总RNA提取常见问题分析
总RNA提取常见问题分析
Q：RNA降解
A：
1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样
品过多；匀浆时温度过高。
Q：OD260/OD280比值偏低
1 1 -
A：
1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD2 60/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD 值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
Q：RNA提取得率低
A：
1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RN A的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA 含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。
2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中R NA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。
质粒DNA提取常见问题分析
Q: 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
A:
1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载
体。
3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正
确。
4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或
增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5. 溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分
多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非
常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅
胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗
脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。
Q: 质粒纯度不高，如何解决？
A:
1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2. 混有RNA：RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。
3. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体
用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
4. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。
6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。
1）分离外周血中的单个核细胞（PBMC）
1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上(按常规配制聚蔗糖-泛影葡胺液，比重1.077)，室温中，水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黄层。
2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液.无Ca2+、Mg2+的Hanks液的配制甲液：氯化钠80g，氯化钾4g，加双馏水至500ml；乙液：磷酸氢二钠1.52g，磷酸二氢钾10g，0.4%酚红水溶液50ml，
加水至500ml。取甲液25ml，乙液25ml，加水至500ml；用5. 6%碳酸氢钠溶液调节pH值为7.4～7.6后热压灭菌，即得），混匀后离心200×g 10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g 10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用生理盐水洗去死亡细胞，用0.25％胰蛋白酶液消化细胞。加适量生理盐水吹打，使细胞分散成单个细胞.
2．如果靶细胞是悬浮细胞，则需要用染色剂区分死细胞和活细胞然后再计数。通常用台盼蓝染色细胞，活细胞可以排除进入细胞的台盼蓝而不着染，死细胞着染呈深蓝色。
3．计数血细胞计数板上4个大方格中的全部活细胞，按下式计算活细胞数：活细胞数（个/ml）＝计数的全部活细胞数×10 000×2×1/4)。再用含10％小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC。
巨噬细胞的纯化
1）用帖壁法纯化巨噬细胞
1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的
巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。
2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mmol/L EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。
3．用预冷的Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10分钟，去上清液。最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力，将细胞配成所需的浓度。
2）用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞
1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案
关于质粒抽提的杂菌污染问题解决方案过 对于从事分子生物学的研究的人来说，质粒抽提几乎是每天都用做的常规技术。我们经常会收到来自用户的各种求助，像质粒提取失败了、不是自已想要的那个质粒及提取得率低等等。 其实提取质粒并不难，基本上按照质粒提取试剂盒的说明书，小心操作，一般不会有问题。但是为什么还会有这些问题存在？因为在实验中我们应该注意一些我们经常忽略的细节。可能实验室的环境的污染，操作时的不注意都会造成我们培养细菌时染杂菌，使得在质粒的提取过程中现象出现异常，导致实验不成功。说到这里，有些人可能会问：那我们染的杂菌是什么菌呢？其实大部分为真菌，也有可能是革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌等。 为了让大家能能判断出所用的菌体是否染杂菌，继而能从实验现象可以判断出该原因，我们特意在本实验室里做了一个从染杂菌的细菌中提取质粒的对照模拟实验。 实验方案 编号具体方案 号高拷贝质粒的大肠杆菌1 2号号染杂菌的大肠杆菌3 4号全为杂菌（酵母菌）号 5．6号 实验步骤 根据simgen快速质粒DNA小量试剂盒的说明书的操作步骤进行实验。 实验结果 （一）Buffer II裂解不完全
后溶液变粘稠的澄清液体；而部分BufferII2号为正常的大肠杆菌加入如上图所示1、号加入之后溶液呈不粘稠的浑浊、64号变为粘稠的浑浊液体；全为杂菌的5染菌的细菌3、液体。时，其中的碱性溶液能使革兰氏阴性菌的细胞壁破裂以及蛋白质变Buffer II 在加入号正常的革兰氏阴性细2等细胞内容物。对于1、性，从而释放出质粒DNA、基因组DNA等细胞内容物从而溶液变为粘稠的DNAII溶液能将其细胞壁破裂，释放出质粒菌，Buffer 溶液能号，我们可以看到它出现了粘稠的浑浊液体，这是因为Buffer II澄清液体，而3、4的细胞壁却不能破裂，真菌）溶解正常的革兰氏阴性细菌的细胞但部分杂菌（革兰氏阳性菌、5、6号都为杂菌，不能被破裂的杂菌呈现浑浊状。它们的细胞壁较厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的细胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），细胞内的基因组DNA等其他细胞内容物难以释放，所以它呈现了不粘稠的浑浊状。 （二）拷贝数降低或质粒丢 失． 图2
公文写作常见问题分析
一、标题常见问题分析 公文标题是公文内容的摄要，在发挥公文效能上起着举足轻重的作用。但受诸多因素的影响，公文标题时常出现一些毛病，现归纳为以下八个方面，并作粗浅分析。 （一）要素不全 完整的、规范的公文标题，一般应具备“三要素”，即发文机关名称、事由、文种，以标明由谁发文、为什么发文和用什文种发文。2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》作出明确规定：“公文标题应当准确简要地概括公文的主要内容（事由）并标明公文种类（文种），一般应当标明发文机关”。当然，特殊情况下，也可省略标题中的一至二个要素，但不可随意省略，要相对规范，否则，将毛病百出。 常见的病例有三种： 一是随意省略事由。如《××县人民政府决定》，由于省略事由，受文者看不出标题所反映的主要内容、事项和基本观点，不利于学习、贯彻、领会、落实文件精神。除一些非重要的、极其简短的通知、通告和特殊机关发出的特定公文外（如中华人民共和国国务院、司法部门发出的国务院“公告”、“主席令”、“布告”等），一般情况下不得省略事由。 二是随意省略发文机关。如：一份没有版头的文件标题《关于加强农村党支部建设的报告》，待上级看完文件后，才从落款处知道文件是哪个机关发出的，既不庄重，也不严肃，更不利于公文运转和办理。具有重大决策和事项的下行文不得省略发文机关；没有版头的下行文、上行文均不得省略发文机关，但有版头（发文机关标识）的，也可不标明发文机关。 三是随意省略文种。使受文者不得要领，失去公文的严肃性。如《××乡人民政府关于召开春耕生产会议的有关事宜》。 （二）乱用文种 主要表现在三个方面：
一是混用文种。如《全国人大常委会党组关于县乡换届选举问题的请示报告》，这里把“请示”、“报告”两个不同的文种混淆在一起使用，不论是已经废止的《国家行政机关公文处理办法》，还是自2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》，都没有“请示报告”这一文种，明显不妥。从该“请示报告”的内容看，应使用批转式“报告”这一文种。 二是错用文种。有的该用“请示”的，却用了“报告”，而该用“报告”的反而用的是“请示”；有的该用“函”的却用“通知”；有的把没列为文种的公文种类作为文种使用，如“条例”、“规定”、“办法”、“总结”、“计划”等，以上这些，都不可作为文种使用，不可直接行文。《党政机关公文处理工作条例》所确定的公文文种共有15种，决议、决定、命令（令）、公报、公告、通告、意见、通知、通报、报告、请示、批复、议案、函、纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为“印发”、“颁发”或“通知”的“附件”行文。 三是生造文种。如《关于调整工资的补充说明》、《关于机构改革中有关问题的解释》等，这里的“补充说明”、“解释”均不应作为文种使用，以上两个标题可修定为《××（发文机关）关于印发调整工资补充说明的通知》、《××（发文机关）关于印发机构改革中有关问题解释的通知》。还有的把“安排”、“要点”、“细则”这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，是错误的。 （三）隶属不清 不该用“批转”的，用了“批转”；该用“批转”的却用了“印发”、“转发”，分不清三者之间的隶属关系和词性。如《××县政府办公室关于批转××市长在××会议上讲话的通知》，这里的“批转”使用不当，应该使用“印发”或“转发”。因为“批转”具有“批准转发”之意，是上级对下级报告的认同并转发下去贯彻落实的。下级对上级机关的文件和上级领导同志的讲话、批示等不可使用“批转”，否则将混淆了上下级的隶属关系。 （四）提炼不精。主要表现在标题冗长上。如《×××（发文机关）关于招收退休退职职工子女就业，进行合理安
质粒提取注意事项
1. 质粒制备的基本原理是什么？ 答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。 2. 质粒DNA 制备的关键是什么？ 答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。 3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？ 答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。 4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？ 答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。 5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？ 答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因
公文常见错误分析及对策
公文常见错误分析及对策 公文写作 公文常见错误分析及对策 公文是公务文书的简称，是处理公务、管理事务的一种书面文字工具。其重要特点就是行文的规范化、制度化和标准化。对于公文格式，国家技术监督局制定了《国家行政机关公文格式》（GB/T9704—1999，以下简称《格式》），国务院办公厅制定了《国家行政机关公文处理办法》（2001年1月1日起施行，以下简称《办法》），中央办公厅制定了《中国共产党各级领导机关文件处理条例（试行）》（以下简称《条例》）。但是不少单位和部门制发文件，并没有严格按照规定、要求去做，而是各行其是，制发文件存在很大的随意性，造成公文格式的不规范，严重影响了公文的严肃性、公正性。更在一定程度上影响了公文的质量和效能，影响了政 府的行政效率，因此必须引起高度重视。 一、存在的问题 （一）文种使用乱。一是生造文种。把没列为文种的公文种类作为文种使用。《办法》所确定的公文文种共有13类14种，即：命名、令，决定，公告，通告，通知，通报，议案，报告，请示，批复，意见，函，会议纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为"印发"、"颁发"式"通知"的"附件"行文。例如，《关于××市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定》、《关于使用社会保障卡有关问题的说明》等，这里的"操作规定"、"说明"均不应作为文种使用，可以改成《××关于印发市区退休人员一次性缴纳医疗费分期缴费的具体操作规定的通知》、《××关于印发使用社会保障卡有关问题的说明的通知》，不能作为文种使用的还有"条例"、"规定"、"办法"、"总结"、"计划"等，有的甚至把"安排"、"要点"、"细则"这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，都是错误的。
质粒提取简介问题分析
质粒提取简介及问题分析 一、导论 (一) 质粒提取的原理： 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾，2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(SDS)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。 (二)细菌的收获和裂解。 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1、大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种
公文写作常见错误案例分析
公文写作中常见的错误 1.×市×区区属图书馆为办好图书事业，满足该区群众读书的要求，特向区政府请示增加经费，并将该请示抄送该区人事局、劳动局、物价局、财政局。 错误。抄送单位应当是与该请示事项有关的单位。“人事局、劳动局、物价局”与区图书馆申请经费无关，不应将该请示抄送给他们。 2.某县人事局向县直属各单位下发年终考核工作通知，抄报于该县政府办公室 正确。根据《国家行政机关处理办法》有关规定，向下级机关的重要行文，应抄报上级机关，目的是为了让上级了解情况，避免出现工作中的被动情况。 3.×省×市×区区属瓷器厂因税务问题受到该区税务所的处罚，该厂认为处罚不符合国家税法，特向市税务局申诉，并同时向×省税务厅申诉，并抄报于×市政府、×区政府。 错误。主送单位应当是一个，同时主送，搞乱了行文关系。抄送单位应当是与该申诉事项有关的单位。“×市政府、×区人民政府”，与税务申诉事项无关，不应将该申诉抄送给他们。 4.某县农林局写例行报告，一向县政府汇报1995年全年工作，二在报告中请示了1996年增建农机站的事项，三建议对困难地区减
免乡政府提留费用。 错误。报告中不能夹带请示，且应“一文一事”。 5.×市×工业总公司因市属重点企业×××电器厂因领导班子个别人贪污犯罪，准备调整该厂领导班子，特向市政府请示。并将该请示抄送于该厂办公室。 错误。请示不能抄送下级机关。 6.×市纪检委员会将1997年纪检情况通报于市各直属机关和各局。 正确。该通报属于情况通报，为知照类文件，可以有多个主送机关。 7.中共××市委与市委宣传部就学习贯彻中共第十七次代表大会精神，建设有特色的社会主义联合向下发出通知。 错误。为了维护文件的权威性和法定效用，联合行文的单位应当是同级单位。 8.×市×区职工大学是受区政府和市成人教育局双重领导的单位。该职工大学就1994年需增加教育经费一事，特向两个上级机关请示。 错误。请示只能够有一个主送机关；若是双重领导机关，则需要
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析 质粒, 解析 本帖引用网址：https://www.360docs.net/doc/a012588064.html,/thread-29246-1-1.html 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
碱裂解法抽提质粒原理 溶液I，50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； （溶菌酶：使细胞壁裂解；RNase：将裂解完的RNA去除，防止RNA污染） 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸钾/ 2 M醋酸。 溶液I的作用： ①任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 ②50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。 ③EDTA：EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。 如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II： 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。 要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。 很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。 溶液III 溶液III加入后就会有大量的沉淀，最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。 如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
公文写作中常见问题
公文写作中常见的问题 一、文种使用不当 有的公文作者不了解或不会正确运用确切的文种，以致长期只使用通知、决定等二三个公文，其余文种一概不用；有的公告、通告、通报分不清，望文生义去应用；有的不知公文中报告与请示是两种不同的文种，经常混淆不清，使用时X冠李戴或干脆写成“请示报告”；有的不知有命令（令）、批示函、会议纪要等公文，遇到该使用这些公文的场合则都用通知等公文去代替。 二、格式不规X 公文格式上存在的问题，主要有以下表现： （一）公文文头不规X； （二）标题冗长、混乱、残缺不全； 公文标题中常见病例分析 标题是公文的重要组成部分，它要求主旨鲜明、重点突出、文字简洁、格式规X，是拟写案卷标题和编制档案检索工具的唯一依据。据此，须精心制作。但是，有相当一部分公文标题存在病句，最常见的有两大类：一是语句不合语法规X；二是请示、函、报告三者混淆使用。结合具体病例分析如下： 1、语句不合语法规X
例1、***部、***部、***部、***部优先提高有突出贡献的中青年科学技术管理专家生活待遇的通知。 例2、***高校关于进一步搞活校产办集体企业有关政策的试行办法。 例3、***高校关于加快发展本院彩色印刷品生产若干措施的通知。 例4、***省教育厅关于加快和深化普通高校教育体制改革若干问题的试行意见。 例5、***高校关于认真做好一九九四年表彰优秀教师和教育工作者的通知。 例6、关于夏粮入库的通知 例7、光华公司关于转发光华公司经营承包责任制试行办法的通知 例8、XX县人民政府关于批转XX市人民政府关于批转XX省人民政府关于进行公共场所卫生检查工作的通知的通知的通知例9、强台风紧急通知 病例分析： 例1的介词“关于”应用未用。以标题中四个机关联合发文，其办文意图应是面向全国各单位的，但也可理解为只是面向本系统，易产生歧义，其原因是在发文机关与理由之间缺少了介词“关于”，应补上。
(完整版)碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题
碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用 及提取中可能出现的问题 一、质粒提取三种溶液的作用： 1.溶液I 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 1. 溶液II 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，
公文写作常见问题分析
一、标题常见问题分析 公文标题是公文容的摄要，在发挥公文效能上起着举足轻重的作用。但受诸多因素的影响，公文标题时常出现一些毛病，现归纳为以下八个方面，并作粗浅分析。 （一）要素不全 完整的、规的公文标题，一般应具备“三要素”，即发文机关名称、事由、文种，以标明由谁发文、为什么发文和用什文种发文。2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》作出明确规定：“公文标题应当准确简要地概括公文的主要容（事由）并标明公文种类（文种），一般应当标明发文机关”。当然，特殊情况下，也可省略标题中的一至二个要素，但不可随意省略，要相对规，否则，将毛病百出。 常见的病例有三种： 一是随意省略事由。如《××县人民政府决定》，由于省略事由，受文者看不出标题所反映的主要容、事项和基本观点，不利于学习、贯彻、领会、落实文件精神。除一些非重要的、极其简短的通知、通告和特殊机关发出的特定公文外（如中华人民国国务院、司法部门发出的国务院“公告”、“主席令”、“布告”等），一般情况下不得省略事由。 二是随意省略发文机关。如：一份没有版头的文件标题《关于加强农村党支部建设的报告》，待上级看完文件后，才从落款处知道文件是哪个机关发出的，既不庄重，也不严肃，更不利于公文运转和办理。具有重大决策和事项的下行文不得省略发文机关；没有版头的下行文、上行文均不得省略发文机关，但有版头（发文机关标识）的，也可不标明发文机关。 三是随意省略文种。使受文者不得要领，失去公文的严肃性。如《××乡人民政府关于召开春耕生产会议的有关事宜》。 （二）乱用文种 主要表现在三个方面：
一是混用文种。如《全国人大常委会党组关于县乡换届选举问题的请示报告》，这里把“请示”、“报告”两个不同的文种混淆在一起使用，不论是已经废止的《国家行政机关公文处理办法》，还是自2012年7月1日起施行的《党政机关公文处理工作条例》，都没有“请示报告”这一文种，明显不妥。从该“请示报告”的容看，应使用批转式“报告”这一文种。 二是错用文种。有的该用“请示”的，却用了“报告”，而该用“报告”的反而用的是“请示”；有的该用“函”的却用“通知”；有的把没列为文种的公文种类作为文种使用，如“条例”、“规定”、“办法”、“总结”、“计划”等，以上这些，都不可作为文种使用，不可直接行文。《党政机关公文处理工作条例》所确定的公文文种共有15种，决议、决定、命令（令）、公报、公告、通告、意见、通知、通报、报告、请示、批复、议案、函、纪要。除此之外，均不可直接行文，但可作为“印发”、“颁发”或“通知”的“附件”行文。 三是生造文种。如《关于调整工资的补充说明》、《关于机构改革中有关问题的解释》等，这里的“补充说明”、“解释”均不应作为文种使用，以上两个标题可修定为《××（发文机关）关于印发调整工资补充说明的通知》、《××（发文机关）关于印发机构改革中有关问题解释的通知》。还有的把“安排”、“要点”、“细则”这些既不是公文文种又不是应用文体种类的东西常常作为公文文种直接行文，是错误的。 （三）隶属不清 不该用“批转”的，用了“批转”；该用“批转”的却用了“印发”、“转发”，分不清三者之间的隶属关系和词性。如《××县政府办公室关于批转××市长在××会议上讲话的通知》，这里的“批转”使用不当，应该使用“印发”或“转发”。因为“批转”具有“批准转发”之意，是上级对下级报告的认同并转发下去贯彻落实的。下级对上级机关的文件和上级领导同志的讲话、批示等不可使用“批转”，否则将混淆了上下级的隶属关系。 （四）提炼不精。主要表现在标题冗长上。如《×××（发文机关）关于招收退休退职职工子女就业，进行合理安
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤 一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤： 1. 细菌培养物的生长。 2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒DNA的纯化。 （一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。 （二）细菌的收获和裂解
细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。 ５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。 (三)质粒DNA的纯化 常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒D NA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制
质粒提取常见问题解析
质粒提取常见问题解析 质粒，解析 本帖引用网址：ｈttp：//bｂs.bbioo．ｃｏm/thread—292４6—1－1。ｈtmｌ涂布棒在酒精蘸一下,然后烧一下,能不能保证把所用的菌烧死? 参考见解:涂布棒可以在酒精中保藏,但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒.建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌,37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常??参考见解：这种情况出现的几率较小,常出现在较大质粒或比较特殊的序列中.解决办法:?1、降低培养温度，在２０~2５℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。?2、使用一些特殊菌株，如Ｓuｒe菌株,它缺失了一些重组酶,如rｅc类等,使得质粒复制更加稳定.?3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常: 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味,但不至于反感．而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板,第二天观察单克隆生长情况,LB平板生长的ＤＨ5A正常形态在3７℃１6h后直径在1ｍｍ左右，颜色偏白,半透明状，湿润的圆形菌斑,如果观察到生长过快,颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】?未提出质粒或质粒得率较低,如何解决？ 参考见解: １、大肠杆菌老化:涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。?２、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNＡ提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载 体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 ４、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒,提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液,可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。?5、溶液使用不当:溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液,才能使用。 ６、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率,则需减少ＬＢ培养液体积。?7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) :洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。?8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
总RNA提取常见问题分析汇总
总RNA提取常见问题分析 Q：RNA降解 A： 1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 Q：OD260/OD280比值偏低 A： 1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 Q：RNA提取得率低 A：