逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
RNA的聚合酶链式反应
RNA的聚合酶链式反应：目前常用的RNA检测方法有原位杂交，点杂交，Northern印记杂交以及核酸酶保护试验等。这些方法的普遍缺点是难以检测低丰度的信使RNA，并且操作繁琐，将RNA反转录和PCR结合起来建立RNA聚合酶链式反应（RT-PCR）则可以克服上述缺点。 RT-PCR先在反转录酶的作用下以信使RNA为模板合成cDNA，再以CDNA为模板进行PCR反应。此法快速，简便，并且灵敏度高。此法可以检测单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA。 RT-PCR 应用：分析基因的转录产物 克隆cDNA及合成cDNA探针， 改造cDNA序列等 RT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整。并且不含DNA，蛋白质等杂质。若RNA模板中污染了微量DNA，扩增后会出现特异DNA的PCR产物。而cDNA扩增产物却很少，必要时可用无ＲＮａｓｅ的ＤＮａｓｅ处理反转录产物，消除ＤＮＡ后在进行ＰＣＲ。如果蛋白质未除尽可与ＲＮＡ结合，从而影响反转录和ＰＣＲ反应。 常用的反转录酶有二种，也就是ＡＭＶ，和ＭｏＭＬＶ的反转录酶 ＡＭＶ反转录酶由二个不同亚基组成，具有较强的ＲＮａｓｅＨ活性。可水解ＲＮＡ模板，以ＲＮＡ模板合成单链ＤＮＡ的酶活性最适作用温度为４２摄氏度。ＭｏＭＬＶ反转录酶由一条多肽链组成，最适作用温度为３７摄氏度。ＲＮａｓｅＨ活性较低，适于合成大片段
全长ｃＤＮＡ 但是当模板ＲＮＡ的二级结构影响反转录反应时，用ＡＭＶ反转录酶更合适，因为较高的反应温度会消除ＲＮＡ二级结构的影响。此外ｉａ这二种反转录酶的缓冲液有所不同。 最近，从嗜热栖热菌ＨＢ８中分离得到Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶，此酶还具有反转录酶活性，９５摄氏度时该酶的半衰期为２０分钟具有５—３外切酶活性，无３—５外切酶活性，利用Ｔｔｈ耐热ＤＮＡ聚合酶同时具有反转录酶的特点，可以简化ＲＴ－ＰＣＲ，并且比Ｔａｑ聚合酶反应敏感度高１００倍。所以更优越。Ｔｔｈ聚合酶作用温度高，可消除ＲＮＡ的二级结构对反转录反应的影响，增加ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的反转录的活性，可增加ＲＴ－ＰＣＲ反应灵敏性。 ＴｔｈＤＮＡ聚合酶的缺点：反转录酶活性需要二价锰离子，而二价锰离子会降低ＤＮＡ聚合酶的忠实性， ＴｔｈＤＮＡ聚合酶催化聚合反应的错误掺入率为１／５００
逆转录
逆转录-聚合酶链反应中文实验方法 作者：佚名来源：本站原创 2004-12-20点击：6478 【字体：小大】 逆转录-聚合酶链反应 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为4 2℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Super script 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cD NA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的
PCR(聚合酶链式反应)原理
PCR(聚合酶链式反应)原理 PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在T aq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR 的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI 诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。 PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。 发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR 已经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。 PCR仪介绍及其选购 P CR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量
7、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr） 逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）可以：（1）分析基因的转录产物；（2）获取目的基因；（3）合成cDNA探针；（4）构建RNA高效转录系统。 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。 实验材料：组织、细胞 试剂、试剂盒：RNA提取试剂、dNTP混合物、Taq DNA聚合酶、第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材：离心管、离心机、水浴锅、PCR管、电泳仪、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 详细 实验方法 ?逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料 ?组织或细胞样品 试剂、试剂盒 ?RNA提取试剂 ?dNTP 混合物 ?Taq DNA聚合酶 ?第一链cDNA合成试剂盒 仪器、耗材 ?离心管 ?离心机 ?水浴锅 ?PCR管 ?电泳仪 ?凝胶图像分析系统 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，R T-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H 活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 三、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 四、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术 PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。 5.1 PCR技术原理 聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物（见图5-1）。 在PCR反应中，欲扩增的目的DNA片段由两条单链组成。首先合成出与两条链两端互补的寡聚核苷酸引物(约含20个核苷酸)，然后将起始反应液中的模板DNA加热而变性解链。在降低温度复性时，引物分别与A，B链两端的互补序列配对结合。最后，在DNA聚合酶的催化下，以目的DNA片段为模板进行聚合反应。第一轮反应结束后，目的DNA增加了一倍。新合成的DNA片段本身又能作为下一轮反应的模板。如此反复进行，DNA片段的数目可以呈
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： 变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C 退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C 延伸（extension）:72 ?C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 二、PCR的反应体系和反应条件 （一）PCR反应体系 参与PCR反应的主要成份: 模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。 1 模板 包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng? 2、引物（Primers） 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。引物的 合成可以采用化学方法。引物设计时必须遵循一些原则。 设计引物的原则： 1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补 2）长度为18 ~ 25个核苷酸 3）二条引物之间避免形成引物二聚体 4）引物的碱基组成应平衡 5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）
6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记） 3、脱氧核苷三磷酸（dNTP） 是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加 dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。 4、DNA聚合酶 从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。 Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。 最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增） Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。 耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。 5、镁离子浓度 镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。 当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。 6、其它反应因素 pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右） 盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交 基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性） （二）PCR的反应条件 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸）
第二篇第八章 多聚酶链式反应
第二篇技术篇 第八章多聚酶链式反应 1、基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成 设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。 （2）DNA模板的变性 加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA 的变性。 （3）模板与引物的结合（退火或复性） 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。 （4）引物延伸 将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 2、PCR反应体系与反应条件 （1）PCR反应体系 ◆模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100μL。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ◆引物浓度 0.1-0.5 μmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降 ◆Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 μl 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。 ◆dNTP 1
蔬菜辣椒褪绿病毒反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测方法
反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法 1试剂和缓冲液 除非另有说明，本标准中仅使用确认的分析纯试剂，在本标准中所使用水按GB 6682执行。 1.1 RNA提取试剂 1.1.1 GB缓冲液 异硫酸氢胍 4.0 mol/L NaAc(pH5.2) 0.2 mol/L EDTA(pH8.0) 25 mmol/L KAc 1.0 mol/L PVP-40 2.5%(W/V) 高压灭菌后4℃保存。 1.1.2 WB缓冲液 EDTA(pH8.0) 1 mmol/L Tris-HCl(pH7.5) 20 mmol/L NaCl 10 mmol/L 高压灭菌后，4℃保存。使用时按1:1比例用无水乙醇稀释。 1.1.3 10% NLS溶液 将1 g月桂酰基肌氨酸钠（NLS）溶于10 mL水中即得10% NLS溶液。 1.1.4 NaI溶液 NaI 6 mol/L Na2SO3 0.15 mol/L 用棕色试剂瓶装，高压灭菌后，4℃保存。 1.1.5 硅溶液 将60 g二氧化硅溶于500 mL水中，静置24 h，倒掉470 mL上清，再加水至500 mL，静置5 h，倒掉440 mL上清，用HCl将剩下的60 mL沉淀调pH值至2.0，高压灭菌后，200 μL/管分装，-20℃保存。 1.2 RT-PCR试剂 反转录酶，Taq DNA 聚合酶，dNTPs（2.5 mM） 1.3 50×TAE电泳缓冲液 Tris 242 g Na2EDTA·2H2O 37.2 g 加约800 mL去离子水，充分搅拌均匀，加入冰醋酸57.1 mL，加水定容至1000 mL。使用时按1:50用无菌水稀释成1×TAE电泳缓冲液。 1.4 琼脂糖凝胶配制 取琼脂糖按1:100（g : mL）加入1×TAE电泳缓冲液，用微波炉加热至完全溶解，轻轻倒入已插好梳子的电泳槽胶板内，待完全冷却凝固后，拔掉梳子，备用。 1.5 其它试剂 无水乙醇、Loading Buffer、SYBR Green I染色液。 2检测引物 上游引物ZYMV-F：TGCTCAAGGCCGGAACTGT
逆转录PCR原理及步骤
逆转录PCR RT-PCR和逆转录PCR是同义词，已合并。 RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 目录 1mode逆转录PCR 2实时PCR 3RT-PCR技术相关试剂 4PCR各步骤的目的 1 4.1 预变性 1 4. 2 三种循环 1 4.3 延伸时间原因 1 4.4 PCR引物的选择 1 4.5 注意事项 1mode逆转录PCR 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。 2实时PCR 实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅
逆转录-聚合酶链(RT-PCR)实验的具体步骤及方法
逆转录-聚合酶链（RT-PCR）实验的具体步骤及方法 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。 一、总RNA的提取 见总RNA的提取相关内容。 二、cDNA第一链的合成 目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心； 2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min； 3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min； 5．于70℃加热15 min以终止反应； 6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。 三、PCR 1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul； 2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心； 3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照； 4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
高中生物聚合酶链式反应技术
高中生物聚合酶链式反应技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列对于相关实验共性的叙述，错误的是 A．“分离绿叶中的色素”和“胡萝卜素粗品的鉴定”都要用到纸层析法 B．“分离土壤中分解尿素的细菌”和“菊花的组织培养”都要使用琼脂 C．“果酒制作”和“探究酵母菌细胞呼吸方式”都用重铬酸钾检测酒精 D．“分离纯化大肠杆菌”和“分离纯化血红蛋白”都要使用差速离心法 2、（5分）下列关于生物技术应用的叙述，正确的是 A．从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B．作为消化酶使用时，蛋白酶制剂只能以注射的方式给药 C．加酶洗衣粉中酶制剂可以被重复利用，提高了酶的利用率 D．将海藻酸钠凝胶珠用自来水冲洗，可洗去多余的CaCl2和杂菌 3、（5分）下列关于PCR技术的叙述，错误 ．．的是 A．PCR技术的基本原理是DNA双链复制 B．每次循环可分为变性、复性和延伸三步 C．参与PCR的物质有引物、酶、脱氧核糖、模板等 D．一个模板DNA分子第n次循环需要2n-1对引物 4、（5分）平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是 A．采用平板计数法获得的菌落数往往多于实际的活菌数 B．平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C．稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基中进行培养 D．与平板划线法相比，稀释涂布平板法形成单菌落的效果更好 5、（5分）关于电泳的说法不．正确的是 A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C．蛋白质在醋酸纤维薄膜上的移动速度取决于它所带净电荷的多少 D．电泳后需经染色、漂洗和脱色，才可长期保存 6、（5分）下列关于“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是 A．酵母菌、菜花和猪的成熟红细胞都可作为提取DNA的材料 B．在酒精溶液中，某些蛋白质的溶解度比DNA大 C．在研磨植物细胞时加入洗涤剂是为了溶解DNA D．在50～60 ℃的水浴中，DNA遇二苯胺试剂后即呈蓝色 7、（5分）PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是 A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用 B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加 C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，循环3次后，在形成的子代DNA 中含有15N标记的DNA占25% D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变 8、（5分）下列哪些是进行PCR扩增所必需的条件 A．限制酶 B．DNA连接酶 C．Taq酶 D．解旋酶 9、（5分）下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是 A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNA B．纤维素酶是细胞工程中常用的工具酶，可获得单个动物细胞 C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种 10、（5分）“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在P CR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个： A．2 B．4 C．6 D．8 11、（5分）生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是 A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质 C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离 D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同 12、（5分）要将菊花茎段细胞培养成完整的植株，无需 A．选用生长旺盛的嫩枝 B．离体状态并且具有完整细胞核的细胞 C．导入外源基因
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法中常见的污染问题及对策
反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法中常见的污染问题及对策 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来RT-PCR技术被广泛应 用于人和动物的多种传染病早期诊断。 笔者一直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR实验方 法过程中出现的一些常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。RT-PCR实验有三步：提取RNA、反转录（RT）、PCR扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面： 1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间；样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污 染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也会损害操
作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。 2、RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。 3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做RT-PCR实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一RT-PCR试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。 4、操作人员污染只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。任一种科学的实验方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR方法也不例外，在检测质量能保证
聚合酶链式反应(PCR)基本操作步骤
聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR 在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针； (2) 由少量mRNA生成cDNA文库； (3) 从cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以进行序列测定； (5) 突变的分析； (6) 染色体步移； (7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备 1. DNA模版 2．对应目的基因的特异引物 3．10×PCR Buffer 4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶 二、操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶（2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s →58℃30s →72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。 3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。