taqman荧光定量pcr
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北京万方软件股份有限公司
2014-07-10
报告目录
报告核心要素......................................................................................................... I
一、主题简介 (1)
二、主题相关科研产出总体分析 (1)
2.1 文献总体产出统计 (1)
2.2 学术关注趋势分析 (2)
三、主题相关科技论文产出分析 (2)
3.1 中文期刊论文 (2)
3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2)
3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3)
3.1.3 发文较多期刊 (4)
3.1.4 发文较多的机构 (4)
3.1.5 发文较多的人物 (4)
3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4)
3.1.7最近相关中文期刊论文 (5)
3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6)
3.2 学位论文 (7)
3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7)
3.2.2 学位论文增长趋势 (8)
3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8)
3.2.4 发文较多的机构 (9)
3.2.5 发文较多的人物 (9)
3.2.6 最近相关学位论文 (9)
3.3 中文会议论文 (10)
3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10)
3.3.2 中文会议论文增长趋势 (11)
3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11)
3.3.4 发文较多的机构 (12)
3.3.5发文较多的人物 (12)
3.3.6最近相关中文会议论文 (13)
3.4 外文期刊论文 (13)
3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (13)
3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (14)
3.4.3 最近相关外文期刊论文 (14)
3.5 外文会议论文 (15)
I
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
【定量数据分析】荧光定量PCR_完整版
08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
2008 年螺旋课堂的课程计划！
2007 年已悄然逝去，2008 年已向我们扑面而来。08 年是共和国发展的关键 一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提 供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达 到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还 将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。 为此，螺旋课堂 08 年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程 设置。具体安排如下： 第一期：荧光定量 PCR 技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC 库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析
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实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
TaqMan实时荧光定量RT
TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测ERCC1变异剪接体 检测平台的建立 前言 对一个基因的各个变异剪接体分别进行精确定检测是深入研究变异剪接的基础。在TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术( TaqMan real-time quantity RT-PCR)出现前，传统的检测方法有4种[1, 2]：（1）Northern blot; (2)核酶保护分析；（3）相对定量RT-PCR，（4）竞争定量RT-PCR这些方法都有其内在的局限性。Northern blot耗时，随时面临RNA降解的困扰，而且灵敏度不高，需要相对大量的RNA 才能检测出来，仅仅适合相对定量分析[3]。核酶保护分析比Northern blot相对灵敏，但是仍然耗时而且需要相对大量的RNA才方便检测[4-8]。相对定量RT-PCR 则需要在每个反应的指数扩增期停止反应后进行凝胶电泳分析，由于每个样本的起始拷贝数不一致，很难确保每个样本均处于相同的指数扩增期。而且此方法需要将PCR产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，增加了步骤，而且增加了污染的可能性[9]。竞争定量RT-PCR则需要根据不同的目的基因片断构建相应的竞争子，然后需要确定每个反应体系中竞争子和目的基因的不同比例，不仅仅耗时而且繁琐，更重要的是竞争子的构建不仅仅需要很大的技巧性，而是是一件极其艰难的工作[10, 11]。这些传统技术不仅繁琐耗时，而且对mRNA的质量要求较高，结果不稳定。而且，这些传统的方法由于方法学上的差异性，导致研究结果不十分可靠，各研究机构之间的结果差异较大。 应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术则可以分别精确检测各个变异剪接体的表达量，结果稳定，可重复性高，方便快捷，程序简单，无需后续处理，几无污染[1, 12-14]。本研究拟建立对切除修复交叉互补基因1即ERCC1（excision repair cross-complementation group 1）变异剪接体的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测平台，为深入研究ERCC1的变异剪接奠定基础[15]。 TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术的基本原理是通过设计与目的序列互补的一段寡核苷酸作为TaqMan探针，在此探针的5’端标记报告基团（如FAM），
taqman荧光定量pcr
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报告目录 报告核心要素......................................................................................................... I 一、主题简介 (1) 二、主题相关科研产出总体分析 (1) 2.1 文献总体产出统计 (1) 2.2 学术关注趋势分析 (2) 三、主题相关科技论文产出分析 (2) 3.1 中文期刊论文 (2) 3.1.1 近十年中文期刊论文分布列表 (2) 3.1.2 中文期刊论文增长趋势 (3) 3.1.3 发文较多期刊 (4) 3.1.4 发文较多的机构 (4) 3.1.5 发文较多的人物 (4) 3.1.6 核心期刊分布数量对比 (4) 3.1.7最近相关中文期刊论文 (5) 3.1.8被引较多的相关期刊论文 (6) 3.2 学位论文 (7) 3.2.1 近十年学位论文年代分布列表 (7) 3.2.2 学位论文增长趋势 (8) 3.2.3 硕博学位论文数量对比 (8) 3.2.4 发文较多的机构 (9) 3.2.5 发文较多的人物 (9) 3.2.6 最近相关学位论文 (9) 3.3 中文会议论文 (10) 3.3.1 近十年中文会议论文年代分布列表 (10) 3.3.2 中文会议论文增长趋势 (11) 3.3.3 中文会议论文主办单位分布 (11) 3.3.4 发文较多的机构 (12) 3.3.5发文较多的人物 (12) 3.3.6最近相关中文会议论文 (13) 3.4 外文期刊论文 (13) 3.4.1 近十年外文期刊论文年代分布列表 (13) 3.4.2 外文期刊论文增长趋势 (14) 3.4.3 最近相关外文期刊论文 (14) 3.5 外文会议论文 (15) I
猪肺炎支原体P97TaqMan_BHQ荧光定量PCR检测方法的建立及应用
中图分类号：Ｓ ８５２．６２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７３－４６９６（２０１２）１２－１２６８－ ０５猪肺炎支原体Ｐ９７ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量 ＰＣＲ检测方法的建立及应用 武昱孜１，靳蒙蒙１，２ ，白方方１，张 旭１，华利忠１，雷治海２，邵国青１＊ （１． 江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 ２１００１４；２．南京农业大学动物医学院，江苏南京 ２１００１４ ） 摘要：根据猪肺炎支原体（Ｍｈｐ）Ｐ９７基因的保守序列设计合成了引物和Ｔａｑ Ｍａｎ－ＢＨＱ探针，建立了快速检测Ｍｈｐ的ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ荧光定量ＰＣＲ方法。结果显示，该方法特异性良好，与其他病原不发生交叉反应；最低检测限可达１０ｃｏｐｉｅｓ／μ Ｌ，敏感性高；不同梯度定量模板的拷贝数的对数值与Ｃｔ值之间的线性关系表达式为Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，有良好的线性关系，标准曲线的相关系数为０．９９７，扩增效率为９５．８５％，重复性良好。对江苏省某猪场的４８份猪肺组织进行荧光定量ＰＣＲ检测，结果有４３份肺组织呈现阳性，阳性检出率为８９．５８％，比巢式ＰＣＲ的敏感性高。表明，该检测方法能用于Ｍｈｐ的快速检测， 可对猪支原体肺炎的早期诊断和流行病学调查提供新的技术手段。 关键词：猪肺炎支原体；Ｐ９７基因；荧光定量ＰＣＲ；Ｔａｑ Ｍａｎ－ＢＨＱ探针Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｐ９７ＷＵ Ｙｕ－ｚｉ １，ＪＩＮ Ｍｅｎｇ－ｍｅｎｇ１，２，ＢＡＩ Ｆａｎｇ－ｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｘｕ１，ＨＵＡ Ｌｉ－ｚｈｏｎｇ１ ， ＬＥＩ Ｚｈｉ－ｈａｉ ２，ＳＨＡＯ Ｇｕｏ－ｑｉｎｇ １（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏ－ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００１４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２ １００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏ－ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍｈｐ）Ｐ９７ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｎｄ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｈｐ．Ｉｎ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔ Ｍｈｐ，ａｎｄ ｈａｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｓｗｉｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｌｉｎｅａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎ－ｔｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １０１ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ｔｏ １０７ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ １０ｃｏｐｉｅｓ／μＬ．Ｔｈｅｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ Ｃｔ＝－３．４２６×ｌｇ（ｃｏｎｃ）＋４３．３４３，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｗａｓ ０．９９７，ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ９５．８５％ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ ４８ｐｉｇ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ８９．５８％．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｈｐ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒ ｅｐｉ－ｄｅｍｉｃ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆ ｓｗｉｎｅ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｓｔｕｄｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；Ｐ９７ｇｅｎｅ；ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ＴａｑＭａｎ－ＢＨＱ ｐｒｏｂｅ 猪支原体肺炎（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａ ｏｆｓｗｉｎｅ，ＭＰＳ） 又称“气喘病”，是由猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐ ｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）引起的一种慢性接触性传染病，以高发病率和低死亡率为特点，世 收稿日期：２０１２－０６－２８；修回日期：２０１２－０９－ ２９基金项目：江苏省农业自主创新基金项目［ＣＸ（１１）２０５９］；国家自然科学基金项目（３１１００１３５）作者简介：武昱孜（１９８４－） ，女，山西太谷人，硕士。＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：８４３９１９７３＠１６３．ｃｏｍ中国兽医科学 ２０１２，４２（１２）：１２６８－ １２７２Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒
TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒使用说明书 （Cat#Yu-R01-2） 【产品介绍】 TaqMan荧光探针的5’末端连接荧光基团，而淬灭剂则在3’末端。PCR扩增时在加入引物的同时加入特异性的荧光探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。本公司专利技术生产的TaqMan探针荧光定量PCR反应试剂盒含有荧光增强剂，对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果，灵敏度高，结果可靠，性能优良，在许多性能上完全超越国外同类产品。 【产品特点】 1. 适用于使用Taqman-TAMRA和Taqman-BHQ1等探针的实时荧光定量PCR，对FAM、HEX和VIC等荧光物质的有明显的荧光增强效果。结合本公司的各种游离DNA提取试剂盒（Cat#Yu-CF-01-1，Cat#Yu-CF-01-2，Cat#Yu-CF-02-1，Cat#Yu-CF-02-2），可以进行游离DNA的定量检测。 2. 灵敏度高：本产品的扩增效率明显高于进口产品（图1）。 3. 稳定性好：本产品重复好，CV值<2%。 4. 操作简单：只需在反应体系中加入引物、探针、模板和ROX。 5. 本产品使用热启动酶，可以进行Hot Start法PCR反应。 6. 本产品无本品无OSHA规定的危险物品，安全无化学污染。 【适用仪器】 Thermal Cycler系列荧光定量PCR仪、Applied Biosystems系列荧光定量PCR 仪、Roche Diagnostics LightCycler系列荧光定量PCR仪、Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System等。
荧光定量PCR的概述
Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM@StepOne TM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon系列；StratageneMx TM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene 系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。 二、Real-time qPCR概述 1. Real-time qPCR原理 实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。 常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。 2. Real-time qPCR的数学原理
TaqMan法进行实时定量PCR鉴定
3.3 TaqMan法进行实时定量PCR鉴定 较普通PCR而言，实时定量PCR有更高的灵敏度，因此需要进一步优化反应条件。PCR反应在Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System (ABI公司仪器)sequence detector中进行。采TaqMan法进行绝对定量ρ0 HeLa细胞中mtDNA 的拷贝数。 3.3.1荧光定量试剂及探针 (1) Premix Ex Taq TM (Perfect Real Time)，购自宝生物工程（大连）有限公司。 (2) PCR 反应引物以及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。 3.3.2构建质粒标准品的目的片段的扩增及纯化 本试验对以往所报道拷贝数的文献进行了筛选，通过比较选用了常用的核基因中的β-actin基因做为的参照，Cox-I基因做为正常线粒体基因[40]，其中β-actin基因的引物为实时荧光定量的引物，Cox-I基因的引物则为本实验室扩增线粒体全序列的引物中的第九对引物[41]。引物所在位置、引物序列、目的片段的长度以及复性温度见表6。引物处理、PCR试剂、反应体系等同前面扩增PCR，复性温度依据表6。扩增目的片段并纯化之后与T载体连接。 引物名称引物位置引物序列（5’→3’）目的片段长度复性温度β-actin F 1997-2017 ACCCACACTGTGCCCATCTAC 107 bp 58 ℃β-actin R 2103-2081 TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA Cox-I F1 5835-5855 GAGGCCTAACCCCTGTCTTT 827 bp 59 ℃Cox-I R1 6661-6642 ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT 表6 F表示正向引物，R表示反向引物。β-actin F与β-actin R用于扩增β-actin基因的一段区域缺失区域，引物序列同荧光定量时引物序列；Cox-I 1 F与Cox-I R1用于扩增Cox-I基因的一段序列。 3.3.3感受态的制备（于超净工作台无菌条件下及冰上操作） (1) 取上述1 ml培养液于1.5 ml EP管。 (2) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。 (3)加入100 μl冰中预冷的Solution A，轻轻弹动使沉淀悬浮（可轻轻吹打）。 (4) 4 ℃ 4000 rpm 离心5 min，弃上清。 (5) 加入100 μl 冰中预冷的Solution B, 轻轻弹动使沉淀悬浮。 (6) 感受态细胞制作完成（可直接用于DNA转化实验或-80 ℃保存，以备后用）。 3.3.4目的DNA片段的连接及感受态细胞的DNA转化 (1) 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，总量为5 μl。 pMD TM 18-T Vector 1 μl Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol dH2O 补至5 μl
TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展
TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展 姜文灿，岳素文，江洪，王成彬 姜文灿，温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。 [摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性。然而，这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。 [关键词] 实时荧光定量PCR ；TaqMan 探针；引物二聚体；内标系统 [中图分类号] R446.6-3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR [Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect. [Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC [作者简介] 姜文灿，2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术 [作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院（姜文灿，王成彬）；100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司（岳素文，江洪） [通讯作者] 王成彬，E-mail ：wangcb301@https://www.360docs.net/doc/922437561.html, 聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术，最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式，相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍，同时又因操作简便，成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的，继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段， TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。 1 TaqMan 探针法简介 1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7]，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光（图1），经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8]，荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现，BHQ 本身具有非常低的荧光背景，实用性
荧光定量PCR的原理及使用
荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR GreenⅠ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR GreenⅠ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法 是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步