放线菌检测标准版本
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微生物总数检测方法(放线菌）
一、检测用培养基配方与培养条件
1.培养基：高氏1号培养基
配方：可溶性淀粉 2g ，KNO3 0.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4? 7H2O 0.05g ，NaCl 0.05g ，FeSO4? 7H2O 0.001g （母液），琼脂 2g ，自来水 100mL 。
先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到～，分装后灭菌，备用。
2. 培养条件：温度：27℃-30℃；时间：36--48小时。
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二、检测与计数方法
1. 系列稀释
称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之
溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。
2. 用1mL无菌移液管分别吸取上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液（每个
稀释度应更换无菌移液管）。
3. 加样及培养
取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。
4. 菌落识别
根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。
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5. 菌落计数
以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。
有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数：
nm = x kv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8 （1）
式中：
…
nm —质量有效活菌数，亿/g
nv —体积有效活菌数，亿/mL
x—有效菌落平均数，个
k —稀释倍数
v1 —基础液体积， mL
v2 —菌悬液加入量， mL
v0 —样品量，mL
m0 —样品量， g
#
重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。所以：
①悬液中要加分散剂分散菌团；
②震荡时间也要较液态发酵产品时间长，使用旋转式摇床控制在180——
200r/min 。
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
放线菌期末作业
放线菌学期末作业 1，为什么说放线菌是一类介于细菌和霉菌之间，又更接近于细菌的一类原核微生物？ 答： 放线菌是一种具有丝状分支的单细胞，状态与霉菌相像。所以人们认为放线菌是介于细菌和真菌之间的过渡型。放线菌更接近于细菌，主要是因为： 1，有原始核结构，无核膜和核仁； 2，放线菌虽有发育良好的菌丝体，但大部分无隔，为单细胞； 3，放线菌菌丝比真菌细得多，其直径与细菌相似； 4，细胞壁主要成分为肽聚糖，并含有DAP； 5，游动放线菌的鞭毛与细菌鞭毛类似，无“9+2”结构； 6，放线菌同大部分细菌一样，对酸敏感，在微碱性条件下生长良好；6，放线菌属无性繁殖，同细菌一样，尚未发现其有性世代； 7，对溶菌酶和作用于细菌的抗生素敏感； 8，DNA重组方式与细菌相同； 9，核蛋白体为70S。 2，基内菌丝、气生菌丝和孢子丝在结构上有何区别？它们又有何联系？ 答： 基内菌丝 链霉菌的孢子落在适宜的固体基质表面，在适宜条件下吸收水分，孢子肿胀，萌发出芽，进一步向基质的四周表面和内部伸展，形成基内菌丝，又称初级菌丝或者营养菌丝。 气生菌丝 是基内菌丝长出培养基外并伸向空间的菌丝，又称二级菌丝。 在显微镜下观察时，一般气生菌丝颜色较深，比基内菌丝粗，直径为 1.0～1.4微米，长度相差悬殊，形状直伸或弯曲，可产生色素。 孢子丝 是当气生菌丝发育到一定程度，其顶端分化出的可形成孢子的菌丝，叫孢子丝，又称繁殖菌丝。 孢子成熟后，可从孢子丝中逸出飞散。孢子丝的形状有直形、波曲、钩状、螺旋状，螺旋状的孢子丝较为常见，其螺旋的松紧、大小、螺数和螺旋方向因菌种而
异。孢子丝的着生方式有对生、互生、丛生与轮生（一级轮生和二级轮生）等多种。 基内菌丝→气生菌丝→孢子丝 3.放线菌的那些特征可作为其分类鉴定的重要依据？ 答：色素，菌丝是否有隔，对氧需求，寄生或腐生，基因组成，细胞壁成分，16sRNA。 4.试介绍放线菌在工业、农业、医药、食品等方面的应用。 答： 工业 嗜盐放线菌能产生胞外多糖及其他多聚物，蛋白含量极高(在相同面积的蛋白质产量相当于种植玉米的125倍，养鱼的70倍，养牛的600倍)，酶活性很特殊(在高盐浓度下仍保持高活性)，也产生抗生素、胰岛素、维生素等，因此嗜盐放线菌是一类很有开发价值的资源。例如，嗜盐放线多孢菌可以将甘氨酸转化为甜菜碱，它又是一种重要的高效保护剂。国内外有不少微生物学工作者正在试图从高盐碱环境里找到一种具有较高脱卤酶活性的嗜盐菌菌株，以期能达到高效、彻底消除环境污染物的目的。 农业 放线菌大量存在于土壤中，它们中绝大多数是腐生菌，能将动植物的尸体腐烂、分解，然后转化成有利于植物生长的营养物质。还有弗兰克氏菌，生长在许多非豆科植物的根瘤里，能固定大气中的氮，成为植物能利用的氮肥。 医药 人们常用放线菌产生的链霉素、红霉素这一类抗生素药物治病，使许多病人转危为安。利用放线菌还可以生产维生素B12 、蛋白酶和葡萄糖异构酶等医药用品。食品 低温放线菌进行低温发酵时可生产许多风味食品，并且这种发酵方式可以节约能源和减少中温菌污染。目前发现的几千种抗生素中，有一半以上是由放线菌产生的。它的菌落颜色鲜艳，呈放射状，对人体无害，因此，人们常用它作食品染色剂，既美观，又安全。 5.请介绍放线菌细胞的构造特征。 答： 细胞壁：细胞壁是位于菌体的外层，内侧紧贴细胞膜的一层无色透明，坚韧而有弹性的结构。细胞壁约占细胞干重的10%—25%。主要由肽聚糖组成。 细胞膜：是围绕细胞质外面的双层膜结构。由磷脂(20-30%)和蛋白质(50-70%)组成.基本结构是磷脂双层：疏水的脂肪酸链排列在内，亲水的磷酸基排列在外。蛋白质镶嵌在双层磷脂中，并伸向膜内外两侧。边缘蛋白和整合蛋白（跨膜蛋白）
放线菌资料
放线菌资料的总结 放线菌资料的总结 放线菌的形态比细菌复杂些，但仍属于单细胞。在显微镜下，放线菌呈分枝丝状，我们把这些细丝一样的结构叫做菌丝，菌丝直径与细菌相似，小于1微米。菌丝细胞的结构与细菌基本相同。 根据菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。链霉菌属是放线菌中种类最多、分布最广、形态特征最典型的类群，其形态如下图所示。 下图：链霉菌的一般形态和构造（模式图） 正文： 放线菌是怎么生长的，需要什么条件，我指的不是培养基，而是在植物体内。植物内生放线菌在植物的韧皮部、木质部和韧皮部之间的缝隙有生长，分离植物的内生菌通常在这两个部位可以分离到。主要是靠植物组织提供营养，有很多内生菌能够分解纤维素作为炭源，无机盐和氮源可以由植物组织中的无机盐和含氮物质获得，他们在植物中生长很缓慢。 通常来说，植物或者植物的组织器官的生长时间越长内生菌的种类和数量越多，你如果要分离可以选择树龄在百年以上的树。 植物器官粉末中会有放线菌存在吗？干燥的，经辐射灭菌后的粉末会把放线菌杀死吗？适宜的条件还会长出菌吗？ 辐射灭菌和50-60度的干燥都不能杀死所有的放线菌。 另外植物当中不只有放线菌，植物的内生菌大多数是真菌，有的内生真菌产生孢子能够抵御不良环境，生存能力很强。 如果你是做植物组织化学可以采用高温处理，杀死植物当中的微生物，再分析植物组织的成分。如果你要的成分不能高温处理，可以用容易挥发的消毒剂处理植物样品，杀死微生物然后，在无菌环境下使消毒剂挥发。建议你采用75%乙醇。如何分离内生菌？
目前内生菌的分离主要还是表面消毒，建议你最好不要把植物组织研磨成粉末。可以将组织用75%乙醇表面消毒，在无菌室中的超净台中将植物组织吹干，用消毒的手术刀，把植物组织切割成0.5*1cm的小块。直接把组织块接入培养基，同时将组织小块在空培养基中滚动，然后取出，作为对照平板。如果对照平板有菌长出，说明消毒不彻底，如果对照平板无菌生长，说明消毒彻底。（将菌回接以后菌能够在植物中生长，不能准确说明该菌就一定是内生菌。只是有一些人的推测，并不具有权威性。而且对于大多数植物回接不实际。） 请问在用金标法检测霍乱弧菌的时候，怎么样才能确定细菌的浓度已经达到最低检测限1000000/ml？ 1.梯度稀释，平板培养，计算单菌落数 2.分光光度计测定光密度，制定标准曲线；测定某一光密度下的菌体浓度 3.比浊 荧光染色技术最准确 稀释---甲醛固定（可放置起来，以后一起分析）---过滤到核孔滤膜0.22---丫叮橙染色--荧光显微镜检测计数--或者数码相机照相---相关软件分析，可快速大量计数 缺点是所有细菌--不分死活 另外还有一种专门检测活菌数的荧光计数 我手头上的一株放线菌因暂不应用而予以保存（砂土管、液体石蜡），历时半年，现给以复活，所得菌落皆呈衰败样。试问各位高人，如何补救？ 关键不知道你的放线菌是不是真的退化了，放线菌的退化表现主要有：在斜面上多次传代后产生“光秃”现象等，从而造成生产上用孢子接种的困难；还有菌种的代谢活动，代谢产物的生产能力或其对寄主的寄生能力明显下降。 如果是真的退化了，可以对其进行复壮。具体的菌种的复壮措施如下：纯种分离采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状。复壮好的菌株可以继续保存。 还有一种可能会不会是培养基和培养条件的问题，如果培养基中缺少某中元素，
微生物检验病原性放线菌及检验
第三十章病原性放线菌及检验 本章考点： 一、放线菌属 放线菌属的细菌是革兰阳性无芽孢厌氧杆菌，多为动物体表面，特别是口腔正常菌群的成员，少数可引起内源性感染。其中，衣氏放线菌是人类放线菌病最常见的菌种，牛放线菌主要引起牛放线菌病。 （一）生物学特性 1.形态与染色：革兰阳性，无芽孢、荚膜和鞭毛，无抗酸性。菌体常形成分枝状无隔菌丝，但不形成空中菌丝。有时断裂成短杆状或球状。在患者病灶和脓汁中可找到肉眼可见的黄色小颗粒，称为“硫磺颗粒”，是放线菌在病灶组织中形成的菌落。将其压制成片，镜检可见颗粒呈菊花状，中央为革兰阳性的丝状体，周围为粗大的革兰阴性棒状体，呈放射状排列。 2.培养特性：本菌培养比较困难，厌氧或微需氧。在有氧环境中一般不生长，初次分离加5%CO2可促进生长。生长缓慢，在培养基上需3～4天才能形成肉眼可见的较致密菌落，灰白色或瓷白色、表面粗糙而不规则的菌落。经人工多次移种后，可形成光滑型，白色、柔软、易于钩取的菌落。 在葡萄糖肉汤中37℃3～6天后，在培养基底部形成灰白色球形小颗粒沉淀。 在硫乙醇酸钠肉汤中37℃3～6天后，在培养基下层白色或灰白色雪花样生长，管底生长不多，肉汤清晰。 衣氏放线菌在牛心脑浸液琼脂上，37℃18～24小时形成蛛网状菌落。继续培养7～14天，形成臼齿形或面包屑样菌落，白色或灰白色，不溶血，无气中菌丝。菌落常粘连于琼脂上，不易挑起和乳化。 3.生化反应：能分解多种糖类产酸，除粘性放线菌外触酶试验均为阴性，不产生吲哚，不分解尿素。 （二）致病性
放线菌大多存在于正常人口腔、上呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道，属于正常菌群。只在机体抵抗力减弱或受伤时引起的内源性感染，导致软组织的化脓性炎症。若无继发感染则大多呈慢性无痛性过程，常出现多发瘘管，排出的脓性物质中含有硫磺颗粒，此即为放线菌病。 放线菌可引起面颈部、胸部、腹部和中枢神经系统等感染。最常见为面颈部感染。本菌可从呼吸道进入肺，开始在肺部形成病灶，症状和体征似肺结核。损害大多广泛连续蔓延，并能穿破胸膜和胸壁，在体表形成多个瘘管，排出脓液。原发性皮肤放线菌病常由外伤或昆虫叮咬引起。放线菌还与龋齿和牙周炎有关。 （三）微生物学检验 1.标本采集：主要采集脓液和痰液或活检组织。首先检查标本中有无“硫磺颗粒”，可用灭菌注射器抽取未破脓肿的脓汁作检查。 2.直接镜检：将“硫磺颗粒”置玻片上，以盖玻片轻压后镜检。在低倍镜下如见有典型的放射状排列的棒状或长丝状菌体，边缘有透明发亮的棒状菌鞘，即可确定诊断。也可用革兰染色、镜检，颗粒的中心部菌丝体染色为阳性，分枝状菌丝排列不规则，四周放射状的肥大菌鞘可呈阴性。抗酸染色阴性。 3.分离培养：将标本接种在液体培养基中在5%C02的厌氧环境中37℃3～6天，观察生长特点。接种牛心脑浸液琼脂上，观察菌落特征。 4.生化反应：触酶试验，明胶液化，硝酸盐还原，多种糖类分解试验，厌氧环境37℃3～7天观察结果。 二、诺卡菌属 诺卡菌是广泛分布于土壤中的一群需氧性放线菌，多数为腐物寄生性的非病原菌。其中有5～6种诺卡菌可引起人或动物的急性或慢性诺卡菌病。主要为星形诺卡菌和巴西诺卡菌。 （一）生物学特性 1.形态与染色：本菌形态基本与放线菌相似，但菌丝末端不膨大。革兰染色阳性，抗酸染色呈弱抗酸性。在培养早期菌裂解为较多的球状或杆状，分枝状菌丝较少。在病人脓、痰、脑脊液中本菌为纤细的分支状菌丝。 2.培养特性：为专性需氧菌，营养要求不高，在普通培养基或沙氏培养基上室温或37℃培养均可生长，但繁殖速度慢，一般需5～7天可见到菌落。菌落表面干燥、有皱褶或呈颗粒状，不同种类可产生不同色素。星形诺卡菌可形成黄色或深橙色菌落，表面无白色菌丝。巴西诺卡菌的菌落，表面有白色菌丝。在液体培养基中由于需氧可在表面长成菌膜，下部培养基澄清。 （二）致病性 主要为外源性感染。星形诺卡菌主要通过呼吸道引起人的原发性、化脓性肺部感染，产生类似肺结核的症状。也可经肺部病灶转移到皮下组织，产生脓肿及多发性瘘管，或扩散到其他脏器，如引起脑脓肿、腹膜炎等。在病变组织或脓汁可见黄、红、黑等色素颗粒。而巴西诺卡菌可因外伤侵入皮下组织，引起慢性化脓性肉芽肿组织，表现为脓肿及多发性瘘管，好发于足、腿部，故又称为足分枝菌病。此病也可能由星形诺卡菌、马杜拉放线菌及某些真菌引起。
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法
土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。 科标检测研究院凭借多年的微生物检测经验，可提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，赢得社会业内广泛认可。主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。以下介绍几种菌的分离方法： 一、从土壤中分离放线菌 1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。振荡10分钟，制成10-1菌悬液。按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。 3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。 4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。 二、从土壤中分离霉菌 1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。将培养皿中，凝成平板，待用。 2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。 3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。培养基上会出现微生物菌落。霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。 4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上
放线菌检测标准版本
( 微生物总数检测方法(放线菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：高氏1号培养基 配方：可溶性淀粉 2g ，KNO3 0.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4? 7H2O 0.05g ，NaCl 0.05g ，FeSO4? 7H2O 0.001g （母液），琼脂 2g ，自来水 100mL 。 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到～，分装后灭菌，备用。 2. 培养条件：温度：27℃-30℃；时间：36--48小时。 ! 二、检测与计数方法 1. 系列稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之 溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用1mL无菌移液管分别吸取上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液（每个 稀释度应更换无菌移液管）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 [ 5. 菌落计数 以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8 （1）
实验3 环境微生物的检测
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告
土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌 2、放线菌的培养 3、放线菌的发酵产生活性物质 4、放线菌产生的活性物质提取。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。 实验器材： 1、土壤 2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基 3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。 实验步骤：
一、土壤放线菌株的采集 采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。 样品（土壤）处理：室温风干 二、土壤中放线菌的分离、培养 1、配制淀粉培养基 淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml. 先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 ①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。 ②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。 ③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。
放线菌的抑菌试验
实验一放线菌的抑菌试验 一、实验目的 1、学习掌握放线菌所产抗生素抗菌谱的测定方法 2、掌握牛津杯法检测抗生素的原理及基本操作 3、掌握微生物实验的基本生物技术，无菌操作技术，培养基无 菌化处理（高温灭菌）、菌种纯化分离技术及纯种培养技术 等。 4、熟悉掌握高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、离心机等器材的使 用方法。 5、熟悉各种合成培养基的制备方法，熟练掌握涂平板、在培养 基接种等基本操作步骤。 二、实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，放线菌所产生得抗生素，能抑制多种细菌的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大 肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌，采用牛津杯法检测其所产 抗生素的抑菌活性大小。 三、实验材料及用具 1、菌种：A 放线菌，实验室老师给提供菌种 B指示菌，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 2、用具：试管，平皿，涂棒，牛津杯，玻璃棒，高压蒸汽锅， 恒温摇床，恒温培养箱，镊子，移液器，超净工作台 四、培养基 1、高氏一号培养基：K2HPO4﹒3H2O 0.5g，可溶性淀粉 20g，KNO4 1g, MgSO4﹒7H2O 0.5g，FeSO4﹒7H2O 0.1g， NaCl 0.5g，H2O 1000ml。 2、种子培养基：葡萄糖5g，淀粉1.5g，酵母粉2.5g，CaC l2 0.1g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4﹒7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4﹒7H2O 0.01g，H2O 1000ml，pH 7.2-7.4 3、发酵培养基：黄豆饼粉 10.0g，淀粉30g，葡萄糖 50g， 酵母粉5g，玉米浆 15g，CaCl2 3.0g，H2O 1000ml，pH 7.0 4、LB培养基（液体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g， H2O 1000ml，pH 7.0 5、LB培养基（固体）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g， 琼脂 16g，H2O 1000ml，pH 7.0 五、实验步骤 1、配制培养基：按培养基配方比例依次精确地称取各种药品 放入烧杯中，在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻 棒搅匀。加足所需的水，调节pH值，将配制好的培养基分
微生物检验第二十五章 病原性放线菌及检验练习
第二十五章病原性放线菌及检验 一、A1 1、压片镜检可见到呈菊花状菌丝的是 A、放线菌 B、真菌 C、奴卡菌 D、链丝菌 E、链霉菌 2、放线菌生长时，对气体的要求是 A、专性需氧 B、专性厌氧 C、需加30%CO2 D、微需氧或厌氧 E、兼性厌氧 3、放线菌引起的化脓性感染，其脓液特征是 A、黏稠，呈金黄色 B、稀薄，呈血水样 C、稀薄，呈蓝绿色 D、稀薄，呈暗黑色 E、可见到硫黄样颗粒 4、放线菌引起外伤性创伤感染，标本检查应首选 A、抗原检测 B、核酸检测 C、直接显微镜检查 D、分离培养 E、生化试验 5、对放线菌的错误叙述是 A、革兰阳性、非抗酸阳性菌 B、为条件致病菌，引起内源性感染 C、临床特点为形成慢性肉芽肿并伴瘘管形成 D、诊断可取分泌物查找硫黄样颗粒压片镜检 E、病后可产生特异性抗体，获得免疫力 6、关于放线菌错误的是 A、有细长菌丝 B、革兰染色阴性 C、大多数不致病 D、属厌氧菌或微需氧菌 E、属原核细胞型微生物
7、放线菌的感染特点是 A、为非化脓性感染 B、脓汁黏稠 C、常为局部感染，不扩散 D、外源性感染 E、病灶常有瘘管形成，排出硫磺样颗粒 8、诺卡菌属引起的感染多为 A、内源性感染 B、蚊虫叮咬感染 C、动物的咬伤 D、接触感染 E、外源性感染 9、衣氏放线菌引起的感染类型属于 A、急性感染 B、隐性感染 C、外源性感染 D、内源性感染 E、接触感染 10、对于衣氏放线菌形态与染色正确的叙述是 A、革兰染色阳性 B、革兰染色阴性 C、荚膜阳性 D、鞭毛阳性 E、芽胞阳性 11、衣氏放线菌在患者病灶、脓汁标本中具有的特征是 A、肉眼可见黑色颗粒 B、肉眼可见白色颗粒 C、肉眼可见褐色颗粒 D、肉眼可见黄色颗粒 E、肉眼可见蓝色颗粒 答案部分 一、A1 1、 【正确答案】 A 【答案解析】将放线菌菌落压制成片，镜检可见颗粒呈菊花状，中央为革兰阳性的丝状体，周围为粗大的革兰阴性棒状体，呈放射状排列。 【该题针对“放线菌属”知识点进行考核】 【答疑编号100786916】 2、
环境中微生物检测方法
环境中微生物的检测 微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一群生物。无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。 空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。 1.1 土壤中的微生物 1.1.1 土壤是微生物生活的良好环境 在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。 1.1.1.1 营养 土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。 1.1.1.2 水分和渗透压 土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。 1.1.1.3 空气 土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的土壤，氧的含量高些，有利于好氧微生物的生长。 1.1.1.4 pH值 土壤的pH多接近中性，且缓冲能力强，适合大多数微生物生长的需要。在酸性或碱性的土壤中，亦有与之适应的微生物生长繁殖。 1.1.1.5 温度 土壤还具有保温性，与空气相比，昼夜温差和季节温差要小得多。即使冬季地面冻结，一定深度的土壤中仍保持一定的温度。一般是10～25℃，适宜多种微生物生长的需要。 此外，土壤表面几毫米厚的表层土是保护层，使土壤中的微生物可以免遭太阳光中紫外辐射直射致死。以上这些都为微生物生长繁殖提供了良好的条件。所以土壤有“微生物天然培养基”的美称。在土壤中的微生物种类最多，数量最大，是人类利用微生物资源的主要来源。
土壤中放线菌的分离与纯化
土壤中放线菌的分离与纯化 实验目的 1掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。 2掌握微生物实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术，纯种分离技术，纯种培养技术，以及抗生素检测等。 3掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。 4学习对微生物实验的中出现问题的分析，解决方法 实验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。 实验原理 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒
平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐，FeSO4?7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成 1.高氏一号合成培养基的制备 K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4? 7H2O0.125g， FeSO4?7H2O 0.025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。 配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后，121℃灭菌20分钟。 将6套平皿、12只试管灭菌。
放线菌检测标准版本
微生物总数检测方法(放线菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：高氏1号培养基 配方：可溶性淀粉 2g ，KNO30.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4? 7H2O 0.05g ，NaCl 0.05g ，FeSO4? 7H2O 0.001g （母液），琼脂 2g ，自来水 100mL 。 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 2. 培养条件：温度：27℃-30℃；时间：36--48小时。 二、检测与计数方法 1. 系列稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之 溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用1mL无菌移液管分别吸取1.0mL上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行 系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 5. 菌落计数 以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8 （1）
实验十二---土壤中产抗生素放线菌的分离纯化
实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化 实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。 2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。 3、掌握微生物的基本操作。 实验原理： 放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细 胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关 系极为密切，目前广泛应用的抗生素约 70% 是各种放线菌所产生。 许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。实验材料： 1 、土壤菜园土。 2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的 8h 培养物。 3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。 4、其它 10 ％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。 实验方法： 一、土壤中放线菌的分离 1、配制淀粉培养基 配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基） 可溶性淀粉 2 克；硝酸钾 0.1 克；磷酸氢二钾 0.05 克；氯化钠 0.05 克；硫酸镁 0.05 克；硫酸亚铁 0.001 克；琼脂 2 克水 100 毫升先把淀粉放在烧杯里，用 5 毫升水调成糊状后，倒入 95 毫升水，搅匀后 加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完
配方二面粉琼脂培养基 面粉 60 克；琼脂 20 克；水 1000 毫升 把面粉用水调成糊状，加水到 500 毫升，放在文火上煮 30 分钟。另取 500 毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整 pH 值到7.4 ，分装，灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释 （ 1）将 5.0g 土壤加入到 50ml 灭菌的生理盐水中，震荡 10min 制备土壤悬液。（ 2）用无菌吸管吸取 1ml 土壤悬液，加入到 9ml 灭菌的生理盐水中 10 倍稀释。（3）按 1：10 稀释至 10-3、10-4、10-5。 3、将 3 块灭菌平板分别标记 10-3、10- 4、10-5。 4、将高氏1号培养基加热溶化，待冷至55-60 C时，加入10%的酚数滴，混合均匀。分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55 C 的含有酚的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。 5、平皿倒置于培养箱28 C恒温培养一周左右。 6、将平皿上的放线菌菌落挑取在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化， 28 °C恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。 7、涂片显微镜观察放线菌的菌丝特征。 二、抗菌谱测定 1 、挑取一个放线菌的菌落接种到含有 250ml 淀粉液体培养基的三角瓶， 28 C恒温培养一周左右。 2、将 2ml 培养 8h 的金黄色普通球菌和大肠杆菌分别加到 200ml 灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中到 20ml ，凝固后待用。 3、在上面培养皿中均匀放入 4 个牛津杯，每个牛津杯中加入 1ml 放线菌发酵培养液。培养皿放入37 C培养箱恒温培养12h。 4、测量抑菌圈的大小。 结果与讨论 1 、描述从土壤中分离的放线菌菌落的形态特征，并分别描述细菌、酵母菌 和霉菌的菌落特征。
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定
土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定 一、培养基 1 放线菌培养基 高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。 2 放线菌形态及培养特征研究用培养基 察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。 麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。 甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。 无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。 马铃薯培养基：去皮马铃薯块200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。 营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖10g）。 葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖10g，L-天门冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏2g，H2O 1000mL，pH 7.2。 3 测定生理生化特性供试培养基 淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。 纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌20 分钟。（pH7.0～7.2） 明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min，pH7.0（灭菌3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。） 牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。 石蕊溶液配制：称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。