细胞冻存操作

细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，适用于细胞研究、药物开发等领域。以下是细胞冻存的操作步骤：

1. 检查细胞的状态和数量，准备无菌的冰冻液和冻存管。

2. 用无菌管器将细胞移入冰冻液中，使细胞在液面上形成单层。

3. 快速将管子放入液氮中，使细胞迅速冻结。

4. 在-80℃冻存，保持细胞稳定。

5. 检查冻存细胞的存活率和冻存液的状态，记录在样品储存册中。

除了以上基本操作步骤，还需注意以下几点：

1. 细胞冻存前应检查细胞是否纯度高，无细菌、真菌等污染。

2. 冻存液的配制需根据细胞种类选择适当的稳定剂、抗生素和营养成分。

3. 冻存液的pH和渗透压需适当调节，以确保细胞在冻存过程中不受损。

4. 细胞冻存后需储存在干燥且低温的环境中，避免受潮和变质。

5. 冻存细胞使用前应在培养皿中解冻并恢复活力。

以上是细胞冻存的操作步骤及注意事项。细胞冻存是一项重要的细胞保存技术，可有效延长细胞的寿命，方便细胞的后续研究和应用。

- 1 -

细胞冻存的方法与步骤

细胞冻存、解冻方法与细胞计数江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗一、细胞冷冻保存 1、材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法：（１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。３、步骤：（1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。（2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。

细胞冻存

（一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 3.3三、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

细胞冻存操作步骤与细胞复苏细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。细胞冻存操作步骤：细胞1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。细胞2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。细胞3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。细胞4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至(1-10)×106/ml。细胞5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。细胞6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。细胞7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。细胞8、按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(－80℃过夜)→液氮。细胞的复苏一、细胞复苏的原则在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。二、细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。 (3)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。三、注意事项在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

细胞冻存方法

冷冻保存方法：（1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤：（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀

细胞冻存的操作步骤

细胞冻存的操作步骤细胞冻存是一种将细胞保存在非常低的温度下，以便长期保存和使用的方法。它被广泛应用于细胞学、生物医学研究和生物技术领域。下面将介绍细胞冻存的操作步骤。 1. 准备工作在进行细胞冻存之前，需要做一些准备工作。首先，准备好培养基和冻存液。培养基是细胞生长和繁殖所必需的营养物质，而冻存液则是用于保护细胞在极低温度下的稳定性。同时，准备好冷冻管、离心机和冷冻盒等实验工具。 2. 细胞培养将需要冻存的细胞进行培养。将细胞分散在含有培养基的培养皿中，放入培养箱中进行培养。培养条件可以根据细胞类型进行调整，一般需要在恒温、恒湿的环境中进行。 3. 细胞准备当细胞达到适当的生长状态后，可以开始进行细胞冻存的准备工作。首先，将细胞从培养皿中取出，用无菌缓冲液洗涤，去除培养基和细胞碎片等杂质。然后，使用显微镜观察细胞的形态，确保细胞的健康和完整。 4. 细胞计数

使用细胞计数仪或显微镜，对细胞进行计数。细胞计数是为了确定细胞的浓度，以便在后续步骤中制备适当的冻存液。确保细胞计数的准确性和可重复性，可以重复计数多次并取平均值。 5. 制备冻存液根据细胞类型和要求，制备适当的冻存液。冻存液通常包含培养基和添加剂，如凝胶剂、血清和甘油等。这些添加剂可以提高细胞在冻存过程中的存活率和稳定性。根据实验要求，可以调整添加剂的浓度和比例。 6. 冻存管标记在进行细胞冻存之前，需要对冻存管进行标记，以便将来识别和使用。在冻存管上标记细胞类型、通行日期和样品编号等信息，确保实验记录的完整和准确。 7. 冻存将冻存液和细胞按照一定比例混合均匀，然后将混合液转移到冻存管中。注意，冻存管要留出足够的空间，以便细胞冻结时膨胀。将冻存管放入冷冻盒中，确保冻存管垂直放置，避免液体泄漏。 8. 冷冻将冷冻盒放入预先冷却好的冷冻盒中，然后将冷冻盒放入-80°C或液氮罐中进行冷冻。冷冻的速度对细胞的存活率和质量至关重要，应尽量快速冷冻。在冷冻过程中，细胞会形成冰晶，需要保护细胞

细胞冻存的方法

一、液氮冷冻保存法细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。注意：细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。细胞培养方法,细胞培养管理,细胞培养技术,细胞培养原理,原代细胞,细胞永生化,生物科技,生物技术支持,细胞冻存,无血清细胞冻存液。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。通常采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂（渗透型），这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。对于一些原代细胞（皮肤细胞），除渗透型保护剂外，还会适当添加表面型保护剂（海藻糖），以提高细胞存活率。二、程序冻存步骤（需梯度降温） 1、配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436； 2、制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；

细胞冻存的操作步骤

细胞冻存的操作步骤细胞冻存是一种将活体细胞保存在极低温度下以延长其存活时间和保持其生物特性的方法。它在细胞培养以及细胞研究中起到了重要的作用。下面将详细介绍细胞冻存的操作步骤。 1. 细胞培养准备在进行细胞冻存之前，首先需要准备好细胞培养的相关设备和材料。包括培养皿、培养液、细胞培养基、离心机、试管、离心管和细胞培养箱等。 2. 细胞培养将待冻存的细胞进行培养，确保其处于良好的生长状态。细胞培养过程中需要注意无菌操作，避免细胞受到污染。 3. 细胞预处理在进行细胞冻存之前，需要对细胞进行预处理。通常会使用细胞凝胶、冷冻保护剂等物质对细胞进行保护，以减少细胞在冷冻过程中的损伤。 4. 细胞收获将培养皿中的细胞用无菌的移液器或离心机收集到离心管中。在收集细胞的过程中，需要注意避免细胞的受损和污染。 5. 细胞计数

使用细胞计数板或自动细胞计数仪对收获的细胞进行计数。细胞计数的目的是确定细胞的浓度，以便后续的处理和保存。 6. 细胞冻存液的制备根据细胞类型和冻存液的要求，选择合适的冻存液进行制备。常用的冻存液包括DMSO（二甲基亚砜）和甘油等。 7. 细胞冻存管的准备将细胞冻存液倒入预先标记好的细胞冻存管中。在倒液的过程中，需要注意保持无菌操作，避免细胞的受到污染。 8. 细胞冻存管的封闭使用密封帽或其他密封装置将细胞冻存管严密封闭，以防止液体的挥发和细胞的受到污染。 9. 细胞冻存管的标记在细胞冻存管上标明细胞的信息，包括细胞类型、保存日期和冻存液的成分等。标记的目的是为了方便后续的定位和使用。 10. 细胞冷冻将封闭好的细胞冻存管放入冷冻容器中，使用逐渐降温的方法进行冷冻。通常会使用冷冻容器和液氮等冷却介质进行冷冻。 11. 细胞存储将冷冻好的细胞冻存管转移到液氮罐或冷冻保存设备中进行长期保

细胞冻存步骤

细胞冻存步骤细胞冻存是一种常用的生物技术方法，它可以长期保存细胞并保持其原有性状和功能。细胞冻存技术在医学研究、药物开发以及动物繁殖等领域都具有广泛的应用。下面将介绍细胞冻存的步骤及其注意事项。细胞冻存的步骤通常分为准备工作、细胞处理和冻存保存三个阶段。一、准备工作在进行细胞冻存之前，需要准备好以下器材和试剂：离心管、细胞培养基、冷冻保护剂、离心机、液氮罐等。同时，还需要保证实验室环境的清洁和无菌。二、细胞处理 1.培养细胞首先，将需要冻存的细胞培养在新鲜的培养基中，使其增殖到适当的密度。 2.收集细胞当细胞达到适当的密度后，用无菌吸管将细胞悬浮液收集到离心管中。注意避免细胞接触到外界环境。 3.离心将收集到的细胞悬浮液进行离心，以去除培养基和细胞碎片。离心条件通常为2000rpm离心5分钟。 4.溶解和冻存液添加用适量的冷冻保护剂（如甘油、二甘醇等）将离心后的细胞沉淀悬浮均匀，以提高细胞的冷冻存活率。 5.分装冻存将细胞悬液分装到多个离心管中，并确保每个离心管内细胞悬液的容量相同。尽量避免气泡的产生，以防止细胞的机械损伤。 6.冷冻过程

将分装好细胞悬液的离心管迅速放入液氮罐中，进行快速冷冻。快速冷冻的目的是防止细胞内的水结晶导致细胞损伤。冷冻过程中，温度不得超过-80℃。三、冻存保存细胞冻存后，离心管应封闭严实，并在液氮罐中保存。为了保证细胞的长期保存，液氮罐应保持在恒定的低温环境下，一般为-196℃。同时，还需定期监测液氮罐的温度，以确保冷冻细胞的质量不受影响。细胞冻存的注意事项： 1.选择适当的培养基和冷冻保护剂，以提高细胞的存活率。 2.严格控制细胞的密度，避免过度或过低，影响冷冻效果。 3.注意细胞的无菌操作，避免细菌或病毒的污染。 4.在快速冷冻过程中，细胞悬液应均匀分布，尽量避免细胞的损伤。 5.定期监测液氮罐的温度，确保冷冻细胞的质量不受损害。细胞冻存技术的应用前景广阔，可以帮助科学家长期保存各种细胞种类，为科研实验提供便利。此外，细胞冻存还有助于细胞的移植和繁殖，对动物繁殖和保护也起到重要作用。综上所述，细胞冻存是一项重要的生物技术，其步骤包括准备工作、细胞处理和冻存保存。在进行细胞冻存时，需要注意培养基和冷冻保护剂的选择，细胞密度的控制以及冷冻过程中的操作技巧等方面。细胞冻存技术的应用前景广阔，将为科研实验和动物繁殖等领域提供有力支持。