中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋(NGAL)

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

一、临床适应症背景情况

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）又称人脂质运载蛋白2(lipocalin2,Ln2)或噬铁蛋白(siderocalin)，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。近年来，NGAL作为一种新的肾损伤标志物倍受关注。早期急性肾损伤、慢性肾病、心肾综合症等疾病血清和尿液中NGAL会显著升高，且其水平监测对病情轻重、疗效及预后判断具有较好的诊断价值。临床检测NGAL主要有免疫层析法、免疫比浊法、速率色散比浊法、乳胶增强免疫比浊法等。胶乳增强免疫比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。

肾脏损伤约占所有泌尿生殖道损伤的65%左右。急性肾损伤是一组临床综合征，是指突发(1-7d 内)和持续(>24h)的肾功能突然下降，定义为血清肌酐至少上升0.5mg/dl 1，表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡以及全身各系统症状，可伴有少尿（<400ml/24h或17ml/h）或无尿（<100ml/24h）。肾病的发病迁延难愈，时间超过三个月，病人尿液和相关的血液指标出现异常，肾脏病理学、影像学发现异常，或肾脏的肾小球有效滤过率低于60%，都可统称为“慢性肾病”。慢性肾病如未能及时有效救治，导致病情恶化进展，则随病程迁延，慢性肾病患者将发展成为慢性肾功能不全、肾衰竭，最终形成尿毒症。心肾综合征（cardio-renalsyndrome，CRS)即心脏或肾脏对另一器官的损害不能代偿时，互为因果,形成恶性循环，最终加速心脏和肾脏功能的共同损害和衰竭。其发病率、死亡率高，给社会和患者带来沉重的负担。目前对心肾综合征的认识有限，缺乏有效的治疗措施，是临床处理的难题。

早期诊断急性肾功能损伤时血、尿NGAL浓度通常会迅速升高，2h最为明显( 比临界值升十至几百倍)，血清肌酐、尿酶等传统指标往往要在24～72h才后明显升高，因而NGAL可用于急性肾功能损伤的早期诊断。监测病情进展NGAL还可以反映肾功能损伤的严重程度。评估预NGAL可作为急性肾功能损伤的预后指标之一。研究发现，慢性肾病患者的血清、尿NGAL水平显著高于正常人群，并与肾小球滤过率呈密切负相关，而血清肌酐与肾小球滤过率的关联程度不及NGAL。因此，慢性肾病患者NGAL水平不仅是优于血清肌酐反映肾小球滤过率下降的指标，更是评价慢性肾病患者肾脏损伤程度的标志物。心肾综合征是一种心脏和肾脏的病理生理紊乱，即由一个器官的功能不全导致的另一个器官的功能不全，死亡率高，共分为5 个类型。研究发现血NGAL诊断1型心肾综合征时，敏感性和特异性分别为100%、86.7%。因此，作为肾损伤的早期诊断指标，密切监测NGAL水平，有利于临床医生正确评价心肾综合征中的肾功能损伤程度，并及时采取干预治疗，减少并发症的发生。

3.相关的临床或试验室诊断方法

目前临床检测NGAL主要有免疫层析法、免疫比浊法、速率色散比浊法、乳胶增强免疫比浊法等. 乳胶增强免疫比浊法具有操作简单，可在几分钟内快速、准确地检测血清蛋白含量，真实反映病情进展和评估治疗效果，对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的临床意义；不易受人为操作和外界因素干扰，检测稳定性和重复性都很好；能利用普通的生化分析仪进行检测，容易实现自动化，可在各级基层医疗机构普及和应用等优点。

二、描述

1.技术原理

采用兔抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体致敏的胶乳颗粒，与待测样本中中性粒细

胞明胶酶相关脂质运载蛋白在液相中相遇，立即形成不溶性抗原-抗体复合物，并产生一定浊度。浊度高低反映样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白浓度的高低，通过与同样处理的校准品比较，即可计算出样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量。

2.主要生产工艺过程

图一试剂工艺流程图

备注：1.“ ★”表示关键工序，配制（称量、溶解、定容）和分装为关键工序，无特殊工序。

2.“ ” 表示物料、半成品、成品流向。

3.配制（称量、溶解、混合、定容）、分装和封口为在十万级净化车间操作的工序。三、其他

1. 同类产品在国内外批准上市情况

目前，经国家食品药品监督管理总局（CFDA ）批准注册的同类产品,国产39个，如：上海科华生物工程股份有限公司的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)。进口4个，如：雅培的尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)。

2.相关产品所采用的技术方法及临床应用情况

临床检测NGAL 主要有以下方法：免疫层析法、免疫比浊法、速率色散比浊法、乳胶增强免疫比浊法等。因其方法简便，技术纯熟，现大多采用胶乳增强免疫比浊法。本公司采用乳胶增强免疫比浊法研制生产的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)检测结果准确、精密度高、稳定性好，且可自动化批量分析，能广泛应用于临床。

参考文献：

1.陈佩.急性肾衰竭患者血清NGAL测定的临床意义[J].临床医学,2011，（5）：01.

2.龚淑文沈水娟何剑雾.NGAL的结构功能及其在慢性肾病中的作用[J].中国中西医结合肾病杂

志.2013，（14）；354-355.

3.刘长海.急性肾损伤新的标记物NGAL的临床检测意义[J].中国实用医药，2011，(6)：224-226．

4.薛志强童俊容.慢性肾脏疾病血清和尿液NGAL的改变及其临床意义[J].中国中西医结合肾病

杂志，2010,（11）：440-441。

5.张铁征张立华耿玉兰等.急性心力衰竭患者外周血NGAL检验的临床应用. 中国卫生检验杂

志 .2015，（25）: 516-517。

NGAL中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白

一种新的肾损伤标志物— 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的临床意义中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白( neutrophil gelatinaseassociated lipocalin，NGAL) ，又称人脂质运载蛋白2( lipocalin 2，Ln2) 或噬铁蛋白( siderocalin) ，是人脂质运载蛋白家族中的一个新成员。近年来，NGAL 作为一种新的肾损伤标志物倍受关注。 1、NGAL 的生物学特性 NGAL 是1993 年Kjeldsen 等［1］研究中性粒细胞时发现的一种特殊颗粒组分，与明胶酶B 即基质金属蛋白酶9( matrixmetalloproteinase-9，MMP-9) 密切相关。人类NGAL 基因定位于第9 号染色体长臂( 9q34) ，全长5 869 bp，包括1 695bp 的5'端非转录区、178 bp 的3'端非转录区及由7 个外显子和6 个内含子构成的3 696 bp 的原初转录区; 其相对分子质量为25 000 bp。血小板活化因子( PAF) 、白三烯-B4( LT-B4)和N-甲酸基-甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸( N-formyl-Met-Leu-Phe) 等是NGAL 的配体［2］。在生理状态下，中性粒细胞、肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞等分泌少量NGAL，而脑和周围神经、结肠、子宫和卵巢、胎盘、甲状腺等组织细胞中NGAL 的表达呈阴性。 NGAL 的生理功能尚不完全清楚，可能参与不同的生理、病理过程，涉及胚胎发育、细胞分化、肿瘤的发生发展、细胞凋亡、炎症免疫应答、脂质代谢等。在胚胎期，NGAL 发挥类似生长因子的作用，参与各类组织发育、生长及分化，促进乳腺癌、食管癌等肿瘤细胞增殖。NGAL 与MMP-9 以二硫键形成12 500 bp 的复合物，延长MMP 的蛋白水解活性，促进MMP-9 对细胞基底膜的降解，从而浸润周围基质，介导癌细胞转移。过去研究认为，NGAL 促进细胞凋亡，但近年来研究发现NGAL 还是一类应激蛋白，在外界有害物质刺激下，细胞分泌NGAL 是一种机体自身防御机制，使组织细胞免于凋亡［3］。NGAL 还是一类新的急性期反应蛋白，作为介导铁离子向胞内运输的新型载体，通过竞争性夺取螯合物中的铁来阻止细菌对铁的吸收，从而抑制细菌生长。 2、NGAL 是急性肾损伤的标志物 2．1 早期诊断急性肾功能损伤( AKI) 时血、尿NGAL 浓度通常会迅速升高，2 h 最为明显( 比临界值升高几十至几百倍) ，血清肌酐( sCr) 、尿酶等传统指标往往要在24 ～72 h 才后明显升高，因而NGAL 可用于AKI 的早期诊断。Mishra等［4］在体外循环术并发AKI 患儿的队列研究中发现，2h 尿NGAL 诊断AKI 的AUCROC 为0．998，其临界值为50 μg /L( ELISA 法) 时，敏感性、特异性分别为100%、98%，而血清NGAL 诊断AKI 的AUCROC 为0．906，其临界值为25 μg /L 时，敏感性、特异性为70%、94%; 多元回归分析显示，2 h 尿NGAL 水平是预测AKI 的强有力预测因子。也发现成年患者2 h 尿、血清NGAL 水平是诊断AKI 的可靠的早期诊断指标。meta 分析表明，NGAL 对AKI 的诊断效能受到标本类型、年龄、检测方法等因素影响，但NGAL 对儿童AKI 的诊断效能优于成年人，可能是成年人受到其他慢性疾病等因素影响。值得注意的是，脓毒血症等危重疾病患者，因受到炎症反应等因素影响，NGAL 可能并不适用于AKI 的早期诊断，诊断特异性欠佳。北美地区研究发现，143 名全身炎症反应综合征及脓毒性休克患儿入院后24 h 内，血清NGAL 诊断AKI 的AUCROC为0．677，在临界值为139 ng /mL 时，敏感性为86%，特异性仅为39%。经多变量分析后发现，血NGAL 并不是发生AKI 事件的预测指标［5］。在成人患者研究中也得到类似结论。另有研究表明，危重患儿48 h 内尿液NGAL 水平可以准确预测AKI 的发生( AUCROC 为0．79) 。但当sCr 升高后，AUCROC降至0．63［6］。ICU 中的AKI 成人患者血浆NGAL水平在48 h 后与正常对照组亦无显著性差异［7］。但李萍珠等［8］发现尿NGAL 可作为脓毒血症后并发AKI 的早期诊断标志物，准确性达0．968，这可能与种族间水平差异有关。 2．2 监测病情进展NGAL 还可以反映肾功能损伤的严重程度。Kusaka 等［9］在接受

01 中性粒细胞功能测定

实验一、中性粒细胞吞噬功能测定Assay for Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocyte 【实验目的】 ?掌握中性粒细胞吞噬功能试验的原理； ?熟悉中性粒细胞吞噬功能试验的操作方法；?通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。

【实验原理】血液中的中性粒细胞通称小吞噬细胞，具有吞噬细菌和异物颗粒的能力，在体外将中性粒细胞与细菌或异物颗粒在一定条件下共同孵育后，显微镜观察可见中性粒细胞内有细菌或异物颗粒。计数吞噬率和吞噬指数，可反映中性粒细胞的吞噬功能。有助于对疑有吞噬细胞功能障碍的疾病作出诊断。

【材料和试剂】 1.待测样本新鲜抗凝静脉血 2.被吞噬物灭活白色葡萄球菌菌液（6×108/ml）。 3.试剂无菌生理盐水，甲醇，瑞氏－吉姆萨染液。 4.器材EP管，75%酒精棉球、载玻片，微量移液器、恒温箱，显微镜（香柏油，二甲苯）等。

【操作步骤】 1.白色葡萄球菌液制备。（已制备好） 2.待测血标本制备：静脉采血5ml。 3.在EP管内加40微升血液，20微升菌液，混匀。 4.将EP管置37℃温育30min，每隔10min混匀一次。 5.取一小滴上述混合液，置于载玻片上，推成薄血片，晾干。 6.甲醇固定4-5min，滴加瑞氏-吉姆萨染液A液2-3滴，染色1- 2min，再B液2-3滴，染色5-10min，水洗，晾干。 7.油镜下计数中性粒细胞(＞100个)、吞噬的细菌总数。

【推血片方法】取血混合液一小滴，放于载玻片的右端。将推片置于血滴前端，与载玻片接触，成30°～40°角向后拉动推片，使与血液接触?待血液扩散形成一条线之后，以均速轻轻向前推动推片，则血液均匀地被涂于载玻片上而形成一薄膜。取两张无油脂的洁净玻片，左手拇指及中指夹持载玻片，右手持推片。30° 血滴越大，速度越快、角度越大--血膜越厚

明胶酶谱法检测步骤

明胶酶谱法检测步骤 1、明胶酶谱溶液配制 1.1.1洗脱液（1×）： 1.1.2Triton X-100， 2.5%（v/v）in water 配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。 1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。配法： 1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g； 2)加水至800ml； 3)用浓HCl调pH至7.6； 4)定容至1000ml。 1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇） 0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml 甘油 2.0ml 10%（w/v）SDS 4.0ml 0.1%溴酚蓝0.5ml dH2O1ml Total10ml 1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）配法： 1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中

a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5ml b)SDS1g c)溴酚蓝0.05g d)甘油5ml 2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀； 3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。 1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml 配法： 1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中； 2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解； 3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀； 4)加入260ml去离子水，搅拌溶解； 5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。 1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml）配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。 1.1.7明胶储液（10mg/ml in water）配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用55℃水浴解冻。 1.1.810%SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0mg/ml明胶）配法： dH2O3ml 30%丙烯酰胺溶液 3.3ml

明胶制作方法及工艺流程

明胶制作方法及工艺流程明胶制作方法及工艺流程明胶制法明胶是动物的皮、骨、白色结缔组织中含有的胶原蛋白，经提纯和初级水解后加工而制得的一种产品。明胶为淡黄至黄色，半透明微带光泽的粉粒或薄片，无特殊臭味，无挥发性。一般明胶含水在16%以下，在干燥环境明胶比较稳定，在潮湿环境下易吸潮被细菌分解而变质。明胶在灼烧时，变软胀大直至炭化，放出一种特殊的角燃烧羽毛或氨的臭味。在冷水中明胶难溶解，但能吸水而变软，而在热水中极易溶解。明胶难溶于汽油、乙醇、氯仿等普通有机溶剂。但可溶于醋酸、水杨酸和苯二甲酸等有机酸，还可溶于尿素、硫脲及溴化钾、碘化钾等水溶液中。明胶是一种高分子化合物，其分子量约为17500－450000。明胶的用途：按用途可分为照相明胶、食用明胶和工业明胶。它广泛应用于食品、医药、化工、纺织、印染、造纸、火柴、五金、家具以及感光材料等从多行业之中。 1、食品工业：用于妈糖、点心、罐头、冰淇淋、汽水、布丁等。 2、医药工业：用于外科敷料、调制丸剂、药膏、制胶囊、制药丸的糖衣层、鱼肝油丸的外皮。 3、感光材料：用于制造照相、电影胶片、X光片、印相纸、放大纸等。 4、印刷工业：用于照相制版和高合印刷胶等。 5、轻纺工业：用于丝绸、棉布、毛毯、纸、皮革制品、草鞋编织品的上浆上光等。 6、化学工业：用于塑料、橡胶、乐器、铅笔、木材、书籍等。 7、粘合剂：用于砂布、砂轮、模型、乐器、铅笔、木材、书籍等。主要原料：制取明磁的主要原料是猪、牛、羊等动物的皮，包括鲜皮和干皮。皮产主要来自两方面。第理制革厂制革时割下的边角皮，零碎破以及不适合制革的皮；第二是肉类加工厂、食品厂剥下的鲜猪皮。皮料种类、性状及用途种类性状用途鲜皮类、牛皮、上剖皮：制革厂机械剖下的牛皮中心层，两面光洁不带皮下层。下剖皮：一面光洁，一面略带皮下层。制上等明胶、制一般明胶。牛块皮：制革厂不用的牛头，脚皮和边角零料皮，制上等明胶。重鲜皮：制底革时剖下来的碎牛皮，制工业明胶。猪剖皮：制猪革时剖下的两面光洁的皮。制上等明胶。鲜猪皮：肉类加工厂和食品厂供应的新鲜、冷藏猪皮，制上等明胶。鲜羊皮：制羊革时剖下的碎皮，制一般明胶。鲜杂皮：制其它革时丢弃的皮，如马、驴皮、制皮胶。

人(Human)中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断人（Human）中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL） ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。样品收集、处理及保存方法 1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。 5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱操作注意事项 1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。 4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5.所有液体组分使用前充分摇匀。

明胶酶谱实验方法

明胶酶谱实验 72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L CaCl2, 1μmol/L ZnSO4, 0.01% (v/v) Triton X-100, （0.5% PMSF）。 10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。你加了这个我保证你一辈子也做不出来。蛋白浓度一般是先摸索一个量。就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug 跑一下电泳，先看结果。条带看不见的，或者太透明的，都不能选。就是要半明半暗的那种。看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。

(1)、5%浓缩胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液0.5ml 1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml 10% SDS 30μl 10%过硫酸铵(AP) 30μl TEMED 3μl 3ml (2)、10%分离胶(现配现用)： d3H2O 2.1ml 30%丙烯酰胺溶液 2.31ml 1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml 10% SDS 70μl 10%过硫酸铵(AP) 70μl TEMED 5.6μl 1%明胶0.7ml 7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）： 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS 8ml 50%甘油 3.2 ml 溴酚蓝0.024g d3H2O 2.4ml 20ml

国际明胶产业分布及现状

明胶产业分布及现状明胶行业属化工行业中一个很小的子行业。目前，全球年产明胶36万吨左右，主要集中在西欧、美国、日本、印度和中国，欧洲是世界上最大的皮明胶产地，而亚洲则是全球主要的骨明胶产地，尤以中国、日本和印度3国的骨明胶产量为最大。其中，法国罗赛洛明胶集团（Rousselot France SAS）、德国嘉利达明胶集团（GEL IT A AG）、比利时派宝集团（PB）、美国Kind&knox公司和日本日本Nittm公司这5大西方明胶生产商的总产量合计约占全球明胶市场80%的份额；而法国罗赛洛集团、德国嘉利达明胶集团和比利时派宝集团三家的明胶生产商年总产量达22万吨，占到全球明胶产量60%以上的市场份额。荷兰VOIN食品集团（欧洲100强企业）旗下的法国罗赛洛明胶集团是目前全球最大的明胶生产企业在全世界拥有10家明胶专业生产基地及10家销售公司,目前明胶总产量近90000吨。罗赛洛集团1996年进入中国，目前中国区总部位于上海，在中国拥有4家合资公司：1996年罗赛洛明胶集团在广东省开平市建立其在中国的第一家合资公司罗赛洛（广东）明胶有限公司（年生产6500吨）；2003年，法国罗赛洛明胶集团在浙江省温州市与原浙江三帆明胶厂合资成立罗赛洛（温州）明胶有限公司（年产5500吨）；与平阳县三明食品添加剂厂合资创办了嘉利达（平阳）明胶公司（年产?吨）；2006年07月26日与温州三和盛明胶公司合资组建罗赛洛（浙江）明胶有限公司（年产5000吨）；2006年4月，在吉林省大安市成立第三家合资公司罗赛洛(大安)明胶有限公司（年产3500吨）；

2006年8月, 浙江温州市平阳县城合资公司成立第四家罗赛洛(浙江)明胶有限公司（年产4000吨）。2011年四家中国公司的年生产能力达到21000吨，是目前国内最大的明胶制造商和供应商。(全部满产不少于24500吨)德国嘉利达集团是全球第二大的明胶生产企业，年产明胶8万多吨。在欧洲区、南美洲区、北美洲区及亚太非区拥有23家大型明胶生产企业。在中国，目前在上海设管理总部，在浙江省温州市有2家工厂：嘉利达（苍南）明胶有限公司(年产2000吨)和嘉利达（平阳）有限公司(年产3500吨)，在吉林省辽源市有一家嘉利达（辽源）明胶有限公司（年产4500吨,目标8000吨）。全部满产为13500吨。比利时塔桑德勒（Tessenderlo）集团下属的派宝明胶集团（PB）是世界第三大明胶生产商，年产明胶4.3万吨，在包括中国、美国、德国、英国等六个国家设有工厂，2006年在浙江省温州市平阳县鳌江镇五板桥工业区与浙江飞鹏胶业有限公司合资成立普邦明胶（温州）有限公司（年产量超过3500吨），又于2010年在黑龙江省讷河市孔国乡信义村成立合资普邦明胶（黑龙江）有限公司（3000吨骨胶，2011年5月投产）。全部满产为6500吨。三家外资企业合计最大产能不少于44500吨。我国明胶产业的发展历史较长，源于上世纪50年代。目前，中国国内有100多家明胶生产企业，其中绝大多数为年产量在2000吨以下的小厂，年产量在4000吨上下的企业仅十几家，多为合资企业。而获得国家生产许可证的食用明胶企业有40多家、药用明胶生产企业有20多家。内

Transwell实验超详细之欧阳歌谷创作

Transwell侵袭实验总结欧阳歌谷（2021.02.01）第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一

样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择 3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。

骨明胶

1.必要性（1）符合国家产业政策和发展规划目前国家大力提倡推进高新技术产业化，立足优势领域，依托重点企业，追踪世界前沿技术，逐步实现产业化或形成优势产品，成为带动国名经济的重要支撑力量。（2）是进一步提高企业效益的要求，市场竞争的需要中国已加入WTO，我国将获得一个更加稳定的国际经贸环境，大量外资陆续进入中国，封闭已久的国内市场将要面临世界群雄的争夺，各行各业面临重大的机遇和挑战，明胶行业也不例外。面对这一严酷的事实，要想抓住挑战，迎接挑战，就必须根据市场的变化和人们的需求，充分利用高新技术和设备，进行多元化、产业化发展。因此，明胶项目企业的建设，不但有利于增加企业的经营收入，而且能促进明胶等相关行业的发展，带动一大批大中城市的营销和服务网路，创造就业机会，更是企业自身提高市场竞争能力，参与国际市场竞争的需要。总之，本项目的建设符合我国国情，符合可持续发展战略，有利于提高外贸出口，并能满足人民生活需要，其经济社会效益显著。二.市场分析 1.产业集中度较高，大企业占据较大市场份额

国外的明胶行业厂商数量稳定，优质的明胶企业已经通过兼并等方式占据了较大的市场份额，产业集中度较高。目前世界明胶行业的三大巨头罗塞洛集团、嘉利达公司、派宝公司其总产量达22万吨，占世界总产量3/4。 2.明胶应用领域的扩展带来绣球增加依托先进的行业技术和巨大的市场需求，明胶技术先进国家和地区不断地推动明教用途和品种的开发进程，药用明胶除了作为硬胶囊、软胶囊的外膜材料之外，一些医药新用途相继被发掘，比如用明胶做血浆增溶剂、药用涂膜材料、伤口保护膜的新材料以及维生素A、维生素B、维生素K和鱼肝油等油状药物的微胶囊化外膜涂层材料。明胶产品用途的拓宽，带来了需求量的增加。 3.技术进步拓展原材料攻击范围前几年国际市场上的明胶产品主要利用牛皮、牛骨、猪皮、猪骨等原料生产。而近几年，明胶行业依托强大的研发技术力量，开始寻找新的原材料资源，已陆续开发上市鱼皮明胶，鸡皮明胶等新资源明胶。虽然新资源明胶产量不及骨、皮明胶，但却极大拓展了明胶上游产业链的范围，为明胶行业发展带来了增长动力。 4.欧美等发达国家占据市场主导，新兴国家增长较快从明胶的消费量看，欧洲是世界上最大的明胶市场，为44%，美国居第二，为32%，，其他国家和地区的明胶消费合

酶谱法检测金属蛋白酶活性

原理酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。 2试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量） 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括） ddH2O 4.5ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8） 2.5ml 10% SDS 100ul 10%过硫酸铵（APS）100ul TEMED 8ul 1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml B.浓缩胶的配制浓缩胶6ml ddH2O 4.5ml 30%储备胶0.75ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml 10% SDS 60ul 10%过硫酸铵60ul TEMED 6ul

【CN110133276A】一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910258412.8 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人芜湖森爱驰生物科技有限公司地址 241000 安徽省芜湖市芜湖县安徽新芜经济开发区南次一路369号 (72)发明人王晓波　朱雪姣　朱海峰　 (74)专利代理机构北京润平知识产权代理有限公司 11283 代理人刘兵 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) (54)发明名称一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 (57)摘要本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，所述中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，包括相互独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1由以下物质组成：磷酸盐缓冲液80～ 120mmol/L；谷胱甘肽0.5～1.5mmol/L；表面活性剂0.02～1.5g/L；防腐剂0.05～2g/L；牛血清蛋白15～30g/L；解离剂0.02～1g/L，且所述试剂R1 的pH值为6.5～7.5；所述试剂R2由以下物质组成：磷酸盐缓冲液100～150mmol/L；促凝剂8～ 15g/L；阻断剂2～8mg/L；蔗糖5～15mg/L；中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的纳米微球 20～50mg/L；防腐剂0.01～0.05g/L；其中，试剂 R2中组分浓度为组分在试剂中的终浓度，且所述试剂R1的pH值为6.5～7.5。本发明提供的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒，检测灵敏度高。权利要求书2页说明书7页CN 110133276 A 2019.08.16 C N 110133276 A

人体白细胞的种类和功能

人体白细胞的种类和功能人体内白细胞为无色有核细胞，在血液中呈球形，它能以变形运动穿过毛细血管壁，进入结缔组织。正常5000—10000/mm3。一、种类及特点根据细胞质和细胞核的染色特点，可把白细胞分为两大类：有颗粒白细胞：嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞无颗粒白细胞：淋巴细胞，单核细胞正常时各种白细胞数目保持一定比例，称为白细胞分类计数，正常情况下数目如下：疾病状况下，白细胞总数和分类计数都可发生改变。二、白细胞的功能 ①中性粒细胞白细胞 : 吞噬和消化侵入微生物和机体本身的各种坏死细胞,包括衰老和受损红细胞.是机体防御功能重要组成部分。细胞内溶酶体丰富，并做变形运动。中性粒细胞可通过变形运动渗出毛细血管壁进入组织液,在组织液内游走(趋化性)。如果白细胞的的溶酶体释放的酶量过多，不仅能杀死和溶解细菌，本身也将致死，死亡的白细胞连同细菌分解物一起成为浓液组成部分。 ②嗜酸性粒细胞：能限制嗜碱性粒细胞和肥大细胞中的活性物质的合成和释放；当机体患某些过敏性疾病时，嗜酸性粒细胞数量增多，有人认为她和机体的过敏性反应有关。 ③嗜碱性粒细胞：含有多种生物活性物质，与肥大细胞相似，细胞颗粒中能合成组织胺和过敏性慢作用物质。

组织胺：使小动脉和毛细血管扩张，并使毛细血管和微静脉通透性增加，与人过敏反应有关。过敏性慢作用物质：可使血管通透性增加，并使平滑肌收缩，特别是使支气管和细支气管的平滑肌收缩，从而引起哮喘。总括起来嗜碱性粒细胞所释放的活性物质可引起哮喘，寻麻疹，食物过敏等各种反应，同时又引起嗜碱性粒细胞聚集这一局部。 ④淋巴细胞：具有免疫功能 T细胞：骨髓中生成的淋巴系干细胞在胸腺中发育成熟，参与细胞免疫。血液中 80-90% 淋巴细胞属于T淋巴细胞。 B细胞：造血干细胞在骨髓中分裂分化成B细胞，多集中在淋巴结等淋巴器官中。参与体液免疫—抗体免疫。 ⑤单核细胞：从血管进入组织后，便分化成巨噬细胞，吞噬细菌和病毒等三、白细胞测定临床意义（一）白细胞增加：外周血液中白细胞数超过10×109/L称为白细胞增多症。白细胞增多可以是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞增多。临床常见为淋巴细胞增多症。 1、中性粒细胞增多症生理性：如饭后和剧烈运动后；冷水浴后及极度恐惧和疼痛后等、妇女经期及妊娠等。病理性：（1）急性感染：某些细菌（葡萄球菌、肺炎球菌等）病毒（水痘病毒、狂犬病毒）引起的感染；（2）非感染性炎症，如急性风湿热、少年型类风湿关节炎等（3）组织坏死：严重外伤、手术创伤、烧伤等。（4）急性失血及贫血（5）急性中毒：如化学毒物及药物中毒、尿毒症等。（6）粒细胞异常增生：急性粒细胞白血病，骨髓增生性疾病（7）其他：如脾脏切除后。 2、嗜酸性粒细胞增多症外周血中嗜酸性粒细胞绝对值超过0.45×109/L,称为嗜酸性粒细胞增多症. 嗜酸性粒细胞增多常与许多疾病有关，特别是寄生虫感染和过敏性疾病。３、白血病是骨髓和其他造血组织中原始和幼稚细胞异常增生的一种恶性疾病。临床表现贫血、出血、感染及白血病细胞侵润机体各组织、器官所产生的相应表现。 ⑴病因：病毒：人类T细胞白血病，已肯定是由人T细胞病毒-Ⅰ引起的放射性核素：其致白血病的作用是肯定的，其作用与照射剂量的大小和部位有关化学因素：（如烷化剂、细胞毒药物）及化学毒物（苯）可诱发遗传因素：家族性白血病约占7%。其他血液病：骨髓增生性疾病、淋巴瘤等最终可发展为急性白血病。 ⑵分类：按病程缓急及白细胞分化程度可分为急性白血病：起病急，自然病程约半年以内。骨髓中以原始和早期幼稚细胞增生为主，正常造血受到抑制的恶性疾病。成人以急性粒细胞白血病多见，儿童以急性淋巴细胞较多见。临床表现主要为贫血、出血、继发感染发热及白血病细胞侵润

关于编制骨明胶生产建设项目可行性研究报告编制说明

关于编制骨明胶生产建设项目可行性研究报告编制说明（模版型） v 【立项批地融资招商】核心提示：骨明胶项目投资环境分析，骨明胶项目背景和发展概况，骨明胶项目建设的必要性，骨明胶行业竞争格局分析，骨明胶行业财务指标分析参考，骨明胶行业市场分析与建设规模，骨明胶项目建设条件与选址方案，骨明胶项目不确定性及风险分析，骨明胶行业发展趋势分析 1、本报告为模板形式，客户下载后，可跟据报告说明，自行修改，完成属于自己的，高水平的可研报告，从此写报告不在求人。 2、客户可联系我公司，协助编写完成可研报告，可行性研究报告大纲（具体可跟据客户要求进行调整）编制单位：北京中投信德国际信息咨询有限公司专业撰写资金申请报告项目建议书商业计划书节能评估报告可行性研究报告

目录目录 ............................................................................................................................ - 1 - 第1章骨明胶项目总论 ............................................................................................. ７§1.1 项目背景 ....................................................................................................... ７§1.1.1 项目名称 ............................................................................................. ７ §1.1.2 项目承办单位 ..................................................................................... ７ §1.1.3 项目主管部门 ..................................................................................... ７ §1.1.4 项目拟建地区、地点 ......................................................................... ７ §1.1.5 承担可行性研究工作的单位和法人代表 ......................................... ７ §1.1.6 研究工作依据 ..................................................................................... ７ §1.1.7 研究工作概况 ..................................................................................... ８§1.2 可行性研究结论 ........................................................................................... ８§1.2.1 市场预测和项目规模 ......................................................................... ８ §1.2.2 原材料、燃料和动力供应 ................................................................. ９ §1.2.3 厂址 ..................................................................................................... ９ §1.2.4 项目工程技术方案 ............................................................................. ９ §1.2.5 环境保护 ............................................................................................. ９ §1.2.6 工厂组织及劳动定员 ......................................................................... ９ §1.2.7 项目建设进度 ..................................................................................... ９ §1.2.8 投资估算和资金筹措 ..................................................................... １０ §1.2.9 项目财务和经济评论 ..................................................................... １０ §1.2.10 项目综合评价结论 ....................................................................... １０§1.3 主要技术经济指标表 ............................................................................... １０§1.4 存在问题及建议 ....................................................................................... １０第2章骨明胶项目背景和发展概况 ..................................................................... １１§2.1 项目提出的背景 ....................................................................................... １１§2.1.1 国家或行业发展规划 ..................................................................... １１ §2.1.2 项目发起人和发起缘由 ................................................................. １１§2.2 项目发展概况 ........................................................................................... １１§2.2.1 已进行的调查研究项目及其成果 ................................................. １１ §2.2.2 试验试制工作情况 ......................................................................... １２ §2.2.3 厂址初勘和初步测量工作情况 ..................................................... １２ §2.2.4 项目建议书的编制、提出及审批过程 ......................................... １２§2.3 投资的必要性 ........................................................................................... １２第3章市场分析与建设规模 ................................................................................. １４§3.1 市场调查 ................................................................................................... １４§3.1.1 拟建项目产出物用途调查 ............................................................. １４ §3.1.2 产品现有生产能力调查 ................................................................. １４ §3.1.3 产品产量及销售量调查 ................................................................. １４ §3.1.4 替代产品调查 ................................................................................. １５ §3.1.5 产品价格调查 ................................................................................. １５ §3.1.6 国外市场调查 ................................................................................. １５

明胶酶谱分析法

明胶酶谱分析法一。用品 1.细胞培养或者提取组织 2.试剂的配制（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶） A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大下确定配制胶的量）10% SDS聚丙烯酰胺凝胶5ml（包括） ddH2o 1.5ml 15ml 30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）1.65ml 4.95ml 1.5mol/l Tris（PH 8.8）1.25ml 3.75ml 10% SDS 50ul 150 ul 10%过硫酸铵50ul 150 ul TEMED 4ul 12 ul 1%明胶0.5ml 1.5 ml B.浓缩胶的配制浓缩胶3ml ddH2o 2.1ml 6.3ml 30%储备胶0.5ml 1.5ml 1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.38ml 1.14ml 10% SDS 30ul 90 ul 10%过硫酸铵30ul 90 ul TEMED 3ul 9 ul （3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液 0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）（4）4 ×上样缓冲液 0.32% Tris-HCL 6.4ml 4%SDS（PH7.2）8ml 16%甘油3.2 ml 溴酚蓝0.024g ddH2o 2.4ml (5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 漂洗液；50mmol/L Tris -HCl，5mmol/L CaCl2，1μmol/L ZnCl2，pH7. 6 （7）孵育液：50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 1μmol/L ZnCl2, 0. 02% Brij-35 ,pH7.6 （8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白参考值范围确定资料

转铁蛋白（TRF）测定试剂盒（免疫比浊法）参考值范围确定资料深圳市锦瑞电子有限公司

转铁蛋白（TRF）测定试剂盒（免疫比浊法）参考值范围确定资料转铁蛋白(Transferrin，TRF，TF，又称为铁传递蛋白、血清运铁蛋白、运铁蛋白、嗜铁蛋白、铁糖蛋白)是一种重要的β-球蛋白，是脊椎动物体内铁的运输者。转铁蛋白是体液中不可缺少的成分，不仅参与铁的运输与代谢，参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节，还能调节铁离子平衡和能量平衡，更具有抗菌杀菌的保护功能，因而转铁蛋白具有较全面的蛋白质生理功能。转铁蛋白的主要生理功能是把铁离子从吸收和储存的地方运输到红细胞供合成血红蛋白用，或输送到机体的其他需铁部位。转铁蛋白(transferring，TRF)作为一种特殊的蛋白, 已被广泛应用于临床。血清TRF测定可用于贫血的诊断及治疗的监测。血清TRF升高的最常见原因是缺铁性贫血，研究发现血清铁降低，TRF升高可产生在贫血发生之前。目前，血清TRF测定已普遍应用于贫血的诊断和对治疗的监测。血清TRF测定还有助于肝、肾疾病的病情观察和预后判断。近年研究表明，TRF主要在肝脏内合成，反过来又可促进肝细胞的再生，故肝脏发生病变，血清TRF含量降低，且与病情的严重程度一致。 1. 材料和方法 1.1 对象 2011年9－12月到深圳市蛇口人民医院的体检人员，涉及人群有干部、工人、学生、公司职员和医院职工等，对肝肾功能、血脂、血尿常规各项检测指标正常，血压、B超、心电图、X光透视心肺正常的人员。按性别分为两组，每组各120个参考值数据。 1.2 仪器与试剂采用锦瑞电子有限公司的全自动生化分析仪GS400，试剂为本公司生产的液体双试剂，转铁蛋白（TRF）采用免疫比浊法。校准品和两水平值的质控品均为RANDOX生产，校准品为CAL2350复合定标液，批号为685UN；质控为HN1530和HN1532，批号分别为621UN、434UN。