实验-愈伤组织的分裂与分化

愈伤组织的分裂与分化

实验目的：1、探索植物细胞的全能性

2、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点

3、愈伤组织培养在植物栽培的意义

实验仪器：超净台、酒精灯、镊子、小刀、烧杯

实验药品：MS培养基、

实验取材：烟草生长部1cm左右，外植体保留一片苗叶（位于侧枝，新叶处）

实验步骤：1、MS培养基的配置

（1）配置大量元素A液和B液

（2）配置微量元素

（3）配置铁盐溶液

（4）配置有机溶液

（5）取大量元素100g/ml，微量元素10g/ml，铁盐溶液10g/ml，有机溶液10g/ml，KT （0.5mg/ml）0.4ml，IBA(0.5mg/ml)0.8ml，脯氨酸500mg，谷氨酰胺500mg，水解络蛋白300mg，蔗糖3%，琼脂0.8%，调节PH=5.8

2、MS培养基的消毒

放于高压蒸汽锅中，灭菌1.5h之后，每瓶摇匀之后，放于24℃的恒温培养室。静置2d之后，观察培养基上有无杂菌的生成。如无，继续实验，如有，则重做培养基

3、外植体的选择

烟草生长部1cm左右，外植体保留一片苗叶（位于侧枝，新叶处）

4、外植体的消毒

（1）用洗涤剂清洗外植体，再蒸馏水洗涤之后，擦干

（2）在超净台上，用75%的酒精溶液洗涤之后，再擦干，之后在2%的次氯酸钠中浸泡5s，蒸馏水冲洗10次，用无菌滤纸吸干。之后用小刀切取生理形状较好的叶片于灭菌的MS培养基中（一瓶放置1-2个）

5、观察有无被污染

在24℃的恒温培养室中暗处理2d之后，观察有无杂菌生成。

6、对照观察

将生理状况相似的愈伤组织分成2组。一组光照，一组黑暗。保证环境的其他的物理性质相同，处理1周之后，观察2组培养物的再分化情况。

7、得出结论

愈伤组织诱导及观察

实验二愈伤组织诱导及观察一.实验目的通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。二.实验内容（一）、实验原理植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。愈伤组织的形成从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照

愈伤组织的诱导和培养

班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基

将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果

实验愈伤组织的继代与分化培养

实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。1）超净工作台等准备工作：同前。 2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。 3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。 4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。五、观察记载内容与实验报告 1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。每隔3天观察一次。 2、实验报告

1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析 A. 描述培养物的变化及其形态特征； B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。

实验二愈伤组织的诱导与分化

实验二愈伤组织的诱导与再分化一、目的掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。二、原理以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。三、实验材料水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；四、仪器设备及用具（一）仪器设备超净工作台培养室（二）用具（每组5人用量）量筒：100ml ×2 培养皿：￠9cm ×1 三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1 枪形镊：×4 无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5 五、试剂及培养基（一）试剂 75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml) (二) 培养基 1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 六、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、消毒剂的配制（1）、75%酒精：每组配95ml 。量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可. （2）、2%NaCLO ：每组配100ml. x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数； y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。 3、种子去壳用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。 4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行）将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 y X= (ml)

愈伤组织诱导及观察

一.实验目的通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。二.实验内容（一）、实验原理植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。愈伤组织的形成从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出

愈伤组织的诱导形成及分化

第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第一节愈伤组织的诱导、形成及特点、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体+培养基+环境愈伤组织愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图 4.1 ）。改变原来的分化方向和代谢方式, 合成代谢加强，合成大量蛋白质和核酸物质，为细胞的分裂和增殖奠定基础外植体外层细胞开始分裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，转向内部的局部地区，并改变分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组织，但不形成维管系统图4.1 愈伤组织的形成特点 1. 诱导期愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。 2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图 4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况分化期分化期

龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验

108 林业科技开发2013年第27卷第1期 doi ：10．3969/j．issn．1000－8101．2013．01．030 龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验袁云香（渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000）摘要：以龙凤竹茎段为外植体，采用不同培养基进行愈伤组织诱导试验。将获得的龙凤竹愈伤组织转入再分化培养基中，采用正交设计实验，添加不同浓度6－BA 、NAA 和蔗糖，组成9种不同的再生植株分化培养基，对龙凤竹愈伤组织进行再分化培养。结果表明:NMB 为最适的基本培养基;诱导培养基中添加6－BA 1mg /L +NAA 0．1mg /L 时，有利于龙凤竹愈伤组织形成，诱导率达86．67%;再分化率最高的培养基配方为NMB +6－BA 2．0mg /L +NAA 0．2mg /L +5%蔗糖。关键词：龙凤竹;组织培养;愈伤组织;再分化 Experiment on callus induction and redifferentiation of Pedilanthus tithymaloides var．nanus ∥YUAN Yun-xiang Abstract ：The stems of Pedilanthus tithymaloides var．nanus were taken as explant and induced callus formation．The dif-ferent culture media ，the proportion of different plant hormone were investigated．To add different concentration 6－BA and NAA to the medium composed of 9different plant regeneration medium by orthogonal design L 9（34）were investigated．The results showed that the suitable media NMB was in favor of the induction ，the induction medium added 1mg /L 6－BA and 0．1mg /L NAA was beneficial to the callus induction．The suitable regeneration medium was NMB containing 2．0mg /L 6－BA ，0．2mg /L NAA and 5%sucrose ，it could improve obviously the frequency of regenerated shoots．Key words ：Pedilanthus tithymaloides var．nanus ；tissue culture ；callus ；redifferentiation Author ’s address ：College of Chemistry and Life Science ，Weinan Teachers University ，Weinan 714000，Shaanxi ，China 收稿日期：2012－08－28修回日期：2012－10－29 基金项目：陕西省教育厅项目（编号：12JK0832）；陕西省教育厅项目（编号：09JK434）；国家自然科学基金项目（编号：31000410）。作者简介：袁云香（1980－），女，讲师，主要从事植物分子遗传学研究工作。E- mail ：yuanyunxiang2006@126．com 龙凤竹（Pedilanthus tithymaloides var．nanus ）为大戟科红雀珊瑚属红雀珊瑚的变种之一，植株小巧玲珑、通体绿色、茎肉质、叶排成两列、株型极为美观，其栽培育种技术已受到人们的高度重视。目前，关于其他变种的多肉多浆花卉的引种栽培研究已有报道，例如红雀珊瑚、玉麒麟、非洲霸王树等品种的栽培技术较为成功。由于龙凤竹种苗资源有限，常规的繁殖方法耗时长、难以满足市场需求［1］。因此，组织培养技术已成为龙凤竹快速繁殖的重要途径。在组织培养过程中，不同培养基、不同植物生长调节剂种类以及同一种植物生长调节剂的不同浓度都会影响龙凤竹愈伤组织植株的再生。因此，开展不同植物生长调节剂对龙凤竹愈伤组织植株再生的影响研究，有利于筛选出一种高效快速的龙凤竹愈伤组织植株再生方法，为龙凤竹的规模化生产研究奠定良好基础。 1材料与方法1．1 试验材料以渭南市花鸟市场购买的龙凤竹当年生枝条的嫩茎为试验材料。1．2试验方法 1．2．1 龙凤竹愈伤组织的诱导剪取龙凤竹当年生枝条的新嫩枝，放入烧杯中，加入适量洗衣粉，在自来水下冲洗约2h 后，再用蒸馏水冲洗5min ，于超净工作台内，先用75%酒精处理15s ，再用0．1%升汞处理8min ，然后用无菌水冲洗5 6次，切成约0．5 1．0cm 的茎段作外植体，接种于诱导培养基上进行培养。诱导培养基基本成分为N 6、 MS 、NMB 、NB 。其中：（1）NMB 为N 6大量元素+MS 微量元素+B5有机元素；（2）NB 为N 6大量元素+B5微量元素及有机元素。4种基本培养基均添加脯氨酸500mg /L +水解酪蛋白300mg /L +6－BA 1．0mg /L +NAA 0．1mg /L +蔗糖3%+0．7%琼脂，pH 5．8（单位下同）。培养条件为24 26?光照培养，光照强度为1500 2000lx 、每天光照时间12h 。21d 后统计诱导率，并观察愈伤组织诱导及生长状技术开发欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗

愈伤组织

愈伤组织愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。概述黑暗培养下烟草愈伤组织在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。形成肉原生质体愈伤组织在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长激素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:l来诱导植物材料愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：

细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。培养愈伤组织的培养的培养分为继承培养和分化培养。愈伤组织的继承培养草莓花药愈伤组织在外植体上形成以后，愈伤组织的继承培养在已充分发育，但没有出现老化现象之前，应及时从外植体上分离下来，转入继代培养基上进行继代培养。分离是必要的措施，继代培养时若连同外植体就会影响愈伤组织的产量和质量，可能是由于残存的外植体在死亡过程中会产生某些有毒物质，愈伤组织会出现老化、粘化及不正常分化等现象。一般情况下，从外植体上分离的愈伤组织须经过4～6周的培养才能得到充分的发育。为了增殖发育良好的愈伤组织，继代培养是有效的措施。在良好的培养条件下，甘蔗愈伤组织可继代一年以上而不丧失分化能力。影响甘蔗愈伤组织继代培养的主要因素是激素。为协调继代培养中既要维持愈伤组织增殖生长良好、又要保持愈伤组织的分化能力的矛盾，就必须筛选最佳的激素浓度。有报道指出，2，4－D （2～3mg/L）对保持愈伤组织不分化是有效的，但随继代培养次数的增加，其分化绿苗的能力也随之下降。

实验三愈伤组织的诱导

实验三愈伤组织的诱导一、实验目的 1．巩固无菌操作技术；掌握愈伤组织的诱导培养方法；了解愈伤组织的形态特征。 2．学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。二、实验原理 1．在适宜的离体培养条件下，已经分化的外植体细胞会发生脱分化而恢复其分裂能力，形成无序生长的薄壁细胞团，即愈伤组织。培养基中的激素配比是影响愈伤形成的关键因素。 2．愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。三、实验材料、仪器及用品 1、材料：实验2培养的甜瓜无菌苗，每人（2人）1瓶。（或烟草苗） 2、仪器及用品：超净工作台，高压灭菌锅，光照培养箱，酒精灯，小喷壶；灭菌的不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、培养皿各33个；灭菌蒸馏水8份；实验1配制的愈伤组织诱导培养基每人1瓶；75%乙醇。四、实验内容及操作方法 1）用75%酒精喷雾、擦拭超净工作台，并将除无菌苗以外的实验用具用75%乙醇喷雾后放入超净工作台中，然后打开超净工作台风机和紫外灯，照射灭菌20min。2）在自来水管下将手洗净，然后用75%乙醇将手消毒，再进入超净工作台操作。3）点燃酒精灯，打开已灭过菌的剪刀、镊子、解剖刀和培养皿等。 4）将培养无菌苗的三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将无菌苗夹取到培养皿中，然后剪取5-6片子叶，剪去叶边缘，并将其剪成3~5mm见方的小片，最后用镊子将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接种8-12片。

5）快速封好瓶口，在瓶壁上标好姓名和接种日期。 6）将接种后的三角瓶置于25℃下暗培养一周，然后在同样温度下进行每天16h 光照和8h黑暗培养，直至愈伤组织形成。 7）将形成愈伤组织的材料进行继代培养。三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。8）封好瓶口，标好姓名和接种日期。 9）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。注意事项： 1）剪切外植体时动作要快，以免造成失水而影响外植体活力。为防止失水，也可在培养皿中滴几滴无菌水进行剪切。 2）操作时双手远离培养皿和三角瓶口，以免污染。五、观察记载内容与实验报告 1、观察记载内容：每瓶接种数，4人小组接种总数，外植体的变化，愈伤形成的时间、数目及其形态特征，污染情况（3天后开始观察）。 2、每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。每隔3天观察一次。 2、实验报告：每人一份。 1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：用流程图表示愈伤组织的培养方法。 4）实验结果与分析 A. 描述愈伤的形成过程及其形态特征； B. 统计愈伤诱导率与污染率，分析引起污染的原因。 C. 描述培养物的变化及其形态特征； D. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。

愈伤组织的诱导形成及分化

第五章愈伤组织的诱导、形成及分化第一节愈伤组织的诱导、形成及特点一、愈伤组织的诱导和形成愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体＋培养基＋环境愈伤组织愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图4.1）。图4.1 愈伤组织的形成特点 1. 诱导期愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h ，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。 2. 分裂期外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。小麦幼胚分裂期分裂期分化期分化期

图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期（东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况而有很大差异。烟草、胡萝卜等的脱分化很容易，而禾谷类则较难；花器官脱分化较易，茎叶较难；幼茎组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。进入分裂期的愈伤组织，如仍在原来的培养基上继续培养，某些愈伤组织将不可避免地发生分化，产生新的结构，但将其及时转移到新鲜的培养基上（继代培养），则愈伤组织可无限制地进行细胞分裂增殖，维持不分化的状态。 3. 分化期愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。愈伤组织分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢直至停止，细胞分裂活动突然转向愈伤组织内部深处的局部地区，并改变分裂面方向，出现瘤状结构外表和内部分化（见图 4.2）。此时，愈伤组织中出现瘤状结构的拟分生组织成为暂不再进一步分化的生长中心。分化的愈伤组织中有维管组织出现，但不形成维管系统，呈分散的节状和短束状结构。二、愈伤组织的保持 1. 愈伤组织的颜色外植体细胞经过诱导启动、分裂和分化等一系列变化后，形成无任何结构的愈伤组织。新鲜的愈伤组织颜色为奶黄色，也有白色且有光泽者，少数呈淡绿色。老化的愈伤组织则转变为黄色乃至褐色。 2. 愈伤组织的保持时间愈伤组织在原来的培养基上保持一段时间后，由于培养基水分或营养物质的减少，以及愈伤组织本身分泌的代谢产物的不断积累，达到产生毒害的水平后，愈伤组织不再生长，如继续培养，愈伤组织开始老化，直至死亡。一般情况下，愈伤组织在原来的培养基上保持2～3周后，必须转移到新鲜的培养基上进行继代培养（Subculture）。继代培养的方法是将原来的愈伤组织分割成小块转移到新鲜的培养基上，用于继代培养的愈伤组织块必须达到一定的大小，一般直径为5 mm，重量约为100 mg，否则在新鲜的培养基上难以迅速恢复分裂和生长，或者生长十分缓慢。应当注意的是，继代培养时愈伤组织不能硬性分割，因愈伤组织生长时有一个生长核心，一旦破坏，愈伤组织就难以恢复分裂和生长。因此，在分割愈伤组织时要根据具体情况，顺其自然进行分割，同时，还要选择新鲜健康的愈伤组织进行继代培养。 3. 愈伤组织的生长周期愈伤组织自原来的培养基上转移到新鲜的培养基上3～7天即可恢复生长，随后2～3周内生长达到高峰，愈伤组织细胞分裂处于最活跃时期。到这一时期结束时，愈伤组织生长开始缓慢下来，此时愈伤组织体积达到最大。因此，通常在愈伤组织生长达到高峰前进行继代培养，这时愈伤组织中的细胞处于旺盛分裂状态，继代后有利于愈伤组织的恢复生长。否则，愈伤组织在停止生长较长一段时间后再转移到新鲜的培养基上，较难恢复细胞分裂。研究表明，24 C和弱光有利于愈伤组织的保存。据报道，大豆细胞系的愈伤组织在这种条件下可以保存15年。 4. 拟分生组织一般认为愈伤组织是无任何组织结构的细胞团，但组织解剖学的研究表明，完全由均一薄壁细胞构成的愈伤组织极少存在。愈伤组织在分裂期会出现导管细胞、筛管细胞、分泌细胞、毛状体细胞及木栓细胞等，同时还会出现由小而密集分裂细胞构成的细胞团，这些细胞

实验-愈伤组织的分裂与分化

愈伤组织的分裂与分化实验目的：1、探索植物细胞的全能性 2、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点 3、愈伤组织培养在植物栽培的意义实验仪器：超净台、酒精灯、镊子、小刀、烧杯实验药品：MS培养基、实验取材：烟草生长部1cm左右，外植体保留一片苗叶（位于侧枝，新叶处）实验步骤：1、MS培养基的配置（1）配置大量元素A液和B液（2）配置微量元素（3）配置铁盐溶液（4）配置有机溶液（5）取大量元素100g/ml，微量元素10g/ml，铁盐溶液10g/ml，有机溶液10g/ml，KT （0.5mg/ml）0.4ml，IBA(0.5mg/ml)0.8ml，脯氨酸500mg，谷氨酰胺500mg，水解络蛋白300mg，蔗糖3%，琼脂0.8%，调节PH=5.8 2、MS培养基的消毒放于高压蒸汽锅中，灭菌1.5h之后，每瓶摇匀之后，放于24℃的恒温培养室。静置2d之后，观察培养基上有无杂菌的生成。如无，继续实验，如有，则重做培养基 3、外植体的选择烟草生长部1cm左右，外植体保留一片苗叶（位于侧枝，新叶处） 4、外植体的消毒（1）用洗涤剂清洗外植体，再蒸馏水洗涤之后，擦干（2）在超净台上，用75%的酒精溶液洗涤之后，再擦干，之后在2%的次氯酸钠中浸泡5s，蒸馏水冲洗10次，用无菌滤纸吸干。之后用小刀切取生理形状较好的叶片于灭菌的MS培养基中（一瓶放置1-2个） 5、观察有无被污染在24℃的恒温培养室中暗处理2d之后，观察有无杂菌生成。 6、对照观察将生理状况相似的愈伤组织分成2组。一组光照，一组黑暗。保证环境的其他的物理性质相同，处理1周之后，观察2组培养物的再分化情况。 7、得出结论

植物愈伤组织诱导实验

中国海洋大学实验报告姓名：马宁专业年级：生命基地班2009级学号： 040212009020 课程：细胞工程实验题目：植物愈伤组织诱导实验一.实验目的掌握植物愈伤组织诱导的原理和方法。二.实验原理 1、植物组织培养：无菌条件下，培养植物的组织、器官以至单个细胞，使其分裂、增殖和分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，脱分化形成愈伤组织，愈伤组织又再分化根和芽等组织和器官。 2、植物激素控制器官分化理论。 3、超净工作台工作原理本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境。三.主要仪器试剂每人：培养瓶（内含培养基）1个、100mL去离子水1瓶、100mL空试剂瓶1个；两人：超净台胡萝卜无菌器皿、用具的准备：用酒精擦拭盘子、解剖刀及镊子，灼烧后冷却。四.实验操作步骤植物愈伤组织诱导（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。（2）将植物体用自来水冲洗后，用流水冲洗片刻后洗净，切段（5cm左右）。先在70%酒精中浸泡数秒。（3）将材料放入已灭菌的100 ml烧杯中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10-15分钟。

（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中或灭菌过的培养皿中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层部分，切成0.5cm3的小块。弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。（7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。（8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。（9）将接种后的三角瓶，培养于25℃黑暗条件下，20天左右观察，看外植体是否逐渐膨大形成愈伤组织。愈伤组织的形成标志着接种的外植体已脱离分化状态，开始重新恢复分生能力。五.实验结果我自己的胡萝卜褐化了。以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体，统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他现象。样本总数：26瓶污染：13瓶褐化：7瓶出愈率：23.08% 污染率：50% 褐化率：26.92% 六.思考题 1.以大组总瓶数为样本总数，每瓶为样本个体，统计记录愈伤组织诱导培养的出愈率、污染率和其他现象。答：在众多污染的培养基中，有的是长满了白色厚厚的丝状菌毛，有的铺遍了绿色的苔藓状的菌落，还有的是一半金色菌落，一半绿色菌落。我自己的胡萝卜完全褐化了，连培养基的颜色也变成了褐色，胡萝卜和培养基基本快要融合在一起。另外，培养瓶外壁不够透明，也不便于观察。统计结果见上。 2.你如何认识无菌操作对植物组织培养的重要性？你认为在具体操作时还应注意那些事项？答：无菌操作是植物组织培养的基础。做不到无菌操作，组织培养是根本不可能良好的进行

诱导愈伤组织的生长素最常用的是IAA

诱导愈伤组织的生长素最常用的是IAA、NAA和2, 4-D，大多数材料选用2, 4-D，它对愈伤组织的诱导作用优于其它生长素，缺乏2, 4-D是导致直接出芽的原因。最常用的细胞分裂素是KT和6-BA。KT 的主要作用是促进细胞分裂，在分化培养基中，通常是添加KT、6-BA来促进愈伤组织分化。KT对愈伤组织诱导率不大，但在诱导培养基中添加KT 可以改善愈伤组织的质量，在一定程度上能延缓愈伤组织的衰老，延缓其器官分化能力的丧失，从而提高植株再生频率。诱导的MS培养基激素:1mL2,4-D 200ul6BA 分化的MS培养基激素:400ul NAA 200ul6BA 建立山茱萸的组织培养及植株再生体系。方法：分别以山茱萸的叶片、花柄和花托为材料,进行山茱萸不同外植体的离体培养研究,筛选最佳培养基组成。结果：适宜山茱萸叶片愈伤组织诱导的培养基组合为1／2MS,附加BA2．0mg／、IBA 0．5-1．0mg／L；适宜山茱萸花柄、花托愈伤组织诱导的培养基组合为1／2MS,附加BA1．0mg／L、2,4-D 0．5mg／L；在1／2MS附加BA 2．0mg／L、IBA0．05mg／L的培养基上,可诱导不定芽的产生；1／2MS 附加IBA 2．0mg／L的培养基有利于山茱萸试管苗生根。讨论：山茱萸的花托是进行组织培养的最适外植体,白色或翠绿色、结构致密的愈伤组织较易分化产生不定芽。目的:研究山茱萸茎段组织培养技术,为山茱萸优良株系的快繁建立最佳条件. 方法:选择山茱萸优良母株的茎段为外植体,分别在不同的培养基中培养,形成大量丛芽, 再诱导单株苗生根成为完整植株.结果与结论:茎段在WPM+6-BA 2.0 mg*L-1 +ZT 0.1 mg*L- 1+NAA 0.1 mg*L-1培养基上,能形成大量丛芽;在WPM+6-BA 1.0 mg*L -1 +ZT 0.1 mg*L-1+GA3 0.5 mg*L-1+NAA 0.1 mg*L-1中继代培养,可获大量壮苗;切取单株苗在1/2 MS+ 6-BA 0.1 mg*L -1 +IBA 1.0 mg*L-1培养基中能生根,移栽并成活. 红瑞木(Cornus alba L.)山茱萸科(Cornaceae)木来木属(Cornus L.),落叶灌木。叶对生,椭圆形,聚伞花序,顶生。具有较高观赏价值和园林绿化价值。选取红瑞木当年生的嫩枝段为外植体,用自来水冲洗30分钟,在无菌条件下先用70%乙醇表面消毒20秒,再用0.1%HgCl2溶液(加2-3滴吐温)处理8分钟,然后用无菌水冲洗6-8次。消毒后的外植体接种于添加不同生长调节剂的培养基上进行光照培养。接着进行继代培养和生根培养。培养基pH6.2,培养温度为(24±2)°C,光照为14小时/天,光照强度2.52×10-5-4.86×10-5mol.m-2.s-1。结果表明,红瑞木在启动培养阶段出现了严重的褐化现象,取其下部茎段作为外植体,有效地克服了褐化现象,褐化率仅为4.3%。MS+0.50mg·L-16-BA+0.10mg·L-1IBA培养基最有利于外植体芽的萌发。继代培养以MS为基本培养基,植株长势良好,但是丛生芽分化少。以M(MS培养基中的CaCl2·2H2O的浓度为1200mg·L-1)为基本培养基,植株生长健壮,丛生芽生长好且分化多。......(本文共计峨眉四照花(Dendrobenthamia capitata var. emeinsis Fang et Hu.),隶属山茱萸科(Cornaceae)。被列入国家级濒危植物名录药用植物种群中。峨眉四照花也是峨眉山特有的观赏树种,集观叶、观花、观果于一身,具有较高的推广和应用价值。为了保护现有种质资源,减轻资源压力,本试验对峨眉四照花进行了离体快繁研究,为扩大种源,产业化生产峨眉四照花提供了理论基础和技术支持。也为开展四照花类其他植物的组织培养提供了经验。本试验以峨眉四照花为材料,对其组织培养技术进行了研究,初步获得了峨眉四照花的试管苗及其愈伤组织。研究的主要结果如下: 野外采集的外植体,以饱和漂白精溶液+吐温-80法处理10min,污染率较低,且植株褐化现象较轻。对于已污染的材料,进行了青霉素灭菌试验,400万单位/L的青霉素无菌水溶液处理峨眉四照花组培细菌污染苗40min效果最好。在培养基中添加抗氧化剂、抑制剂、吸附剂能有效的抑制峨眉四照花褐变的发生,本试验中以添加活性炭(AC)4g/L效果最好。以茎尖、茎段为外植体,对组织培养及其植株再生进行了研究,结果显示:峨眉四照花采取当年生半木质化嫩茎或茎尖为材料较好,有利于启动。初代最适培养基筛选中,以MS+6-BA1.0mg/L +GA1.5mg/L培养基为最适。茎尖的增殖培养试验中培养基MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L效果较好。峨眉四照花不同部位外植体,愈伤组织的诱导率也不同。愈伤组织诱导能力:茎尖〉茎段〉叶片。以MS+NAA0.5mg/L +6-BA1.0mg/L诱导愈伤组织成功率最高。愈伤组织转接继代培养,最佳愈伤组织继代培养基为:MS+KT0.1mg/L+NAA1.0mg/L。但愈伤组织诱导芽较困难。以桃叶珊瑚带芽茎段为材料,研究不同消毒处理及浓度的激素浓度配比对外植体污染率和侧芽诱导的影响。结果表明:75%酒精处理60s+0.1%HgC2处l 理6min条件下,污染率最低为17.3%;最佳侧芽诱导激素浓度组合为6-BA2mg/L+NAA0.3mg/L,侧芽启动率可达49.4%,且对外植体侧芽的高生长也有较好的促进作用,

愈伤组织诱导及观察

实验二愈伤组织诱导及观察 .实验目的通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。二.实验内容（一）、实验原理植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。愈伤组织的形成从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2?4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽