××市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定》、《关于使用社会保障卡有关问题的说明》等，这里的"操作规定"、"说明"均不应作为文种使用，可以改成《××关于印发市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定的通知》、《××关于印发使用社会保障卡有关问题的说明的通知》，不能作为文种使用的还有"条例"、"规定"、"办法"、"总结"、"计划"等，有的甚至把"安排"、"要点"、"细则"这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，都是错误的。
质粒提取注意事项
1. 质粒制备的基本原理是什么？ 答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。 2. 质粒DNA 制备的关键是什么？ 答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。 3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？ 答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。 4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？ 答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。 5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？ 答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因
市场监督管理局网上注册常见问题解答
常见问题解答 1、哪些登记注册业务可以通过网上注册办理？ 答：名称预先核准、调整、延期、注销；有限公司、股份公司、非公司企业法人、合伙企业（不含外商投资合伙企业）、个人独资企业、农民专业合作社、外商投资企业、外商投资合伙企业及其分支机构的设立、变更（备案）、注销；企业集团、外国（地区）企业常驻代表机构、外国（地区）企业生产经营机构的设立、变更（备案）、注销。 2、如何在网上进行名称申请？ 答：第一步、申请人登录深圳市市场监督管理局门户网站，点击“进入网站主页”，选择“网上办事”栏目中的“企业名称预先核准”，输入用户名和密码进入网上注册系统（首次登陆网上注册系统需先注册用户），选择“名称业务”，按系统提示提交名称预先核准申请。第二步、于回复日网上查询审核结果，打印《名称预先核准通知书》和《名称预先核准申请书》。 3、如何在网上进行设立申请？ 答：第一步、网上申请名称预先核准（不需要名称核准的企业类型省略这一步）；第二步，填报设立申请信息，提交申请；第三步、预约递交书式材料时间和登记部门，下载/打印《网上设立申请预受理通知书》；第四步、到登记窗口现场递交书式申请材料；第五步、凭《准予登记通知书》于回复日领照。 1、网上申请查询字号程序和传统方式有什么不同？ 答：企业申请人可直接通过网上注册系统查询字号（仅限可用字号）后在网上申请名称预先核准。 2、通过网上注册申请后，多长时间可以领到营业执照？ 答：名称预先核准申请网上直接审核，时限为2个工作日内，网上直接发放《名称预先核准通知书》；设立申请的，在窗口递交材料后，3个工作日内发给《企业法人营业执照》。不含网上申请或者递交材料当天。 3、网上申请有名额限制吗？ 答：没有。但是每一个帐号同时只能存在两条名称业务待审核的申请，其他业务没有限制。 4、网上注册是否可以任意选择预约时间？ 答：企业申请人可自主预约次日至10个工作日内的现场办事时间；自成功提交申请后两个月内未到窗口办理的，申请将自动作废，须重新提交申请。 5、网上注册公司办理名称预先核准，如果要注销，该如何办理？
公文写作常见问题
公文写作的基础知识与常见问题分析 公文的分类 按其行文方向，可分为上行文、下行文、平行文。 按其时限要求，可分为特急公文、急办公文、常规公文 按其时限要求，可分为绝密公文、机密公文、秘密公文、普通公文。 常用公文文种 我国现行党和各级领导机关使用的文件有14个： 决议、决定、指示、意见、通知、通报、公报、报告、请示、批复、条例、规定、函、会议纪要。 国家行政机关使用的公文种类有13个: 命令（令）、决定、公告、通告、通知、通报、议案、报告、请示、批复、意见、函、会议纪要。 上述文件共27个，其中9个是相同的，即：决定、意见、通知、通报、请示、报告、批复、函、会议纪要； 不同的有9个，其中属党的机关的有5个，即：公报、指示、决议、条例、规定；属国家行政机关的有4个，即：命令（令）、议案、通告、公告。由于这18个文件是党和国家在公文管理法规中明确规定的，一般称为法定文种。 公司常用的主要公文种类
1.决定:适用于公司对重要事项或者重大行动做出安排，如机构设立与撤销；变更或撤销公司不适当决定。 2.通报:传达重要精神或者通报有关重要情况，也适用于对全系统各单位或个人的表彰与批评。 表彰通报：介绍先进事迹＋先进事迹意义＋表彰决定＋希望号召批评通报：错误事实＋错误性质分析＋惩罚措施＋提出希望要求情况通报：缘由目的＋情况信息＋希望要求 3.请示:适用于下级向上级的请求指示和批准；也适用于分公司必须以公文形式向总公司的请求指示和批准。 应用范围 （1）遇到问题无法解决，需要上级指示； （2）处理较为重要的事件和问题，要上报批准； （3）遇到问题，虽有解决方法，但没有权力或能力实施，需要上级帮助； （4）对有关方针、政策和上级发布指示有疑问，要上级解答； （5）下级机关之间在重要问题上出现意见分岐，要上级仲裁； （6）请上级领导参加活动，指导工作。 注意事项 （1）主送机关只能有一个，如需同时送其他机关，应当用抄送的形式； （2）只能主送上级机关，不能送领导者本人；
公文写作常见错误案例分析
公文写作中常见的错误 1.×市×区区属图书馆为办好图书事业，满足该区群众读书的要求，特向区政府请示增加经费，并将该请示抄送该区人事局、劳动局、物价局、财政局。 错误。抄送单位应当是与该请示事项有关的单位。“人事局、劳动局、物价局”与区图书馆申请经费无关，不应将该请示抄送给他们。 2.某县人事局向县直属各单位下发年终考核工作通知，抄报于该县政府办公室 正确。根据《国家行政机关处理办法》有关规定，向下级机关的重要行文，应抄报上级机关，目的是为了让上级了解情况，避免出现工作中的被动情况。 3.×省×市×区区属瓷器厂因税务问题受到该区税务所的处罚，该厂认为处罚不符合国家税法，特向市税务局申诉，并同时向×省税务厅申诉，并抄报于×市政府、×区政府。 错误。主送单位应当是一个，同时主送，搞乱了行文关系。抄送单位应当是与该申诉事项有关的单位。“×市政府、×区人民政府”，与税务申诉事项无关，不应将该申诉抄送给他们。 4.某县农林局写例行报告，一向县政府汇报1995年全年工作，二在报告中请示了1996年增建农机站的事项，三建议对困难地区减
免乡政府提留费用。 错误。报告中不能夹带请示，且应“一文一事”。 5.×市×工业总公司因市属重点企业×××电器厂因领导班子个别人贪污犯罪，准备调整该厂领导班子，特向市政府请示。并将该请示抄送于该厂办公室。 错误。请示不能抄送下级机关。 6.×市纪检委员会将1997年纪检情况通报于市各直属机关和各局。 正确。该通报属于情况通报，为知照类文件，可以有多个主送机关。 7.中共××市委与市委宣传部就学习贯彻中共第十七次代表大会精神，建设有特色的社会主义联合向下发出通知。 错误。为了维护文件的权威性和法定效用，联合行文的单位应当是同级单位。 8.×市×区职工大学是受区政府和市成人教育局双重领导的单位。该职工大学就1994年需增加教育经费一事，特向两个上级机关请示。 错误。请示只能够有一个主送机关；若是双重领导机关，则需要
市场调查报告常见问题
市场调查报告常见问题 市场调查报告常见问题有哪些？ 1、市场调查报告主要是用于面向企业、投资者、风险投资机构、资金申请评审机构申请资金或者融资。 2、市场调查报告也可以作为您团队建设与项目执行的指导方案。 3、市场调查报告重点是论证项目的市场价值、商业模式的可行性、实施方案的可操作性、团队的执行力、项目的投入产出预期。 4、优秀的市场调查报告不在于文字多少，而在于抓住项目精华，以合适的文字图表和图形展示项目投资价值。市场调查报告传递的信息、理念、创新思维、独到的盈利模式等是其价值所在。 5、市场调查报告需要重点分析历史财务数据、管理运营情况、整个企业市场现状、未来拟投资项目带来的价值增长和投资需求，投资项目可以是多个或者仅用于补充流动资金，财务评价要考虑历史数据及财务制度的延续性。 市场调查报告特点 行业环境分析： 行业环境是对企业影响最直接、作用最大的外部环境。 行业结构分析： 行业结构分析主要涉及到行业的资本结构、市场结构等内容。一般来说，主要是行业进入障碍和行业内竞争程度的分析。 行业市场分析： 主要内容涉及行业市场需求的性质、要求及其发展变化，行业的市场容量，行业的分销通路模式、销售方式等。 行业组织分析： 主要研究行业对企业生存状况的要求及现实反映，主要内容有：企业内的关联性，行业内专业化、一体化程度，规模经济水平，组织变化状况等。 行业成长性分析： 是指分析行业所处的成长阶段和发展方向。
当然，这些内容还只是常规分析中的一部分，而在这些分析中，还有不少一般内容和 特定内容。例如，在行业分析中，一般应动态地进行行业生命周期的分析，尤其是结合行 业周期的变化来看公司市场销售趋势与价值的变动。 行业纵深研究 行业研究分为一般性研究和专业性研究、浅表性研究和纵深研究，只有进行纵深研究 才能真正发现公司的价值形成和来源构成。 进行行业的纵深研究，必须在深入调查的基础上进行大量的基础研究和实证分析。例如，不同行业间的技术传递和转移过程，是直接关系到不同行业的兴衰和转化的过程， 对于这一问题的研究，就是纵深研究的范围。 市场调查报告撰写的五要素 一、详细介绍产品 在市场调查报告中，应提供所有与企业的产品或服务有关的细节，包括企业实施的所 有调查。这些问题包括： 产品正处于什么样的发展阶段？它的独特性怎样？企业分销产品的方法是什么？谁会 使用企业的产品，为什么？产品的生产成本是多少，售价是多少？企业发展新的现代化产 品的计划是什么？把出资者拉到企业的产品或服务中来，这样出资者就会和你一样对产品 有兴趣。在商业计划书中，撰写者应尽量用简单的词语来描述每件事。 商品及其属性的定义对撰写者来说是非常明确的，但其他人却不一定清楚它们的含义。 二、竞争企业的说明 在市场调查报告中，要细致分析竞争对手的情况。 竞争对手都是谁？他们的产品是如何工作的？竞争对手的产品与本企业的产品相比， 有哪些相同点和不同点？竞争对手所采用的营销策略是什么？要明确每个竞争者的销售额，毛利润、收入以及市场份额，然后再讨论你相对于每个竞争者所具有的竞争优势，商业计 划书要使投资者相信，你不仅是行业中的有力竞争者，而且将来还会是确定行业标准的领 先者。 三、营销计划方案 市场调查报告要给投资者提供企业对目标市场的深入分析和理解。要细致分析经济、 地理、职业以及心理等因素对消费者选择购买本企业产品这一行为的影响，以及各个因素 所起的作用。
公文写作常见错误16种
公文写作常见错误16种 一、行文中的常见错误 1、滥发文件。主要表现：（1）所发公文属可发可不发之列；（2）所发公文只是照抄照转上级的公文（翻印即可，不必转发）；（3）所发公文内容空洞，无具体措施，不解决问题；（4）行文所涉及的问题可用口头请示、汇报或开会等形式解决；（5）行文所涉及的内容已在报上全文公布过；（6）在部门之间意见分歧，未经协商取得一致时就行文。 2、行文关系混乱。主要表现：（1）应该党政分开行文的未分开行文；（2）应该一个机关单独行文的搞成几个机关联合行文；（3）该职能部门行文的“升格”为领导机关行文；（4）该领导机关行文的“降格”为职能部门行文。 二、文种使用中的常见错误 1、自制文种。在正式文种之外，随心所欲，生造公文文种并俨然以正式公文行文。常见的有：“请示报告”、“工作思路”、“情况”、“汇报”、“申请”、“郑重声明”等。 2、误用文种。把属于机关其他应用文，特别是事务文书中的文种，误作为正式公文文种使用的情况。常见的有：把计划类文种“要点”、“打算”、“安排”、“设想”等作为公文文种直接使用，如?××市委××××年工作要点?。把属于总结类的文种“小结”、“总结”，以及把属于规章制度类的文种“办法”、“规程”、“须知”、“实施细则”等作为正式文种直接使用。但是，如果将上述应用文用转发或印发通知的形式发布，则是规范用法。如“××市人民政府关于印发市政府1997年工作要点的通知”。 3、混用文种。不按文种的功能和适用范围去选用文种，而造成临近文种相互混用，导致行文关系不清，行文目的不明，行文性质混淆。常见的有：“公告”与“通知”、“决议”与“决定”、“请示”与“报告”、“请示”与“函”混用。主要表现为将通告误用为通知，将通知误用为通告，将请示误用为报告，将报告误用为请示，将“请示”、“报告”合用为“请示报告”，“请示”和“报告”本身是两个文种，将决定误用为决议，将决议误用为决定，将函
质粒提取简介问题分析
质粒提取简介及问题分析 一、导论 (一) 质粒提取的原理： 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾，2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(SDS)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。 (二)细菌的收获和裂解。 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1、大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析 质粒, 解析 本帖引用网址：https://www.360docs.net/doc/6d6008844.html,/thread-29246-1-1.html 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
碱裂解法抽提质粒原理 溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； （溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染） 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸钾/ 2 M醋酸。 溶液I的作用： ①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 ②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 ③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II： 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。 要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。 很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 溶液III 溶液III加入后就会有大量的沉淀，最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。 如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
快消品市场常见问题解析(精华)
飘窜货分为哪几种？ 如何有效避免市场飘窜货问题的发生？ 发生窜货的原因有哪些？ 飘窜货危害有哪些？ 邻近区域向自己负责区域恶意窜货，如何处理？ 淡季怎么能做好市场，有哪些方法？ 面对竞品的强势铺市率和高排面，你如何突围？ 区域里有不听你管理的客户，应如何管控？ 市场开发应注意哪些方面？ 你怎么看待促销？ 如何获取可靠的竞品信息？ 产品在市场上出现质量问题，如何应对？ 促销过程中存在恶意截留现象，如何处理？ 产品上架后卖不动的原因？ 新品上市要点有哪些？ 如何看待商场低价销售行为，怎样控制？ 如何打造有效的口碑效应？ 如何成为客户心目中的首选资源？ 如何用“客户不满意调查”对客户进行细分？ 如何有效防止促销费用被截留？ 旺季前压仓行动应注意哪些？ 即期产品和过期产品怎么处理，市场有哪些渠道？ 分品项操作有何好处？ 新产品的开发程序？ 新产品开发的意义？ 1．飘窜货分为哪几种？ 答： 1) 恶性窜货：即经销商为牟取利润，故意向非辖区倾销货物； 2) 自然窜货：一般发生在辖区临界处或物流过程中，非经销商故意所为； 3) 良性窜货：经销商的流通性很强，货物经常流向非目标市场和空白市场。2．如何有效避免市场飘窜货问题的发生？
1)、将发往不同市场的产品打上不同区域编码； 2)、要求经销商缴纳市场保证金； 3)、实行级差价格体系，保证渠道每个环节都有合理的利润空间；4)、控制促销全程，防止促销过后留下降价后遗症； 5)、明确经销、代理合同双方的权利义务，确保客户遵守合同； 6)、设立市场督查，建立市场巡查员工作制度； 7)、建立严格的惩罚制度 3．发生窜货的原因有哪些？ 答： 1)、为多拿企业提供的“返利”，抢占市场； 2)、市场发育不均衡，某些市场趋向饱和，供求关系失衡； 3)、供货商给予中间商的优惠政策不同； 4)、供应商对中间商的销货情况把握不准； 5)、辖区销货不畅，造成积压，厂家不退货，经销商只好拿到畅销市场上去销售； 6)、运输成本不同； 7)、厂家规定的销售任务过高，经销商为了完成任务而去窜货； 8)、市场报复，目的是恶意破坏对方市场，往往发生在厂家更换客户阶段。 4．飘窜货危害有哪些？ 答： 1)、一旦价格出现混乱，中间商的利益将会受损，这将导致中间商对厂家产生不信任感，对经销其产品失去信心，甚至拒售； 2)、损害品牌形象，使先期投入无法取得足够的回报； 3)、竞争品牌会乘虚而入，甚至会取而代之； 4)、产品各级利润较低，其生命周期缩短。 5．邻近区域向自己负责区域恶意窜货，如何处理？ 答： 1)、进行实地调查，找到恶意窜货证据； 2)、与邻近区域销售的区域经理联系，表明他区域的恶意窜货对自己负责区域造成的危害及