克隆技术
克隆技术
“多莉”的诞生，意味着人类可以利用动物的一个组织细胞，像翻录磁带或复印文件一样，大量生产出相同的生命体，这无疑是基因工程研究领域的一大突破。
人们剪下植物枝条，扦插到土里，不久就会发芽，长出新的植株，这些植株是遗传物质组成完全相同的植株，这就是“克隆”。还有将马铃薯等植物的块茎切成许多小块进行繁殖，由此而长出的后代也是“克隆”。所有这些都是植物的无性繁殖，或称为“克隆”，它非常普遍，几乎每个人都曾见过。
在动物界也有无性繁殖，不过多见于非脊椎动物，如原生动物的分裂繁殖、尾索类动物的出芽生殖等。但对于高级动物，在自然条件下，一般只能进行有性繁殖，所以要使其进行无性繁殖，科学家必须经过一系列复杂的操作程序。在本世纪50年代，科学家成功地无性繁殖出一种两栖动物—非洲爪蟾，揭开了细胞生物学的新篇章。
英国和我国等国在80年代后期先后利用胚胎细胞作为供体，“克隆”出了哺乳动物。到90年代中期，我国已用此种方法“克隆”了老鼠、兔子、山羊、牛、猪5种哺乳动物。
19隆”出一只基因结构与供体完全相同的小羊“多莉”（Dolly），世界舆论为之哗然。“多莉”的特别之处在于它的生命的诞生没有精子的参与。研究人员先将一个绵羊卵细胞中的遗传物质吸出去，使其变成空壳，然后从一只6岁的母羊身上取出一个乳腺细胞，将其中的遗传物质注入卵细胞空壳中。这样就得到了一个含有新的遗传物质但却没有受过精的卵细胞。这一经过改造的卵细胞分裂、增殖形成胚胎，再被植入另一只母羊子宫内，随着母羊的成功分娩，“多莉”来到了世界。
但为什么其它克隆动物并未在世界上产生这样大的影响呢？这是因为其他克隆动物的遗传基因来自胚胎，且都是用胚胎细胞进行的核移植，不能严格地说是“无性繁殖”。另一原因，胚胎细胞本身是通过有性繁殖的，其细胞核中的基因组一半来自父本，一半来自母本。而“多莉”的基因组，全都来自单亲，这才
是真正的无性繁殖。因此，从严格的意义上说，“多莉”是世界上第一个真正克隆出来的哺乳动物。其特点就在于它与为它提供遗传物质的供97年2月23 克隆是人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步。原是英文clone的音译，意为生物体通过细胞进行的无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群，简称为“无性繁殖”。
“克隆”一词于1903年被引入园艺学，以后逐渐应用于植物学、动物学和医学等方面。广泛意义上的“克隆”其实是我们的日常生活中经常遇到，只是没叫它“克隆”而已。
春天里体—那头6岁母羊具有完全相同的基因，可谓是它母亲的复制品。值得注意的是，克隆技术在带给人类巨大利益的同时，也会给人类带来灾难和问题，但我们不能因为这项技术可能带来严重后果而阻止其发展，它的产生归根结底是利大于弊，它将被广泛应用在有利于人类的方面。
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
浅析我国关于人体克隆技术的立法
浅析我国关于人体克隆技术的立法内容摘要：人体克隆技术作为一项新兴的科学技术，自其产生之日起，就在社会上引起了广泛的争论，那我国立法应如何对待人体克隆技术或克隆人呢？本文将法学和生物学相结合，并参照外国做法，分析人体克隆技术的合法性问题及人体克隆技术对法理造成的冲击，以及我国关于克隆人立法的建议。 关键词：人体克隆技术克隆人法律关系立法现状立法建议 正文：人体克隆技术作为一项新兴的科学技术，因其研究对象的特殊性，自其产生之日起，就给社会带来了巨大的影响，也在社会上引起了广泛的争论，其技术研发与应用涉及的一系列法律问题，各国现存的法律规范体系中缺乏相应的解决对策，由于克隆人可能带来复杂的后果，一些生物技术发达的国家，现在大都对此采取明令禁止或者严加限制的态度。那我国的立法应如何正确对待人体克隆技术和克隆人呢？ 一、克隆技术的定义及发展 克隆是英文“clone”的音译，是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组之后代的过程.科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程，这门生物技术叫克隆技术，含义是无性繁殖。 克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。哺乳动物的克隆成功意味着人体克隆的可能性，因而才引起全球性轰动。一种可能性是治疗性克隆，即通过克隆技术把病人的体细胞核移植到去核卵细胞中，使其发育成囊胚（早期胚胎），从其中提取胚胎干细胞，利用其多能性诱导分化培养成特定细胞和组织，用于对严重疾病的治疗，可避免发生免疫排斥。它的重要前提是：胚胎必须是治疗不育症夫妇多余的或自愿捐献的，胚胎实验只能在发育14天内进行，只能以疾病的治疗为目的。为什么要进行胚胎实验呢？因为全能干细胞只能在早期胚胎中获取，而全能干细胞有无限分化和增殖的潜能，可分化成全身200余种细胞类型，利用它来培育人体细胞和组织，将为疾病治疗提供广阔前景。
4第四章 单克隆抗体与基因工程抗体制备技术
第四章单克隆抗体与基因工程抗体制备技术 本章考点 1.概念 2.杂交瘤技术基本原理 3.杂交瘤抗体的制备技术 4.基因工程抗体 由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。 传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。 第一节杂交瘤技术基本原理 单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。 一、B细胞杂交瘤技术 1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。 2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT 培养基上长期存活与繁殖。 3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。
克隆技术
丰城初中课堂自主学习指导纲要 学习内容：克隆技术 备课人：张风梅 序号： 八年级 生物 科目 第 11 周 日期：2012/11/28 【目标定向】 1.说出克隆技术的实质及应用。（重点） 2.概述克隆羊“多利”的培育过程。 3.分析克隆技术与伦理。 4.通过辩论活动，培养学生批判性思维能力，提高语言表达能力和信息交流能力，确立正确的伦理观和价值观。 【学生先学】 （一） 创设情境，导入新课 “有意栽花花不开，无心插柳柳成阴”。优良品种的果树常用什么方法进行繁殖？试分析这种方法的特点。 （二）新课学习 1、看课本P97的“分析与讨论”，掌握“多利”的培绵羊育过程示意图，思考完成以下几个问题（小组合作完成）： （1）述说“多利”的培育过程。 （2）在进行克隆实验时，维尔穆特选用不同 品种绵羊的目的是什么？ （3）“多利”的遗传物质与哪只绵羊相同？请说明你的理由。 （4）与普通绵羊的繁殖相比，“多利”的产生有什么特殊之处？ 母羊A 母羊 B 母羊C
（5）A羊提供了去核的细胞核，科学家利用卵细胞的目的是什么？ 小结：“多利”是无性生殖的后代，其性状表现与亲本一样，“多利”遗传物质与提供细胞核的那只绵羊相同，培育“多利”的技术就属于克隆技术。 2、请同学们阅读课本第99页的第二段，分组讨论下列问题： 克隆技术的优越性表现在哪里？ （二）、克隆技术与伦理 同学们阅读课本的第二框题，讨论以下问题： 1、克隆人来到世界上将会给社会带来什么影响，你同意克隆人吗？ 2、有人主张克隆人体器官，用于医学上人体器官的移殖，这行不行？ 3、从生物进化的角度来看，克隆人有什么弊端？ 【合作探究】 辩论活动：关于是否应该禁止克隆人的辩论。 为什么许多国家反对克隆技术应用于人类？ 【点拨拓展】 1、思考：试管婴儿与克隆的区别。
《克隆技术》教案
第二节克隆技术 一、【教材分析】 前面学习了动植物的生殖和生物的遗传和变异的特征。本课是以此为基础，在学生已有的认知和经验基础上，进一步引领学生感悟生命过程的复杂多样，讨论克隆技术给人类带来的影响，思考科学技术的双面性。 二、【教学目标】 （一）知识目标： 1、能通过讨论等方式探究克隆技术带来的影响；能将所收集的资料进行整理，设计成有条理的讲演 稿向其他人介绍；能有一定根据地提出自己的观点，并能对其他同学的观点进行评价。 2、能体会到科学技术的“双刃剑”含义。（难点） 3、能用自己的话解释克隆技术。 4、能从正反两个方面说出克隆技术给人类带来的影响。（重点） （二）能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展的资料。 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。 （三）情感目标： 1.通过收集有关克隆人方面的信息，增强关注社会热点问题的意识； 2.通过分工合作，培养团结互助的协作精神； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 四、【教学准备】 教师准备： 收集相关的资料和图片作成多媒体课件； 学生准备： 1、准备“假设我会克隆”小作文；
2、收集有关克隆人方面的信息和资料，为“关于是否应该禁止克隆人的辩论”做准备。 五、【教学过程】 教学环 节及时间安排教师活动学生活动 设计意 图 一、创设情景，激发兴趣： （3分钟）1、【展示】孙悟空图片或视频： 2、【提问】你喜欢孙悟空吗？他有哪些本领？ 3、【过渡】孙悟空拔出一根毫毛能变出千万个一 样的自己来。这个神话引发人类复制自身的幻 想，用现代的眼光看就是“克隆”。今天我们学 习第二节克隆技术。 回答孙悟空会：①七 十二变；②腾云驾 雾；③有一双火眼金 睛，能看穿妖魔鬼怪 的伪装；④一个筋斗 能翻十万八千里；⑤ 拔一根毫毛变出一 样的自己等。 孙悟空 形象和故 事，家喻户 晓。易于激 发学生学 习兴趣。 二、知识回顾: （4分钟）1、【展示图片过渡】植物的“克隆”，老百姓可 能每天都在做。 扦插 嫁接 2、【提问】 植物的扦插、嫁接、压条、组织培养和用种子繁 殖相比，有什么特点？ 3、【过渡】无性生殖在生物学上就叫“克隆”。 植物的克隆我们每天都可以做，高等动物的克隆 看图片回顾植物的 扦插、嫁接、压条、 组织培养的知识。 思考回答：扦插、嫁 接、压条、组织培养 都是无性生殖，没有 两性生殖细胞的结 合而直接由母体产 生新个体。 学生对无 性生殖很 熟悉，但不 知道无性 生殖就是 克隆。教师 利用原有 的知识做 基础，引导 学生回顾、 复习。使课 堂能够顺 利过渡到 克隆技术。
中国是动物克隆技术强国
中国是动物克隆技术强国 在第八届农高会上，以世界首批克隆山羊为主举办的畜牧专题展引人注目。一对健康活泼的“龙凤胎”山羊“欢欢”和“庆庆”向世人展示：杨凌是中国动物克隆基地，中国是动物克隆技术强国。2003年8月8日，世界首批体细胞克隆山羊“阳阳”与一只1995年出生的胚胎克隆山羊自然交配后，顺利生下一对“龙凤胎”山羊，当时“阳阳”刚满一岁，这一消息通过媒体传播到全球各地，外国生物科学家对中国动物克隆技术竖起了大拇指。中国克隆羊与克隆羊自然交配繁育成功，创造了世界奇迹。 地处杨凌的西北农林科技大学是我国克隆动物基地。中国著名胚胎工程专家、西北农林科技大学生物工程研究所所长张涌教授说，“阳阳”的生产意义重大，可以证明体细胞克隆山羊和胚胎克隆山羊具备与普通山羊一样的生育繁殖能力。 动物克隆技术被生物科学家誉为“生物原子弹”，各国都在竞相发展这一高新技术。动物克隆技术分胚胎克隆技术、体细胞克隆技术。胚胎克隆技术是采集母体动物的卵子，在体外培养成熟以后，去掉它自身的遗传物质 DNA，再采集多细胞的动物胚胎，在体外分离出一个个单细胞，将其细胞核移植到去核的卵子中，构成克隆胚胎，经动物体外培养后移植到动物体内，让其妊娠产子。体细胞克隆技术与胚胎克隆技术相比，其科技难度更大。它是从成年动物身体上取一点组织，分离出一个个细胞，将细胞核移植到去核的卵子内就可构成克隆胚胎，然后，再将其移植到动物受体内妊娠产子。成熟的动物克隆技术，在人类征服自然和发展经济中有着巨大威力，其应用极为广泛：用于生物学、畜牧学、畜医学和医学实验的克隆动物群体，可提高实验结果的准确性；用于复制转基因动物，可克服有性繁殖难以稳定遗传的基因缺陷；用于动物遗传资源保存，可缩小或取代保种群体；用于复制珍奇濒危动物，可使野生动物保护变被动为主动；用于克隆皮肤、血液和心、肾、肝、肺等人类器官，将为人类医学和健康带来革命性的变化。 西北农林科技大学动物克隆技术的科研群体，在1990年就攻克了胚胎克隆技术，繁育出世界首批克隆山羊。1995年又利用胚胎克隆技术，繁育出45只胚胎克隆山羊，形成目前世界上最大的胚胎克隆羊群。2000年6月，出生的世界首批体细胞克隆山羊“元元”、“阳阳”，标志着我国胚胎工程研究和开发实力已居国际先进水平。以此为强大技术支撑成立的科元克隆股份有限公司是我国生物高科技产业化重要基地，主要从事家畜胚胎工程、国际良种繁育。据介绍，动物克隆基地正在进行的奶羊和奶牛转基因技术研究和开发，一批拥有我国自主知识产权的基因工程产品不久就会问世。杨凌正在创建着我国生物高科技源头和产业航空母舰。
克隆技术的发展与应用前景
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
中国第一只克隆警犬等4则
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/6f9418115.html, 中国第一只克隆警犬等4则 作者： 来源：《派出所工作》2019年第06期 中国第一只克隆警犬 2019年3月，一只名叫“昆勋”的小奶狗来到昆明警犬基地“入学”。“昆勋”于2018年12月在北京出生，它的供体犬是昆明警犬基地培育出的昆明犬“化煌马”。“化煌马”现年7岁，先后参与查破命案数十起，是一只战功赫赫的一级功勋犬。像“化煌马”这样的警犬可谓千里挑一。 昆明犬在我国警务工作中发挥了非常突出的作用，是由公安部昆明警犬基地培育定型的我国第一个优良工作犬品种，现已形成形状相似、遗传性能相对稳定的狼青、草黄、黑背三个品系。昆明犬具有嗅觉系统灵敏、扑咬凶猛、忠实主人等品质，适用于追踪、缉毒、护卫等工作，特别适合做警犬或军犬。传统的昆明犬繁育方式为有性繁殖。在“功勋昆明犬的克隆”项目的支持下，2018年9月北京的项目组成员通过“化煌马”的皮肤小样培养并提取了体细胞细胞核，选取另一头雌性犬的去核卵细胞，并由一只雌性比格犬代孕，最终产下了“昆勋”。這标志着我国首次实现了警用工作犬的克隆。 青少年防沉迷系统 青少年防沉迷系统是在国家互联网信息办公室的指导下，在短视频平台试点上线的软件系统。“青少年防沉迷系统”内置于短视频应用中，用户每日首次启动应用时，系统将进行弹窗提示，引导家长及青少年选择“青少年模式”。进入“青少年模式”后，用户使用时段受限、服务功能受限、在线时长受限，且只能访问青少年专属内容池。系统还将试点通过地理位置判定、用户行为分析等技术手段筛选甄别农村地区留守儿童用户，自动切换到“青少年模式”。2019年3月28日，国家网信办指导组织抖音、快手、火山小视频等短视频平台试点上线。该系统对呵护未成年人健康成长、行业履行社会责任、营造良好网络环境具有创新性意义。 第一张黑洞照片 2019年4月10日，天文学家召开全球新闻发布会，宣布首次直接拍摄到黑洞的照片。为了得到这张照片，天文学家动用了遍布全球的8个毫米/亚毫米波射电望远镜，组成了一个所 谓的“事件视界望远镜”（Event Horizon Telescope，缩写EHT）。自2017年4月5日起，这8个射电望远镜连续进行了数天的联合观测，随后又经过2年的数据分析才一睹黑洞的真容。这颗黑洞位于代号为M87的星系当中，距离地球5300万光年之遥，质量相当于60亿颗太阳。 数字游民 数字游民指无需办公室等固定工作地点，而是利用技术手段，尤其是无线网络技术完成工作的人。数字游民代表着远程办公领域的一个自然发展趋势。因特网让数百万的“线上”人士在
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
克隆技术发展简介
克隆技术简介 克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一个生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（例如同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。 “克隆”的来源及发展 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究工作在80年代初期一度进入低谷。后来，有人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用成年羊体细胞克隆出一只活产羊(多莉)，给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。 多莉与那头6岁母羊具有完全相同的基因，可谓是它母亲的复制品。具体有四个步骤如下 ①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 ②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。 ③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 ④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。 换言之，多莉有三个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个“借卵母亲”——一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、
制备单克隆抗体的技术要点
制备单克隆抗体的技术要点 1．交瘤技术的技术流程 如图4-1所示。 图4 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本流程2．技术要点 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞
用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合融合是杂交瘤技术的关键一步，细胞融合应在无菌条件下，于室温或37℃水浴中进行。瘤细胞与脾细胞之比为1：8～10，在l～2min内滴加50%PEG 1.0ml 边加边摇，静置1-2min。然后再在2～3min内缓慢滴加无血清培养液，终止反应。1000rpm离心10min。最后加含20%小牛血清的HAT培养液。将细胞混匀，接种于96孔培养板中培养，每孔加0．1ml，同时还加0．1ml的饲养细胞悬液。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA 法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
第四节克隆技术的应用和难题
第四节克隆技术的应用和难题 一、克隆技术的应用领域 克隆技术已展示出广阔的应用前景和有价值的应用，概括起来大致有以下五个方面： （一）生产转基因动物 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 目前，克隆技术在英国又有了新的进展，他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台，它的主管罗思詹姆斯博士说：“从研究“多莉”中我们知道，我们可以用一个细胞制造出一只转基因动物。我们现
中国反对“克隆人”的研究(二)
中国反对“克隆人”的研究（二） 在整个克隆的过程中，克隆体是极为脆弱的，从在培养皿中等待细胞分裂开始，到在子宫内即将出生的时候，克隆体时时刻刻都有危险。 多利就是277例克隆试验的唯一幸存者。 其实造成这种情况的原因很简单。哺乳动物的克隆是一个相当复杂的过程，它牵扯到至少3只动物，几百个卵子，以及几百个成熟的体细胞。 成熟的体细胞含有整个生物体的所有遗传基因，克隆的过程就是打乱这个体细胞的生长程序，让它重新发育成一个胚胎。 完成这一步的过程被称为“细胞核移植”，这也是克隆过程中的最关键部分。“细胞核移植”的第一步是除去卵细胞的细胞核，然后将另一个成熟体细胞的细胞核移植进卵细胞。经过电子和化学方法的刺激作用，这两个原本互不相干的组成部分“杂交”成一个类似胚胎的细胞。毫不奇怪，这一过程的成功机会很小。多利羊之父威尔默特曾说过：“这就像买彩票一样。” 科学家表示，大部分克隆过程中造成的缺陷，都是“DNA 甲基化”的结果。在正常情况下，生物分子内的甲基物质可以规范DNA中遗传基因的顺序。但克隆的过程则是打乱了这
个顺序。 克隆的过程就像把一部小说的所有词序都打乱，然后再把这些词句的顺序都恢复，让这部小说复原。在这种情况下，要想100％地复原，那几乎是不可能的。 不过，经过研究后科学家发现，克隆动物的这种天生缺陷并不会传给它们的下一代。如果让克隆动物跟正常动物进行交配，他们的后代是由精子和卵子自然结合而成的话，由于克隆造成的缺陷就不会遗传给它的下一代。 例如多利就顺利生下了5只小羊。此外，克隆牛、克隆鼠、克隆猪都有产下正常后代的记录。但是，克隆动物之间的交配，目前还没有成功生育后代的案例。 从目前已经被克隆出的动物来看，最普遍的问题是所谓的“巨婴综合征”——刚出生的克隆体明显比正常的新生动物大，而且带有呼吸困难的症状。 此外，为克隆体提供子宫的“代母”大都要经历更长的怀孕期，以及更为痛苦的分娩过程。 在威尔默特的克隆实验室里，曾经产生过很多畸形的克隆羊，其他科学家也曾报告说，他们的克隆动物存在大脑、心脏、肾脏等器官异常的情况。 不过哺乳动物本身拥有极强的自身调节能力，这就是为什么偶尔有克隆动物能逃过基因变异的劫难，像多利那样存活下来。
克隆技术的发展
克隆技术的发展 摘要：1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林研究所的伊恩?维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 关键词：DNA克隆，生物个体的克隆，“多利”(Dolly)，卵丘细胞。 正文： 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ①“多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林研究所的伊恩·维尔莫特科
学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境――子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下：从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如果“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠就是名副其实的克隆鼠了。 ②通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程
单克隆抗体手册
单克隆抗体技术 第一节单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的着名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT 培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。 （二）、基本程序和方法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，