蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析
摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。
关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点
Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage
Sites
Abstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production.
Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites
1.前言
生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、卵清白蛋白、牛乳蛋白、酪蛋白经不同的蛋白酶酶解可以产生具有降血压、抗氧化、防病、祛病、增强人体免疫力、促消化吸收等不同生理作用的肽[1]。由于生物活
性肽在药物、保健品等领域具有广阔的应用前景，因此对生物活性肽的研究与开发具有重要意义。
2.生物活性肽的制备
为了研究生物活性肽的结构与功能，开发相关药物或保健品等，需大量制备生物活性肽。目前，获得生物活性肽的主要途径有以下3种：①直接分离提取；
②化学合成或重组DNA技术；③体外水解蛋白质[1]。
天然生物活性肽分布很广泛，目前已经从动物、植物、微生物及部分海洋生物中直接分离出多种生物活性肽。天然生物活性肽通常具有高效、低毒、无污染等特点[2]。化学合成法有固相与液相两种方式，其基本原理几乎一样。化学合成法发展较早，也比较成熟。重组DNA法一旦建立好系统，就可以大量地重复性生产所要的活性肽。然而，这些制备方法存在一定的局限性。生物活性肽在生物体内的含量一般是微量的，如谷胱甘肽、催产素等，而且目前从天然生物体中分离纯化获得活性肽的工艺还不是很完善。化学法合成仍有许多缺点，包括①消旋化现象；②侧链官能团需要保护；③整体效率低；④使用大量的有毒溶剂，且成本高昂。因此化学合成法多半用在实验室，或是高价肽的生产上。重组DNA技术在基因的表达与产品回收上仍有问题，同时该法生产的活性肽种类也有限制，不能生产酰胺肽，也不适合制备短链肽[3]。
酶法水解由于反应较温和、对蛋白质营养价值破坏小、使用的试剂毒性较低、反应具有空间立体性、产物没有消旋化现象、反应位点具有方向性、无异味等优越性，在现阶段被广泛用于制备生物活性肽。生物活性肽具有促进矿物质吸收、抑制细菌、抗高血压、抗氧化、抗疲劳、神经调节、免疫调节等生理活性，而这些功能是原蛋白质或其组成氨基酸不具备的，且许多活性肽的组成氨基酸不一定是必需氨基酸，选择合适蛋白酶水解把其有生物活性肽链片段释放出来，从而制备出具有各种各样生理功能的生物活性肽。这就为更充分的利用蛋白质资源，特别是为那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源提供了新的机遇[4]。
迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白质水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化上，通过改善水解工艺，进一步提高生物活性肽得率。随着生物信息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐明，免疫学的发展使得蛋白酶的酶切位点也越来越明
确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性肽提供了基础。研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性质相关。因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白酶的水解位点特异性可以利用计算机使用特定酶模拟定向的释放活性肽，如黎观红等（2003）利用Access数据库软件建立了一个生物活性肽数据库，利用自编程序可用来寻找蛋白质中潜在的生物活性肽从该蛋白质中释放出来的适宜的酶。陈征松等（2007）建立了活性肽搜寻与蛋白模拟水解数据库，实现了蛋白质用单酶或者复酶的模拟水解。Vanessa Vermeirssen等（2004）建立蛋白质数据库并进行了实验，取得初步成果。
但酶法制备活性肽过程中一个具有挑战性的问题是，在蛋白质酶切过程中，会出现漏切位点和非专一性酶切位点，最终无法保证绝对把蛋白质酶切为常规的肽段，造成许多不必要的产物生成。这是利用蛋白酶催化合成活性肽最明显的副作用。对于常用的酶解来说，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果[5]。因此，研究蛋白质的酶切位点的影响因素，分析蛋白质的酶切规律，对制备高纯度、高产率的目标活性肽以及进一步研究其活性与结构的关系，具有重要意义。
3.蛋白酶和蛋白质的选择
蛋白酶的选择是酶法制备活性肽的关键步骤。在酶的筛选过程中，应以原料蛋白的组成和酶的专一性为参考，也可根据目标活性肽的结构特点进行选择或通过酶工程来生产特定酶[6]。根据水解方式不同可将目前常用蛋白酶分为以下2类[7]：
（1）内切酶：作用于蛋白质分子内部肽键。包括动物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等；以及微生物来源蛋白酶，如丹麦Novo公司生产的碱性蛋白酶Alcalase、复合蛋白酶Protamex、中性蛋白酶Neutrase等。
（2）外切酶：作用于蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，生成游离氨基酸，其中作用于氨基末端的称为氨肽酶，作用于羧基末端的称为羧肽酶。外切酶的一个重要特性就是能够把处于肽链末端的疏水性氨基酸水解出来，降低多肽的苦味。常见的一些蛋白酶及其作用位点见表1。
表1常见蛋白酶的作用位点
种类来源最适pH 作用位点
胃蛋白酶胃黏膜2~3 Phe-，Leu-
胰蛋白酶胰脏7~9 Arg-，Lys-
胰凝乳蛋白酶胰脏 3.7 Tyr-，Trp-，Phe-，Leu- 木瓜蛋白酶木瓜果实5~7 Arg-，Lys-，Phe-X 菠萝蛋白酶菠萝果实5~7.5 Lys-，Ala-，Tyr-，Gly-
碱性蛋白酶Carlsber 枯草杆
菌
6.5~8.5
Ala-，Leu-，Val-，Tyr-，Phe-，
Try-
许多动物蛋白和植物蛋白都可作为的来源。部分活性肽来自乳蛋白、酪蛋白、乳清、鸡蛋和肌肉蛋白质等动物蛋白质。此外，海洋生物如鱼、鲑鱼、牡蛎、大型藻类、鱿鱼、海胆、虾、雪螃蟹、海马也可作为活性肽的蛋白质源。植物蛋白质常用的包括大豆、豆类（扁豆、鹰嘴豆、豌豆和豆类）、燕麦、小麦、火麻仁、油菜和亚麻籽。目前，选择用于制备活性肽的蛋白质应该基于2个标准[8]：（1）使用未充分利用能够进一步增值且蛋白质含量丰富的食品工业副产物；（2）含有特定氨基酸序列或特定药理氨基酸残基的蛋白质。蛋白质的合理选择，对提高目标肽的产率至关重要。
4.酶切位点的影响因素分析
4.1.温度对酶切位点的影响
4.1.1.对专一性酶切位点的影响
一般情况下，蛋白酶在最适温度时酶切速率最大，偏离最适温度时活性降低。温度变化影响蛋白质的空间结构，从而影响了其对蛋白酶的亲和力。例如温度升高时，蛋白质底物中更多的酶切位点暴露出来，酶切更容易进行。研究发现，随着温度升高，蛋白质中更多的专一性酶切位点被水解，水解范围更广泛。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃、和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。一般情况
下，胰蛋白酶为肽链内切酶，水解赖氨酸或精氨酸的羧基与其它氨基酸（脯氨酸除外）形成的肽键。结果发现，随着温度升高，更多的赖氨酸残基和精氨酸残基被水解。在pH7.8和50℃的条件下水解10分钟之后，所有可能的专一性酶切位点都被水解。因为脯氨酸能影响蛋白酶水解肽键，所以Lys47-Pro48未被水解。在25℃，只有β-乳球蛋白的末端区域被酶解，然而，随着温度升高，β-乳球蛋白中心区域也开始被水解。
Blanca Hern′andez-Ledesma（2006）将牛的β-乳球蛋白A（β-Lg A）在非变性和变性加热条件下用嗜热菌蛋白酶水解，用HPLC-MS/MS确定水解过程中释放的肽段[10]。一般情况下，嗜热菌蛋白酶水解疏水性或芳香族氨基酸的氨基端肽键，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在37℃反应5分钟后，总共确定了水解产物中的25个肽段，这些肽段一直到更高的保温温度时才进一步水解。此外，在60℃和80℃之间的范围内发现了新的酶切位点，这些酶切位点位于β-乳球蛋白的最深埋区域。在60℃和80之间的范围内水解30分钟后所得产物中发现了三个新的肽段：LDA、LKPTPEGD、LQKW，相关的位点为Leu122-Val123、Glu127-Val128、Ala132-Leu133。但它们在37℃和50℃30分钟水解物并没有发现。其中的LQKW据报道是一种高效ACE抑制剂。温度变化引起了β-乳球蛋白构象的变化，使得这些肽键更容易被嗜热菌蛋白酶水解。提高酶解温度到60℃以上，可在更短保温时间内释放出肽段LQKW。
4.1.2.对非专一性酶切位点的影响
随着温度升高，更多的酶切位点暴露出来，在加强专一性酶切的同时，也较易出现非专一性酶切现象。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃，37.5℃，和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8，8.65，9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。结果发现，水解环境也影响非特异性裂解，在较高温度（50℃）下更容易出现胰凝乳酶式的酶切。胰凝乳蛋白酶，和胰蛋白酶一样是消化道的丝氨酸蛋白酶。它催化的羧基端侧的肽键水解的酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，其中都含有一个与疏水腔相匹配的芳环。此外，它也能水解亮氨酸的羧基端。此外，二次水解胰凝乳蛋白酶能水解蛋氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、甘氨酸和丙氨酸的羧
基端。新出现的酶切位点为Leu10-Asp11、Gly17-Thr18、Ser21-Leu22、Ser30-Leu31、Tyr42-Val43、Thr49-Pro50、Val118-Cys119、Leu133-Glu134、Tyr20-Ser21。相关的肽段为f(43-49)、f(21-30)、f(18-28)、f(11-21)和f(119-133)。只有一个肽（f（18-28））在25℃和37.5℃能酶切生成，而大部分片段只能在50℃下才能生成。
胰蛋白酶出现胰凝乳蛋白酶式的酶切，可能是由于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的本质特性——催化三联体（His57、Asp102和Ser195）是相同的。此外，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶约40％的氨基酸序列是相同的。因此，在40℃以上时，催化中心发生了构象变化，允许更多的氨基酸结合，而这催化中心一般情况下是很紧密的。
4.2.pH对酶切位点的影响
酶蛋白分子上带有很多酸性、碱性氨基酸残基，pH值的变化直接影响到这些残基侧链基团的解离状态。pH值对酶解反应的影响主要有三个方面：（1）引起酶蛋白的空间结构变化；（2）改变酶蛋白中活性部位的解离状态；（3）改变蛋白质底物的空间结构和解离状态。
4.2.1.对专一性酶切位点的影响
研究发现，在最适pH值专一性酶切位点水解速率最大，偏离最适pH值时出现了非专一性酶切位点。部分专一性酶切位点对蛋白酶解呈抵抗性。
Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.6~6.6）对凝乳酶水解κ-酪蛋白及其巨肽的影响[11]。凝乳酶能专一地切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106之间的肽键。结果发现，在pH 4.6下κ-酪蛋白肽键Phe105-Met106的水解速率最大。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。结果发现，Lys60, Lys75和Lys77在pH7.8下的水解时间在15s之后，在pH8.65和pH9.5下则15s内能被水解。而且，Lys91-Val92和Lys138-Ala139在pH8.65下能抵制胰蛋白酶酶解，而Lys70-Ile71是在pH 9.5。Lys101-tyr102在50℃、较高的pH值8.65和9.5下能抵抗酶解，而在pH值7.8下却不能。
Seronei Chelulei Cheison等认为，碱性pH可能通过以下方式改变β-乳球蛋白和/或胰蛋白酶的结构，从而影响键酶切。首先，结合较高温度（50℃）和较
高pH值（8.65、9.5）引起β-乳球蛋白结构改变进而导致变性。在pH 9.5，羧基端的酪氨酸残基也有影响，在该pH下开始去质子化，因此，对胰蛋白酶的亲和力可能会受到影响。这些结果证实了水解条件变化对酶解模式的影响。在这些条件下未能水解一些肽键，可用以保护某些肽段，使酶解朝着某一特定目标产物进行。
4.2.2.对非专一性酶切位点的影响
研究发现，在蛋白酶最适pH值和偏离最适pH值下均检测到了蛋白酶的非专一性酶切，在后者条件下发生的范围更广泛。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。结果发现胰蛋白酶的酶切位点由羧基端变为氨基端的现象。在pH7.8下检测到了精氨酸残基氨基端的裂解，在pH7.8、8.65、9.5下均检测到了精氨酸残基氨基端的裂解。
Julian R. Reid等（1997）研究了pH值（2.6~6.6）对凝乳酶水解κ-酪蛋白及其巨肽的影响[11]。结果发现，在pH6.6下，检测到了低浓度的肽段Phe18-Leu32、Ser33-Tyr42和Trp76-Phe105，在pH5.6及以下则发现了其互补肽段Tyr43-Gln75。这些是κ-酪蛋白每个pH值主要的TCA可溶二次水解产物，其相关的肽键为
Phe17-Phe18、Leu32-Ser33、Tyr42-Tyr43和Gln75-Trp76。
4.3.温度和pH值对酶切位点的共同影响
研究发现，某些酶切位点只在特定的温度和pH值裂解。肽键裂解的时间也有所差异，从而释放出相应的肽段。这表明，可通过对酶解条件的控制而获得某些拥有特定序列的肽或者保护某些重要的肽段。
Seronei Chelulei Cheison等（2011）使用MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）分析了温度变化（25℃、37.5℃和50℃）结合不同的碱性pH值（7.8、8.65、9.5）对胰蛋白酶水解β-乳球蛋白模式的影响[9]。结果发现，在每个水解条件下的前15s，Lys8、Lys100、Arg124、Lys141和Arg148的羧基端酶切位点都被水解了。可通过β-乳球蛋白的结构解释，因为在反应起点，所有这些肽键位于暴露的氨基端和羧基端，容易被酶水解。在所有条件下的β-乳球蛋白水解结果显示，肽键Lys8-Gly9、Lys141-Ala142和Arg148-Leu149是初始酶切位点。
在最优条件37.5℃和pH7.8下，八个肽键在最初的15s内被水解，而最多肽键的断裂出现在50℃和pH7.8时，一共有10个。因为此条件下，β-乳球蛋白的降解速率很高。此外，可能是因为较高的温度引起蛋白结构变化，pH值7.8是胰蛋白酶的最适pH值，蛋白质更易被水解。这也符合为何β-乳球蛋白的中心区域（Lys60、Lys75和Lys77）在此条件下也被水解了。
Seronei Chelulei Cheison等将胰蛋白酶在最适温度和pH（37.5℃，pH7.8）的酶解结果和25℃和pH7.8的进行比较，最适条件下的部分酶切位点在25℃和pH7.8下水解时间延长或不水解。例如Lys60-Trp61和Lys70-Ile71，在在25℃和pH7.8下10分钟内并未水解，而Lys75-Thr76，Lys77-Ile78，Lys83-Ile84，Lys91-Val92，Lys101-Tyr102，Lys135-Phe136，Lys138-Ala139的裂解时间比最优条件（37.5℃，pH值7.8）长。这表明，可通过控制胰蛋白酶水解β-乳球蛋白的条件来获得某些特定的肽。
结果还发现，在所有水解条件下，Arg124-Thr125和Arg148-Leu149的酶切割时间没有差异，Arg40-Va l41也几乎相同。因此，精氨酸残基的裂解受水解条件的影响更小一些。
4.4.金属离子对酶切位点的影响
部分金属离子能作为蛋白酶的激活剂，金属蛋白酶更是本身活性中心就含有金属离子（如锌、钴、镍等），且依靠金属离子催化肽键水解。另外，金属离子也能和蛋白质底物结合引起蛋白质结构变化，从而对酶切位点造成影响。
Jean-Francois Lapointe等（2003）研究了钙离子对嗜热菌蛋白酶水解β-酪蛋白胰蛋白酶水解肽的影响[12]。结果发现，嗜热菌蛋白酶水解β-CN 1-25肽过程中，钙离子的存在改变了一些肽段的释放速度，特别是那些由Ser22-Ile23和
Glu11-Ile12肽键裂解所得的肽。这些肽键都位于磷酸丝氨酰基附近。钙离子和磷酸丝氨酸残基的结合可能会引起肽结构的变化，反过来影响了这些特异性酶切肽键与酶之间的亲和力。Jean-Francois Lapointe等认为磷酸丝氨酰基和钙离子的相互作用能使负磷酸基团之间的静电斥力，从而提高分子的灵活性。因此，加入钙离子能加速肽段β-CN 6-22和β-CN 12-22的释放，这两个肽段含有β-CN 1-25原始序列中4个磷酸丝氨酸残基的完整酰基。
5.结论
通过酶解蛋白制备活性肽有许多的优点，但酶法存在一个问题，在酶解过程中，局部构象、三维结构、实验条件、酶切位点附近的其它氨基酸以及其它偶然因素都会影响蛋白水解酶的酶切效果，从而产生很多不必要的副产物。研究蛋白酶酶切位点的影响因素，分析其酶切规律，提高目标肽的得率，具有重要意义。
当温度、pH值、金属离子等水解条件变化时，蛋白酶酶切位点会发生不同程度的变化。（1）在最适温度和最适pH下，专一性酶切速率加快，不易出现非专一性酶切位点；（2）当偏离最适温度和最适pH时，容易出现非专一性酶切位点。部分专一性酶切位点对蛋白酶酶切呈抵抗性。（3）金属离子会影响某些肽段的释放速率。这表明，控制酶解条件可以作为制备高得率目标肽的一种方法，更多的研究应该集中在酶切规律总结以及具体操作方法上。
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胰蛋白酶分离工艺
1、集落刺激因子（G-CSF ） 组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非 糖基化多肽链 理化性质：①性状：无色澄明液体 ②分子量：20000，等电点为5.8～6.6 ③溶解度： ④稳定性： 生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是 刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及 噬酸性细胞的多种功能 ，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞 减少症， 分离纯化工艺： G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后 分装冻干。 由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后 经冻干制成。 纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析 缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150 ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）： 组成结构： 理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体 ②分子量：32000左右 ③溶解度： ④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分 钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。 生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过 氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞 分离纯化工艺： 血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离 得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红 蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。粗酶 液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获 得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点 木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素 胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写
名称三字符号单字符号 丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点 胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。
常用限制性内切酶酶切位点汇总
Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点
BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点
BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
重组人胰蛋白酶
重组人胰蛋白酶 Cat. No.: RHT03 CAS: 9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1. 重组生产，无动物源性 重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2. 优势 安全性高 重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等； 特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染； 冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失； 不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。
?纯度高 HPLC纯化； 活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高 比活性不低于2500 USP u/mg。 3.用途范围 胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。 胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性 来源重组大肠杆菌 纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉 纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500 USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性 不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂
5.信息 产品名称比活包装产地 重组人胰蛋白酶≥2500 USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml (1cm 光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品 重组猪胰蛋白酶； 重组胰蛋白酶细胞消化液。
不同的酶切位点
ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^TCGAG 3'
常用限制性内切酶酶切位点
AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点
AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点
BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点
蛋白酶专一性酶切位点地影响因素分析报告
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析 摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。 关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites 1.前言 生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、
南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究
南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究 周婷婷，王锡昌，李燕 （上海海洋大学食品科学与工程学院，上海 201306） 摘要：本文基于酶的纯化鉴定、动力学分析、序列比对和结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制。结果显示适冷胰蛋白酶和中温胰蛋白酶的催化中心严格保守，遵循一致的催化机制；但南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶为了适应低温环境，各级结构都表现出一定的应对机制：疏水性残基含量偏高、带正负电荷残基含量偏低，分子内部疏水作用增强、盐桥减少，这些因素致使适冷胰蛋白酶蛋白质分子内的相互作用减弱，分子柔性增强。适冷胰蛋白酶具有更高比例的呈松散状的无规卷曲结构，一定程度提高了其柔性；底物专一性口袋周围空间位阻更小，底物更容易接近活性中心，这也是加快催化反应的关键因素。 关键词：胰蛋白酶；适冷性；酶动力学参数；南极磷虾；结构预测 文章篇号：1673-9078(2016)5-27-33 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.5.05 Structure and Cold-adaptation Mechanism of Trypsin Purified from the Krill (Euphausia superba Dana, 1852) ZHOU Ting-ting, W ANG Xi-chang, LI Y an (College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) Abstract: The molecular characterization of trypsin purified from Euphausia superba (Dana, 1852) was investigated in this research. Aspects such as thermodynamic activation parameters, sequence alignment, and molecular model allowed an in-depth understanding of its activity at low temperatures. Conserved residues were compared between cold-adapted trypsin and its warm-adapted counterparts, and the results showed that their active cores were almost identical. Strategies adopted by trypsin for molecular adaptation to low temperatures may be as follows. A higher proportion of hydrophobic residues and lower proportion of charged residues in the enzyme probably diminish the number of intramolecular interactions, resulting in improved structural flexibility. Increased number of loose random coils may also contribute to improve structural flexibility. Reduced steric hindrance is also a key factor that allows the substrate to easily access the active site, thus promoting the catalytic reaction. Key words: trypsin; cold-adapted; enzyme kinetic parameters; Euphausia superba ; molecular modeling 南极磷虾生活于南极冰下，资源丰富，我国于20世纪80年代中期开始对南极磷虾进行调查和研究，于2009年开始进行大规模的商业捕捞。南极磷虾生活的水域温度一般维持在-1.7 ℃至-3 ℃，属于嗜冷水性动物，体内的酶普遍具有适冷性，在催化反应过程可能遵循着一定的应对低温环境的机制。其体内高效的蛋白质降解酶系统主要分布于南极磷虾的胃和肝脏中， 在较低温度下仍具有活性，能够迅速降解各种蛋白质， 27 收稿日期：2015-05-03 基金项目：国家高新技术研究发展（863）计划海洋技术领域主题项目（2011AA090801） 作者简介：周婷婷（1985-），女，博士研究生在读，研究方向：食品科学与工程 通讯作者：王锡昌（1964-），男，教授，博士研究生，研究方向：食品科学与工程 对复杂蛋白质的降解活性比所有的商品酶均高[1]；南 极磷虾死亡后，即使在低温环境保存，虾体也易于自溶、变质、腐败，这些现象可能都与南极磷虾体内蛋白酶的适冷性有着密切的关系。胰蛋白酶是甲壳动物体内主要的蛋白酶之一，能够专一性地切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基羧基端的肽键，Osnes 等[2]的研究表明，南极磷虾蛋白酶具有的高效催化性，大约40%来源于胰蛋白酶的作用。 适冷酶通过特殊的应对机制能够在低温环境下保持一定的活性，相对中温酶表现出了更加优越的催化性能，已被广泛地应用于食品加工和化工领域。有研究表明适冷酶的某些氨基酸含有比例与其适冷性有着密切的关系；适冷酶关键氨基酸残基的取代可能会改变其局部区域分子间的作用力，使分子结构的紧密程度发生变化，从而影响到其在低温环境中的催化能力
胰蛋白酶活力测定
实验胰蛋白酶活力测定 一、原理 福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。 蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。 二、实验仪器 试管 7220分光光度计 恒温水浴锅 三、实验试剂 福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再
加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。 500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤 标准曲线的制作：按下表加入试剂： 0.20.40.60.81.0蒸馏水 1.0 0.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液6 54321管号 各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。 以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。 样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂
0 OD6801 1福林试剂B 5.0 5.0 0.55mol/L碳酸钠溶液 37水浴中显色15分钟1 1上清液 过滤3.0 3.0 10%三氯乙酸溶液1.0 0 2mg/ml胰酶溶液0 1.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液 37水浴中酶解15分钟2.0 2.0 0.5%酪素溶液 备注2 1 管号 五、结果计算 酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15 ╳F A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F—酶液稀释倍数 原始数据：（注：7号为待测液） 液体编 号 0 1 2 3 4 5 7 分光光 度计值 0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 分光光 度计值 0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 分光光 度计值 0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934
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BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点
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胰蛋白酶
胰蛋白酶简介 一、介绍 胰蛋白酶（C6H15O12P3）为蛋白酶的一种。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。 牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH>9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。 胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活
提取与重组胰蛋白酶的不同
胰蛋白酶与重组胰蛋白酶药典标准比较 胰蛋白酶药典标准历史 2014年之前，只有从猪或牛胰腺提取的胰蛋白酶的标准，活性标准为2500USP units/mg，目前临床已不应用。在2011年左右，通过了胰蛋白酶:糜蛋白酶（6:1）配方，用于消化道疾病的治疗。在2013年12月出版了修订稿的“用于生物医药制造过程的辅助材料”，重组胰蛋白酶作为一个例子，给出标准。2017年2月，FDA正式颁布胰蛋白酶的药典标准。 2010版中国药典第二部规定: 药品的安全性保障得到进一步加强。凡例中规定所有来源于人或动物的供注射用的原料药均增订“制法要求”。在总则十四规定：（1）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿的药品，均应取自健康人群。上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规范。 2010版中国药典第三部规定: 2010版药典对安全性问题更加重视。增修订细菌内毒素检查的品种达112种；药典三部增订了逆转录酶活性检查法等。培养细胞用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群，其质量应符合本药典的有关规定；在生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物
胰蛋白酶重组胰蛋白酶
外观形状白色或类白色溶解性可溶 溶解性可溶生物载量NMT100CFU/ml 微生物限量- 比活力 (USP units/mg pro.) NLT3800 金黄色葡萄球 菌阴性纯度（HPLC） NLT70%β-trysin, NMT20%α -trypsin 绿脓假单胞菌阴性 沙门氏菌阴性 干燥失重不高于5.0% 灼烧残渣不高于2.5% 糜蛋白酶限量不高于5.0% 活性不低于2,500USP units/mg 美国药典中，两种胰蛋白酶的标准的主要不同点: 项目胰蛋白酶2014美国药典 来源 动物来源： 从猪或牛的胰腺提取重组（无动物源性）：DNA来源产品 纯度检测方法无HPLC 活性2,500USP units/mg比活性：3800USP units/mg pro.
重组胰蛋白酶
Cat.No.：RPT0201 CAS：9002-07-7 EC：3.4.21.4 储存温度：2-8℃ 来源：重组猪胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达。 蛋白序列：氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致。 1.产品简介 胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键。雅心重组猪胰蛋白酶是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致，重组猪胰蛋白酶具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质，可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中。重组胰蛋白酶分子量24kD，最适pH为7.0-11.0。活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF等的抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。 2.产品特性 来源重组大肠杆菌 产品外观白色、类白色、类黄色粉末 比活≥3800USP units/mg pro. 纯度（蛋白电泳）单一主条带 分子量（蛋白电泳）24.0±2.4kDa 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 3.使用方法 1mMHCl溶解，重组胰蛋白酶浓度为1-10mg/ml。使用时，酶量：目的蛋白=1：50-1：1000，最适pH为7.0-11.0。 4.储存和运输稳定性 储存稳定性：重组胰蛋白酶冻干粉存于2-8℃，24个月稳定； 1mM盐酸或50mM醋酸溶解后储存于-20℃，反复冻融10次，无活性损失。 运输稳定性：蓝冰保温运输，活性稳定。 5.产品优势 ●无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料。 ●质量稳定：批量生产，可保证稳定连续的批次生产；产品批次间无差异，质量稳定。 ●纯度高：比活高；宿主蛋白残留小于生物制品限度要求。 ●冻干粉：易于储存和运输。 ●符合法规要求：生产设备和生产环境符合相关法规要求，生产过程完全遵循NSF ISO9001:2008质量 体系并符合GMP指导原则。 ●质量文件完整：按客户需求，可提供相关法规支持文件。
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析 摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。 关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract: Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites
胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究
天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2009,21:101121014 文章编号:100126880(2009)0621011204 收稿日期:2009202216 接受日期:2009206202 基金项目:西北民族大学校级中青年项目(XBMU 220062BD 282)3通讯作者Tel:862931229383112609;E 2mail:li m ingsheng@xb mu .edu .cn 胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究 李明生 13 ,李 倬1,乔自林1,冯若飞1,马忠仁1,冯玉萍1,侯兰新1,张福梅 2 1 西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室;2西北民族大学理科实验中心,兰州730030 摘 要:无菌采集健康牛胰脏,用0.125mol/L 的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料。通过盐析、C M 2Sephar ose 2FF 层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化。结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240h 后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144h 后,细胞出现拉丝、病变等异常情况。 关键词:胰蛋白酶;原料;控制中图分类号:Q814.1;Q814.9;R285 文献标识码:A Prepara ti on and Trypsi n i n Cell Culture Appli ed Research L IM ing 2sheng 13,L I Zhuo 1,Q I A O Zi 2lin 1,FE NG Ruo 2fei 1 ,MA Zhong 2ren 1,FE NG Yu 2p ing 1,HOU Lan 2xin 1,ZHANG Fu 2mei 2 1 Key B io 2engineering &Technology L aboratory of S tate Ethnic A ffairs Co mm ission of N orthw est U niversity for N ationalities ; 2 Science Experi m ent Center of N orthw est U niversity for N ationalities,L anzhou 730030,China Abstract:A sep tic acquisiti on healthy cattle pancreas,with 0.125mol/L sulfate of bovine pancreas p r ocessing and p res 2ervati on,and the ra w material of bacteria,fungi,endot oxin,Mycop las ma,phage and s ome virus detecti on of exogenous fact ors,screening qualified ra w materials .Thr ough salting 2out,FF 2C M 2Sephar ose chr omat ography,ultrafiltrati on method of tryp sin t o extract and purify,the results showed that the selecti on of ra w materials thr ough the purificati on of tryp sin and experi m ental cells 240h (5generati ons ),the cell gr owth good,nor malmor phol ogy,and without screening tryp sin di 2rectly fr om the cells thr ough the experi m ental 144h,the cells were drawing lesi ons such as abnor mal .Key words:tryp sin;ra w materials;contr ol 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶,广泛 存在于动物的胰脏,是一些生物制药的主要原辅材料。随着生物制药的不断发展,因胰蛋白酶质量问题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的关注。目前,胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究,最终产品直接或间接的用于人体,因此,胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康,甚至生命安全。要控制好胰蛋白酶的质量安全,对原材料的把关是关键,由于胰蛋白酶来源于生物体,其成分复杂,单靠检验标准很难达到质量安全。一旦由胰蛋白酶途经带入,会大大影响到细胞培养,甚至影响到疫苗的产量和质量。国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟,且大都对原材 料没有进行严格的筛选,质量控制的研究内容也不 够全面。本实验选择健康的牛源,在无菌环境下进行采集牛胰脏;采用合理、有效、安全的方法对原材料进行处理和保存,并对采集的原料进行细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子的检测,通过检验筛选合格的原料,为后续的胰蛋白酶提取工艺和质量控制提供保障。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要材料试剂 牛胰脏、实验用所有细胞、实验用所有培养基(均由兰州民海生物工程有限公司提供)、N 2苯甲酰2L 2精氨酸乙酯盐酸盐(上海如吉科技发展有限公司)、胰蛋白酶1:250(Hycl one )、鲎试剂(湛江,安度斯)