细胞冻存方法及步骤
4、按下列顺序依次降温：室温→4℃20min →-20℃30min →-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜，再转至液氮罐内。注意程序降温
盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要跟换一次，以免影响冻存效果。
5、冻存细胞后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存的方法与步骤 细胞冻存是一种常用的实验室技术，用于保留细胞的生物学特性和遗 传信息，以备将来的实验或应用。下面是细胞冻存方法和步骤的详细说明。 一、选择细胞种类和培养基 1.选择要冻存的细胞种类，例如哺乳动物细胞、细菌或真菌等。 2.根据细胞种类和生长特性选择适合的培养基。常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。 二、制备冻存试剂和材料 1.冻存试剂：含有冷冻保护剂的冻存液。常用的冻存液成分有细胞培 养基、血清、DMSO（二甲基亚砜）等。 2.安全材料：包括手套、护目镜、口罩等，用于保护实验人员的安全。此外，还需要准备液氮容器或冰箱进行冻存。 三、细胞处理步骤 1.细胞预处理：将培养的细胞从培养瓶中取出，用生理盐水或PBS （磷酸缓冲盐水）洗涤去除残留物。 2.细胞计数：用显微镜和细胞计数仪来测量细胞的数目和浓度。 3.体积调整：根据所需的冻存密度和分装容器的大小，确定冷冻保护 剂（如DMSO）的浓度和添加体积。 4.混合：将细胞悬液和冷冻保护剂轻轻地混合均匀。 5.分装：将混合物分装到冻存小管或冻存盒中。
6.封闭：使用不透气的盖子或密封膜封闭冻存管或盒。 四、冷冻过程 1.控制冷冻速度：冷冻速度是细胞冻存过程中一个非常关键的因素。 常用的冷冻速度是每分钟1摄氏度以下，最佳速度约为每分钟1-2摄氏度 以下。 2.冻存程序：使用冻存机或其他冻结设备进行控制冷冻，以确保温度 降到适合储存细胞的温度。一般常用的冻存温度为-80摄氏度或液氮温度（-196摄氏度）。 五、储存和解冻 1.储存：冷冻管或盒应存放在专用的液氮罐中或冷冻设施中，避免频 繁开启，以防止温度波动和冻存液的液态氮蒸发。 2.解冻：在需要使用时，将细胞冷冻管或冻存盒快速解封到37摄氏 度恢复细胞的活性。同时，快速将冰冻的细胞悬液转移到预暖的培养基中，以避免冷休克对细胞的伤害。 以上是细胞冻存的一般方法和步骤，实际操作时还要根据具体细胞类 型和实验要求进行相应的调整和优化。细胞冻存保留了细胞的生物学特性 和遗传信息，为细胞的长期保存和应用提供了保障。
细胞冻存
（一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 （二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。 细胞冻存操作步骤与细胞复苏 细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。 细胞冻存操作步骤： 细胞1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。 细胞2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。
细胞冻存步骤
细胞冻存步骤 细胞冻存是一种常用的生物技术方法，它可以长期保存细胞并保 持其原有性状和功能。细胞冻存技术在医学研究、药物开发以及动物 繁殖等领域都具有广泛的应用。下面将介绍细胞冻存的步骤及其注意 事项。 细胞冻存的步骤通常分为准备工作、细胞处理和冻存保存三个阶段。 一、准备工作 在进行细胞冻存之前，需要准备好以下器材和试剂：离心管、细胞培 养基、冷冻保护剂、离心机、液氮罐等。同时，还需要保证实验室环 境的清洁和无菌。 二、细胞处理 1.培养细胞 首先，将需要冻存的细胞培养在新鲜的培养基中，使其增殖到适当的 密度。 2.收集细胞 当细胞达到适当的密度后，用无菌吸管将细胞悬浮液收集到离心管中。注意避免细胞接触到外界环境。 3.离心 将收集到的细胞悬浮液进行离心，以去除培养基和细胞碎片。离心条 件通常为2000rpm离心5分钟。 4.溶解和冻存液添加 用适量的冷冻保护剂（如甘油、二甘醇等）将离心后的细胞沉淀悬浮 均匀，以提高细胞的冷冻存活率。 5.分装冻存 将细胞悬液分装到多个离心管中，并确保每个离心管内细胞悬液的容 量相同。尽量避免气泡的产生，以防止细胞的机械损伤。 6.冷冻过程
将分装好细胞悬液的离心管迅速放入液氮罐中，进行快速冷冻。快速 冷冻的目的是防止细胞内的水结晶导致细胞损伤。冷冻过程中，温度 不得超过-80℃。 三、冻存保存 细胞冻存后，离心管应封闭严实，并在液氮罐中保存。为了保证细胞 的长期保存，液氮罐应保持在恒定的低温环境下，一般为-196℃。同时，还需定期监测液氮罐的温度，以确保冷冻细胞的质量不受影响。 细胞冻存的注意事项： 1.选择适当的培养基和冷冻保护剂，以提高细胞的存活率。 2.严格控制细胞的密度，避免过度或过低，影响冷冻效果。 3.注意细胞的无菌操作，避免细菌或病毒的污染。 4.在快速冷冻过程中，细胞悬液应均匀分布，尽量避免细胞的损伤。 5.定期监测液氮罐的温度，确保冷冻细胞的质量不受损害。 细胞冻存技术的应用前景广阔，可以帮助科学家长期保存各种细 胞种类，为科研实验提供便利。此外，细胞冻存还有助于细胞的移植 和繁殖，对动物繁殖和保护也起到重要作用。 综上所述，细胞冻存是一项重要的生物技术，其步骤包括准备工作、细胞处理和冻存保存。在进行细胞冻存时，需要注意培养基和冷 冻保护剂的选择，细胞密度的控制以及冷冻过程中的操作技巧等方面。细胞冻存技术的应用前景广阔，将为科研实验和动物繁殖等领域提供 有力支持。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、冻结方法与细胞计数之袁州冬雪创作 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保管 1.资料： 生长杰出之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保管管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保管方法： （1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存. -20℃不成超出1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步调直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些. （2）程序降温：操纵已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma之保管. 3、步调： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期. （2）配制冷冻保管溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用. （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率. （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合平均，分装于已标示完全之冷冻保管管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞称号、代数、日期.然后停止冻存. 4、注意事项： （1）欲冷冻保管之细胞应在生长杰出(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保管前一至二日测试是否有抗体之发生. （2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保管数月. （3）注意冷冻呵护剂之品质.DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保管，勿作多次冻结.Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保管.在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性.本方法中先制备双倍冻
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数之杨若古兰创作 江苏大学附属病院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保管 1.材料： 生长良好之培养细胞、新颖培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保管管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保管方法： （1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase持久储存. -20℃不成超出1小时，以防止胞内冰晶过大，形成细胞大量死亡，亦可跳过此步调直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些. （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase持久储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma之保管. 3、步调： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生持久. （2）配制冷冻保管溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用. （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率. （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最初浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完好之冷冻保管管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作净化检测.紧密封口后，注明细胞名称、代数、日期.然后进行冻存. 4、留意事项： （1）欲冷冻保管之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之形态，约为80～90％致密度.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保管前一至二日测试是否有抗体之发生. （2）细胞在液氮中可持久冻存无穷时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保管数月. （3）留意冷冻呵护剂之品质.DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保管，勿作多次解冻.Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保管.在开启后一年内使用，因持久储存后对细胞会有毒性.本方法中先制备双倍冻
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数之马矢奏春创作 江苏大学从属病院风湿科李晶〖前去主页〗 一、细胞冷冻保管 1.材料： 成长优胜之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保管管(Nalgene5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保管方法： （1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存. -20℃不成超出1小时,以避免胞内冰晶过大,造成细胞大量去世亡,亦可跳过此步调直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些. （2）程序降温：运用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma之保管. 3、步调： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数成长期. （2）配制冷冻保管溶液(运用前配制)：另取一离心管,参加培养基、血清,逐滴参加二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用. （3）离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率. （4）取与细胞悬液等量的冻存液,迟缓逐滴参加细胞悬液,并晃荡试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％）,使细胞浓度为1～5×106cells/ml,混淆平均,分装于已标示完整之冷冻保管管中,1～2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后,注明细胞名称、代数、日期.然落伍行冻存. 4、留心事项：