细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：
1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：
1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞冻存及复苏
基本原理： 在长期的细胞培养过程中可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，会导致具有优良特性细胞系的丢失。为防止这些细胞的丢失，细胞可以经快速冷冻并几乎无限期保存在非常低的温度下，如液氮（-176℃）。 试剂和设备： ∙冷冻液: 90%灭活血清+10%DMSO（或甘油），用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存； ∙培养液； ∙台盼蓝溶液（0.4%溶解于PBS）； ∙70%乙醇； ∙组织培养瓶； ∙15-50 ml 无菌圆锥底离心试管； ∙离心机； ∙血球计数板； ∙超净工作台； ∙光学显微镜； ∙37℃水浴； ∙冷冻管； ∙-80℃冰箱； ∙液氮和液氮容器。 操作步骤： （一）冷冻细胞 1．收集对数生长期细胞； 2．以25μl台盼蓝溶液稀释25μl细胞悬液；用血球计数板计数并计算细胞存活率（至少应该在90%以上）； 3．细胞悬液在4℃ 条件下200´g离心10分钟； 4．将沉淀的细胞重新悬浮在冷冻液中（大约5´106细胞/0.5 ml 冷冻液）； 5．将细胞悬液加入到冷冻管中，每管0.5 ml； 6．将冷冻管置于-80℃冰箱中； 7．24小时后，将冷冻管移入液氮罐中； 8．在记录本或电脑中记录下每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 （二）细胞复苏
1．将冷冻管迅速由液氮转入到37℃水浴中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免任何污染，不定时搅拌加速解冻； 2．当细胞完全解冻后，用含70%乙醇的纱布擦拭冷冻管消毒； 3．将解冻后细胞转移到含4℃预平衡培养液的试管中； 4．细胞悬液在4℃下200´g离心10分钟； 5．弃上清，将细胞重新悬浮在新鲜培养液中； 6．将细胞转移到细胞培养瓶，CO2孵箱中培养； 7．是用倒置显微镜检查细胞存活率以及细胞密度，如果细胞密度过高，用培养液稀释至适宜浓度。 对照试验 在冷冻细胞被移入到液氮罐中一段时间后，取出一管细胞复苏并进行培养以检测存活率。 实验要点及说明： 1．严格遵守液氮操作规则（即戴上合适的手套和护目镜），液态氮对眼睛极为有害； 2．对一瓶细胞培养液要尽可能多分装几个冷冻管； 3．延长暴露在DMSO中的时间对细胞有害，因此冷冻和解冻操作要尽可能快； 4．细胞可以暂时稳定保存在-80 ℃达数月； 5．每批次冷冻和复苏的细胞的存活率可能会不相同，为避免这个问题，每次细胞冻存最好分两批以上进行； 6．DMSO可以防止在细胞内部出现冰结晶，冻存过程需要逐步降低温度； 7．如果复苏后细胞难以恢复到良好状态，可以使用含10%鼠胚胎成纤维母细胞培养上清的培养液以促进恢复； 8．也可以用含20%热灭活胎牛血清和10%DMSO的培养液为冷冻液。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤 细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。技术原理： 细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。具体原理如下： 1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。 2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。 操作步骤： 下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤： 1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。 2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。首先，用培养基洗 涤细胞，去除残留的培养基。然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。 4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化 冰晶。将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。然后， 用离心机离心，除去冻存液或保护剂。最后，加入适当的培养基，将细胞 继续培养。 5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严 格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。 总结： 细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保 持其生理活性。通过控制好冷冻和复苏的操作步骤，加入适当的保护剂， 可以有效降低细胞损伤，保证细胞的存活率和生活特性。细胞冻存与复苏 技术的应用，对于细胞学研究和细胞工程等领域都具有很大的意义。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 一、细胞的冻存 （一）仪器、用品与试剂 细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。 （二）方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消
化。 3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。 （三）注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。 二、细胞的复苏 （一）仪器、用品与试剂 37℃水浴锅、离心机、离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。
细胞冻存及复苏
细胞冻存及复苏（慢冻快融） 一、材料： 1、试剂：冻存液（90% FBS + 10% DMSO）、0.25%胰酶。 2、用品： 冻存用：吸管（直、弯）、冻存管、血细胞计数板、显微镜、-80℃冰箱。 复苏用：烧杯、温度计，细胞培养常规试剂及器材。 二、方法： 1、冻存： 取细胞90%融合的培养瓶，弃去培养液，加入0.25%胰酶0.5ml消化2～3min，镜下观察，待细胞皱缩变圆后倒去胰酶，以冻存液1.5～2ml中和以中止消化。 吹打瓶底的每一个角落，注意不要产生气泡。待细胞基本全部吹打下来后，将吸管插入液面下，反复吹打20～30次，以制成单细胞悬液。 将细胞转移至冻存管中，在4℃放置30min，-20℃放置2h预冻，以多层脱脂棉充分包裹后放入-80℃冰箱中保存。2w后可去掉包裹继续冻存。 注意：细胞浓度>106/支，可将2瓶75ml细胞冻在一管中。 2、复苏： 取冻存管，立即投入39℃水中使之融化。放入无菌室后，外壁消毒，吸出冻存液以十倍培养液稀释，接种于培养瓶中。加培养液的时候要缓慢的加入，以减少渗透压的急剧变化造成细胞的死亡。 如离心：先将培养基加入离心管大约8ml，然后将细胞冻存液滴在培养基液面上，然后离心，因为细胞重，被离心到底部了，而DMSO都还是在上清液里面，弃上清，重悬细胞加入培养瓶培养。 三、注意事项： 1、细胞冻存： （1）最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好。不要选择细胞状态不好时冻存（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变）。 （2）细胞浓度：冻存时细胞浓度低于1～5×106/ml时复苏很难成功。可以离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞） （3）盖子要紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。（4）选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。单薄的冻存盒因壁太薄，细胞会被迅速降温。 （5）不要在-80℃放置太久，时间不宜超过半年。（冰箱的温度难以恒定：开门/关门，电压不稳等），应尽快转入液氮。 （6）应保证细胞全部浸在液氮液面下。 （7）每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。 2、复苏： （1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。 （2）水浴时间不可太长：适当提高水浴温度（37度～40度），要是冬天，就选用保温盒。 （3）冰盒内时间不宜太长：复苏1h内应加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）。 （4）有些细胞复苏后一星期才有起色，不要换液，耐心等待两周后再做决定。
细胞冻存与复苏技术
细胞冻存与复苏技术 概述 细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0— 196 o C 进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有 -20~-40℃ 冰箱保存、-60~-80℃深低温冰箱和液氮(一196℃)超低温保存等。 应用方向 1.医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2.生物学方面 细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。 发展历史 1. 1776年．Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代 Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972年．Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。 这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 同时随着温度的下降．细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。 细胞冻存的方法步骤： 1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。 2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。 3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。 4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。 5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。 6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。 细胞复苏的方法步骤： 1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。 3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。 4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。 细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤 细胞的冻存 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、细胞冻存操作步骤： 1)冻存液：10%DMSO/90%FBS的混合液。 2)每支冻存管2ml冻存液。每个10cm的培养皿一般分4管冻存。 3)程序冻存盒。 选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶， 4)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将培养皿中的细胞培养液去掉， 用0.25% 胰蛋白酶消化，适时去掉胰蛋白酶，吸取预冷的PBS4.5ml来重悬浮细胞。 5)吸取4°预冷的DMSO1m与FBS4.5lml在试管中混匀，称之A液。 6)将A液与细胞上述悬液混匀即形成10%DMSO/90%FBS的混合液，吸取2ml移入冻存管， 盖紧。 7)冻存管表明细胞及代数、冻存日期、冻存者、冻存支数，放入冻存盒，置80°冰箱 过夜。次日转入液氮罐。并登记好所存的位置。 8)细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细 胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。 三、常用冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤 一、细胞冻存步骤 1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。确保细胞在保存前是健康和活跃的。 2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供 细胞生长和增殖。 3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减 少冷冻过程中对细胞的伤害。 4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。常见的冷冻介质包 括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。 5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管 或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。 6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。 二、细胞复苏步骤 1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。培养基 通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。 2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴 中解冻，避免长时间暴露在室温。 3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。 4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。 6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。 1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。 2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。 3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。 4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。 细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。在未来，随着技术的不断完善和应用的广泛推广，我们可以更好地利用这项技术来促进科学的发展和社会的进步。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相 比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 一、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶 性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应 快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 二、慢冻程序 1、标准程序：采用细胞冻存器 当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min； 当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min； 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。 2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃ 的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。 3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16 ~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。 三、低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分 在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰 晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法 1、预先配制冻存液 10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹 打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml） 3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 液氮长期保存 五、保存细胞的复苏方法 1、快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管， 使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 2、解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接 进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。 3、如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生 长培养液的培养瓶中。
细胞复苏、传代、冻存过程
一、细胞培养（复苏、换液、传代、冻存）（已正） 进行细胞培养前，将所用物品放入超净台中，打开紫外开关，照射20-30分钟。紫外结束后，打开鼓风，使超净台自净5-10分钟左右后开始操作。 1.细胞培养液的配制： 配制50ml培养液(45ml基础培养液+5ml的胎牛血清+500ul的青霉素/链霉素)（如果基础培养基中自带青/链霉素就无需添加） 2.细胞复苏： 将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解，大约1min。将溶解好的细胞冻存管喷上75%的乙醇消毒后拿到超净台中，用1ml的无菌大枪头将其混匀后转移至无菌的15ml离心管中，这时向其中缓慢滴加配好的培养液2ml，混匀，1000rpm, 3分钟。然后弃掉上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。（将细胞冻存管从液氮或者-80℃取出后迅速置于37℃水浴箱中水浴，不停地晃动使其迅速溶解。1000rpm, 离心3分钟。弃掉上清，然后加入1ml配置好的培养基使沉淀的细胞重悬。此时将其转移到T25瓶内，再加入4ml配好的培养基，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。） 3.细胞换液： 复苏的细胞在37℃ 5%CO2的孵箱内孵育4-6个小时后就应该给细胞换液，去除未贴壁的死细胞（贴壁生长的细胞）。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入5ml新鲜培养基，喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。悬浮生长的细胞具体过程如下:将培养瓶内的培养液混匀，用1ml无菌的大枪头将培养液小心的转移至15ml 无菌的离心管中，1000rpm,3分钟去上清，加入1ml配制好的培基使沉淀的细胞重悬。在T25的培养瓶中加入4ml配好的培养基，然后用1ml无菌的大枪头将重悬好的细胞转移至T25瓶内，使用十字混匀的方法将瓶内的细胞铺匀，从超净台中将T25取出，拿到倒置显微镜下观察细胞是否铺匀，如铺匀了喷上75%的乙醇，放入37℃ 5%CO2的孵箱内。 4.细胞传代： 当细胞生长到80%-90%时，其的生长状态和细胞形态都比较好时，即只要判断细胞处于生长对数期，这时就可以进行细胞传代了。贴壁生长的细胞具体过程如下：将原培养基弃去，然后用高压无菌的PBS冲洗1-2次，每次3-5ml，最后一次洗完后倒掉瓶内残余的PBS，小心的用1ml无菌的大枪头加入1ml 0.25%胰酶消化，放入孵箱，1-2分钟后取出，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，如果观察到细胞开始由长梭形变成圆球形时，喷上75%的乙醇，拿到超净台里，加入2ml培养基终止消化，用1ml无菌的大枪头或无菌的塑料吸管反复吹打，尽
细胞冻存(Cell Freezing)和复苏技术原理和操作步骤
细胞冻存（Cell Freezing）和复苏技术原理和操作步骤 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成 冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可 使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞 仍能生长，活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性， 分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 二、操作步骤 （一）冻存 1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。 7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。 注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。 （二）复苏 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。 3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。 4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。（细胞数量少的情况下，复苏时可省略步骤5。）
简述动物细胞培养过程中细胞复苏传代冷冻的操作方法
简述动物细胞培养过程中细胞复苏传代冷冻的操作方法动物细胞培养是研究和应用生物学领域中非常常见的技术手段。在细 胞培养过程中，细胞复苏、传代和冷冻是非常重要的操作步骤，下面将对 这三个步骤进行详细的描述。 1.细胞复苏： 细胞复苏是指从冷冻的细胞样品中恢复活性的过程。细胞冷冻保存是 为了长期保存和传递细胞系。细胞复苏的基本流程如下： a.准备培养基：首先需要准备适合细胞类型的培养基，培养基中应含 有必需的营养物质和生长因子，以促进细胞的复苏。 b.解冻冷冻细胞：将冷冻的细胞样品快速解冻，并迅速将其转移到预 热的培养基中。解冻过程需要非常迅速，以避免细胞受到冻结引起的损伤。 c.细胞培养：将解冻的细胞转移到预先涂覆有培养基的培养皿中，并 放置在恒温培养箱中进行培养。在培养的过程中，需要定期观察细胞的形 态和增殖情况，以确定细胞是否成功复苏。 2.细胞传代： 细胞传代是指将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中继续培养的 过程。细胞传代的主要目的是扩大细胞数量，以满足后续实验的需要。细 胞传代的基本流程如下： a.细胞解聚：在细胞的解聚过程中，常用的方法是使用酶类（如胰蛋 白酶）对细胞进行消化，以将细胞从培养皿表面解离下来。
b.细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。细胞密度的控制非常重要，过高或过低都会影响细胞的生长和增殖。 c.接种细胞：根据细胞密度的要求，将细胞解聚后的适量细胞转移到新的培养皿中，加入适量的培养基，并轻轻摇晃培养皿以均匀分布细胞。 d.细胞培养：将接种过的细胞培养皿放置在恒温培养箱中进行培养。在培养的过程中，同样需要定期观察细胞的形态和增殖情况，以控制细胞的状态和密度。 3.细胞冷冻： 细胞冷冻是为了长期保存和传递细胞系而进行的操作步骤。细胞冷冻的基本流程如下： a.细胞准备：选择处于良好状态的细胞进行冷冻。此时，细胞应处于对冻结过程耐受的阶段，生长状态良好。 b.细胞解聚：将细胞从培养皿表面解离下来，常用的方法是使用酶类对细胞进行消化。 c.细胞计数：使用细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。 d.低温悬液制备：将细胞悬浮在冷冻保护剂中，冷冻保护剂中含有适当的添加剂以保护细胞在冻结过程中受到的损伤。 e.分装冷冻：将细胞悬液转移到冷冻管中，并在适当的冷冻速率下进行冷冻。冷冻速率的选择非常重要，过快的冷冻速率会造成细胞内冰晶形成，损伤细胞结构。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏 1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。 2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。 3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。可选择不同的分离方法，如以胰酶来切 割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。 4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和 环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。 5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞 的生长曲线和其他相关信息。 6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当 的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。接着 加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。 7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。 细胞冻存及复苏： 细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物
种多样性。而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。 细胞冻存及复苏的步骤如下： 1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基 和冻存液。 2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞 处于最佳的生长状态。 3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。一 般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营 养物质和蛋白质（如血清）等。 4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细 胞培养液中的残留物。然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。 5.细胞冻存速率降低：将分装好的冻存管放入低温环境中，使细胞冻 存的速率逐渐降低，以尽量避免细胞的冷冻伤害。 6.细胞存储：将细胞冻存管转移到液氮罐或液氮低温保存罐中，进行 细胞保存。 7.细胞复苏：需要使用冻存细胞时，将冻存管从液氮保存罐中取出， 并快速解冻在37摄氏度的恒温水浴中。解冻后，立即将细胞转移到培养 皿中加入适宜的培养基，并保持适宜的温度、湿度和CO2浓度。 8.观察细胞复苏：观察细胞复苏情况，记录细胞的复苏率和形态特征，以评估细胞的活性和健康状况。
细胞冻存与复苏
细胞冻存与复苏 细胞冻存与复苏 细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。 细胞的冻存【用品】 （1） 5%胰蛋白酶 （2）含10%~20%血清培养液 （3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】 （1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。 （2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。 （3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。 （4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。 细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。 细胞的复苏 【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】 （1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。 （2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养
细胞复苏的步骤(干货分享)
细胞复苏的步骤 细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规工作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转化。细胞的原代培养和传代培养以及细胞冻存和复苏后都需要细胞计数。 一、细胞冷冻保存ﻫ1、材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO （SiｇmａD-2650）、无菌塑料冷冻保存管(Nalgeｎe 5０00-0０20)、０。4％(w/v）trypan ｂlue（GibcoBRL152５０—061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机（KRYO１０SeriesIＩ）ﻫ2、冷冻保存方法： （1)传统方法: 冷存管置于4℃１0分钟—-—＞—２0℃3０分钟－－—＞－80℃16～１8小时（或隔夜)—-－＞液氮槽vａpｏrｐｈase长期储存。ﻫ-２0℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-８0℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以－1~—3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-１20℃，再放在液氮槽vａpｏrph ａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存. 3、步骤：ﻫ(1）冷冻前24—48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 (2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DＭＳO)至2０％浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用.
(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０．1ml）计数细胞浓度及冻前存活率. （4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSＯ最后浓度为５~10％），使细胞浓度为1～5×106ceｌls／ml，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2ml/vｉal,并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后,注明细胞名称、代数、日期.然后进行冻存。 4、注意事项：ﻫ（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphas ｅ）且存活率高之状态，约为80~90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如ｈyｂridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生. （２）细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-７0度可保存数月。 （３)注意冷冻保护剂之品质。ＤＭＳＯ应为试剂级等级,无菌且无色（以0。22miｃｒon ＦGLＰTelfｌｏn过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D—2６50),以5～1０ｍl小体积分装,4℃避光保存，勿作多次解冻。Glｙceｒoｌ亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免ＤMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DＭSＯ可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用１０％甘油冻存。ﻫ(4）冷冻保存之细胞浓
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏 细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。 实验步骤： 1. 细胞的收集和分装 首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。 2. 冷冻 将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。 3. 冻存的解除和复苏 在复苏前，需要进行以下步骤： ① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。 ② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。 注意事项： 1. 冷冻剂的熟练使用 DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。然而，DMSO也具有一定的毒性。因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。 2. 细胞处理的无菌性 细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。 3. 冷冻剂和液氮的注意事项
冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。在操作过程中，需要戴上 手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的 泄漏。 总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。