1班3组微生物自主实验论文—高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测
高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测
一班3组
摘要：本组实验通过从土壤中取样并经过选择培养和梯度稀释，将所得样品进行纯化培养
后染色鉴别，之后挑取菌落进行涂布培养，即可分离出高产纤维素酶菌株。为确定分离得到
的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，我组采用液体发酵法。我组培养基在
培养过程中有菌落生长，后来观察到产生透明圈的菌落，经过分离纯化，进一步筛选出了单
菌落，然后又进行了镜检，最后通过液体发酵，检验了纤维素酶的活性。
关键词：高产纤维素酶菌株、分离、酶活性检测
1.研究方法：
1.1实验材料及用具
土壤、滤纸、刚果红染料、试管、培养皿、玻璃棒、烧杯、酒精灯、称量纸、天平、揺瓶、
摇床、胶头滴管、接种环、接种针、酒精棉球、无菌操作台、离心管、高速离心机、牛津杯
培养基、鉴别培养基、液体发酵法所需培养基
1.2实验方法
1.2.1高产纤维素酶菌株的分离
(1)土壤取样：在富含纤维素的环境中土壤取样，比如取树林中多年落叶形成的腐殖土。
(2)制备选择培养基：
纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 溶解后，
蒸馏水定容至1000mL
(3)制备鉴别培养基：
纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 琼脂
20g 刚果红 0.2g 溶解后，蒸馏水定容至1000mL
(4)选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于
摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5 mL），转
移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。
(5)梯度稀释：按照前面的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释10～1000000
倍。
(6)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：制备鉴别培养基后涂布平板，将稀释度为
104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。
(7)纯化培养：在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，
在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。
1.2.2纤维素酶活力鉴定
(1)发酵培养：取上鉴别培养基长出的单菌落，在无菌环境中将菌株接种到液体培养基中，
然后摇床发酵培养24h。
(2)纤维素酶液获取：取发酵液2ml加入离心管，共加4支，高速离心5min后取出，上清液
即为欲获取的酶液。
(3)酶活性检测：将所取酶液加入到插有牛津杯的鉴别培养基中的牛津杯中，然后30度左右，
放置24h，观察透明圈大小，透明圈越大，说明酶活力越高。
2.结果
培养基在培养过程中有菌落生长
观察到产生透明圈的菌落
镜检结果
菌
革
兰
氏
阳
性
杆
菌
酶活性检验的结果
革
兰
氏
阴
性
杆
菌
革
兰
氏
阴
性
球
菌菌
三个透明圈从左到右依次为：革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性球菌
经测量透明圈直径大小分别为为0.81cm、0.65cm、0.74cm，说明我们组所获得的三种菌种革兰氏阳性杆菌的酶活性最高，革兰氏阴性杆菌酶活性最低，因此革兰氏阳性杆菌较为高产3.讨论
（1）土壤取样：由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，比如树林中多年落叶形成的腐殖土，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
（2）选择培养：目的是为了增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
另外，分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。
（3）我组培养基在培养过程中有菌落生长，同时我们所设置的未菌的对照培养基无菌落产生说明培养基制作合格。
（4）观察到产生透明圈的菌落，则说明获得了分解纤维素的微生物。
（5）纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解纤维素分解菌鉴别培养基所产生的透明圈大小进行定量测定。
（6）纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
4.结论
本次实验成功分离出高产纤维素酶菌株并进行了酶活性检测，检测结果表明我组所分离的几种菌种，革兰氏阳性杆菌较为高产
参考文献：
1.孙海彦,赵平娟,黎绢华,刘恩世,彭明. 纤维素酶高产菌株的筛选及鉴定 [J]. 安徽农业科学. 2011,36.
2.解玉红,宋文华,葛艳辉,曹杨,贾记红,强艳艳,冯炘.土壤和空气中纤维素酶高产菌株的筛选 [J]. 生物技术通讯. 2007,1.
3.李荣杰. 纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化 [J]. 畜牧与饲料科学. 2009,6;9-12.
4.邹剑. 纤维素酶活性检测方法简析 [J]. 吉林农业·C版. 2011,7.
5.张英,张鹏,赵裕蓉. 液体发酵法转化纤维素的研究 [J]. 北京化工大学学报(自然科学版). 1994,4;8.
6.段金柱,张爱莲,曹淡君. 固体发酵与液体发酵生产纤维素酶产率与催化性能的比较[J]. 辽宁畜牧兽医. 2000，3;5-6.
附录：
1.培养基配方：
纤维素粉5g，NaNO31g，KCl0.5g，Na2HPO4·7H2O1.2g，KH2PO40.9g ，MgSO4·7H2O0.5g，酵母膏0.5g，水解酵素0.5g，溶解后蒸馏水定容至1000mL
2.鉴别培养基配方：
纤维素钠5g，NaNO31g，KCl0.5g，Na2HPO4·7H2O1.2g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母膏 1.0g，琼脂20g，刚果红0.2g，溶解后蒸馏水定容至1000mL
3.液体培养基的配方：
纤维素钠5g，NaNO31g，KCl0.5g，Na2HPO4·7H2O1.2g，KH2PO40.9g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母膏1.0g，溶解后蒸馏水定容至1000mL
微生物检测论文
微生物实训论文 张志新 （北京电子科技职业学院 10生物技术 20100005032） 实训题目游泳池水质微生物指标检测与评价 摘要由于学校的游泳池经常开放，学生也开了泳课，所以游泳池水质的好坏直接会影响到游泳者的身体安全。因此我们对游泳池中的水进行了采样，稀释，对水中的微生物进行了培养，观察。看是否有对人体有害的微生物。 关键词游泳池水质微生物 前言 微生物广泛分布于大自然界中，绝大多数微生物对人类和动植物是有益的，有些甚至是必须的：但另一方面，微生物也是造成环境污染、水源变质的主要原因，甚至会引起接触者或饮用者患病。 水体是微生物生存的重要场所。无论是天然水体还是人工水体，水中溶解或悬浮着多种无机或有机物质，能供给微生物营养而使其生长繁殖，所以在各种水体中都有大量的与其环境相适应的各种微生物生存。 游泳池水与人的皮肤、头部等直接接触，水质的好坏将直接影响游泳者的健康。游泳池水质达不到标准会传播流行性角膜炎、中耳炎、痢疾、伤寒等疾病。所以我们必须加强对游泳池水质的管理与检测。 目前，世界各地对游泳池的水质标准都有严格的规定，我国目前已制定颁发了《游泳场所卫生标准》和《游泳池给水排水设备规范》两个技术法规。 一实验方案 国标规定： 游泳池中细菌总数≤1000个／L，大肠杆菌≤18个／L 游泳池水质的检测选用“平板菌落计数”方法进行水中细菌总数的测定，通过制备培养基进行取样培养，测出水体中大肠杆菌及其他菌落总数，进而对水体质量进行评价。 二试验方法 2.1 实验材料 2.1.1 实验器材
2.1.1.1 三角瓶。 2.1.1.2 量筒。 2.1.1.3 pH计或精密pH试纸． 2.1.1.4 高压消毒锅． 2.1.1.5 试管。 2.1.1.6 灭菌平皿：直径9 cm . 2.1.1.7 灭菌刻度吸管：10mL、2mL、1mL . 2.1.1.8 酒精灯。 2.1.1.9 恒沮培养箱。 2.1.1.10显微镜 2.1.2培养基和试剂 2.1.2.1 营养琼脂培养基见GB/T18204.1一2000 中第4章。 2.1.2.2 10 %（m/m）硫代硫酸钠溶液，121℃高 压灭菌20min . 2.2操作步骤 2.2.1 采样瓶的要求和预处理：用于微生物分析的采样瓶要无酸、无碱、无毒的玻璃容器。采样瓶在灭苗前加人足量的10%（m/m）硫代硫酸钠溶液。一般情况下125mL的采样瓶加0.1ml，加完后121℃高压灭菌20min。 2.2.2 用灭菌吸管吸取均匀水样1mL，注人到灭菌平皿内，另取1mL注人另一灭菌平皿内作平行接种．取lmL加到9mL无菌生理盐水中作1 : 10稀释，混匀后 取ZmL分别加到两个无菌平皿内，每皿1mL。 2.2.3 将溶化并冷却至45℃的营养琼脂培养基 倾注平皿内，每皿约15mL，另取一个不加样品的 平皿作空白对照。立即旋摇平皿，使水样和培养 基充分混匀。待琼脂凝固后翻转平皿．置36℃士 1℃恒温箱内培养48h。 2.3 菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落 数，然后再用放大5——10倍的放大镜检查，以 防遗漏．记下各平皿的菌落数后．求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样苗落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中茵落分布又很均匀时．则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，所得结果代表全皿菌落数。 三实验结果与讨论 第一次做出的三个培养皿中均没出现菌落，我们 分析原因可能是取的水样是表层水和进水口的水。于 是我们又进行了第二次采样，采取了深一些的水并避 开了放水口，按照标准实验步骤做完实验培养任然没 有菌落生成。 四实验结论
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板
本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月
产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株
目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 作者：王春学号:11101680 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2 菌株的分离 1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
模板土壤微生物的分离培养技术实验报告.doc
重庆大学研究生专业实验教学 实验报告书 实验课程名称： 实验指导教师： 学院： 专业及类别： 学号： 姓名： 实验日期： 成绩： 重庆大学研究生院制
一、实验目的 1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法； 2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；； 3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能； 4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 二、实验原理 1、培养基的种类 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。 已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。 培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。 2、接种方法与无菌接种 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。 划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。
高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化
高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化 摘要:在筛选出纤维素酶高产菌株的基础上,对纤维素酶高产菌株ZJW-6采用单因素试验进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得其最优发酵条件?结果表明,菌株ZJW-6产纤维素酶的最优发酵条件是以蛋白胨+(NH4)2SO4为氮源培养基,在30 ℃?pH 6下振荡培养48 h? 关键词:纤维素分解菌;发酵条件;纤维素酶;酶活力 Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic Enzymes Strain ZJW-6 Abstract: The optimum fermentation conditions of high-yield cellulolytic enzymes strain ZJW-6 were studied in this paper. The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method. The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW-6 was as follows: peptone and (NH4)2SO4 as nitrogen source, shaking for 48h at 30℃ and pH 6. Key words: cellulose-decomposing microorganisms; fermentation conditions; cellulose; enzyme activity 纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维素二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称?随着人们对纤维素酶研究的深入,纤维素酶在食品?饲料?环境保护?能源和资源开发等各个领域中发挥着越来越大的作用,因而引起了全世界的关注,其研究也取得了很大进展?但是纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低?生产周期长等问题,大大限制了其大规模工业化生产[1]?对高产纤维素酶菌株ZJW-6采用单因素试验法进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得最优发酵条件,旨在为其工业化发酵生产打下基础? 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种菌种为邢台学院生物化学系微生物实验室筛选并保存的产纤维素酶菌株? 1.1.2 培养基液体培养基:羧甲基纤维素钠10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,硫酸铵0.2 g/L,氯化钠10.0 g/L,去离子水1 000 mL,pH 7.0[2]?
微生物学实验报告
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
产纤维素酶菌种的研究开题报告
一、研究的目的及其意义 1.意义：能源危机这个时代沉重不可避免的话题以及同样重要的环境污染问题需要更加重视。纤维素乙醇作为新的清洁能源的一支,正在备受瞩目的开发研究之中。当前获得的纤维素酶的活性偏低,满足不了工业化生产的要求。虽然微生物可以直接降解天然的纤维素原料,但是,已知的纤维素酶却不能直接高效的降解结晶纤维素。如何快速有效地获得高活性的纤维素酶及产酶菌株成为了研究的热点之一。本实验利用刚果红脱色圈法,从多种含降解纤维素的自然环境中,得到高纤维素酶的细菌,进一步进行紫外诱变处理,获得酶活显著提高且具有遗传稳定性的菌株,最后通过单因素优化实验,初步确定较优的培养条件。这对利用木质纤维素原料的发酵制备燃料乙醇,解决当今世界所面临的环境污染、资源和能源危机等问题具有一定的现实意义。 2.目的 ①了解产纤维素酶微生物分离的基本原理和方法； ②掌握筛选原则与操作方法； ③掌握纤维素酶活力检测原理与方法； ④掌握诱变育种原理与紫外诱变的操作方法； ⑤掌握优化方法； ⑥掌握发酵罐的基本操作； ⑦了解正交分析方法。 二、国内外的研究现状和发展趋势 据估计,通过植物的光合作用,地球上每年合成的植物量约达1.8*1011t,其中有一半是纤维素物质[1,3],我国每年农作物稻秆?产量达6xl08t之多,利用微生物产生的纤维素酶,将这些闲置的纤维素资源水解转化,则可以在能源、词料、食品、纺织、造纸等方面得以有效利用[4,6],不仅可以减少因堆弃和焚烧对环境带来的污染,还将带来的巨大的经济效益和社会价值。 能源危机和环境污染的凸显,使得可再生清洁能源之一的生物质乙醇的进一步研发迫在眉睫。虽然国内外对于发酵工艺和代谢工程的研究较为广泛,但是目前取得的进展仍然存在较大的不足。一方面,人类获得的纤维素酶酶活力偏低,且不能直接高效降解天然结晶的木质纤维素。另一方面,自然界的大量微生物却可以直接快速的利用天然的木质纤维素来迅速繁衍。筛选并获得高活性的纤维素酶及其菌种,对于纤维素乙醇的研究具有重要意义。 三、研究的主要任务 1.调查并充分查阅资料； 2.设计实验方案； 3.样品的采集与处理； 4.实验操作的准备； 5.详细的实验流程；
从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤
从土壤中分离产几丁质酶的真菌 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1材料与方法 1.1培养基 1.1.1平板培养基(1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2摇瓶培养基(1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2菌株的分离 1.2.1菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3菌种的鉴定 1.3.1细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.216SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3聚合酶链反应(PCR)检测PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到
高产纤维素酶菌株的诱变育种
湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级： 姓名：学号： 课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种 课程名称：工业微生物育种学 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日
纤维素酶高产菌株的诱变育种 ( ) 【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结. 【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种 Mutation Breeding of Cellulase High-yield Strain TAO Mi-lin (College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128) 【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects. 【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding 随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 1、纤维素酶 纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。 1.1 纤维素酶的结构 不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶
高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育
湖北农业科学2009年（责任编辑郑威） mineral forming elements ［C ］．Amsterdam ：Elsevier ，1979． 253－292．［6］ NEALSON K H．The microbial manganese cycle ［A ］． KRUMBEIN W E．Microbial geochemistry ［C ］．Oxford ：Blackwell Scientific Publications ，1983．191－221．［7］ TEBO B M ，BARGAR J R ，CLEMENT B G ，et al．Bio-genic manganese oxides ：properties and mechanisms of forma-tion ［J ］．Annu．Rev．Eath．Planet Sci ，2004，32：287－328． ［8］田美娟，邵宗泽．深海抗锰细菌的分离鉴定［J ］．厦门大学学报 （自然科学版），2006，45（2）：272－276． ［9］ SOLOMON E I ，SUNDARAM U M ，MACHONKIN T E．Multicopper oxidases and oxygenases ［J ］． Chem Rev ， 1996，96：2563－2605． ［10］ TONER B ，FAKRA S ，VILLALOBOS M ，et al．Spatially Resolved Characterization of Biogenic Manganese Oxide Pro-duction within a Bacterial Biofilm ［J ］．Appl Environ Micro-biol ，2005，71（3）：1300－1310． 第48卷第1期 2009年1月 湖北农业科学 H ubei A gricultural S ciences Vol．48No.1 Jan ．，2009 收稿日期：2008－10－18 基金项目：鲁东大学基金项目（20053305） 作者简介：冯培勇（1977－），男，山东日照人，硕士，主要从事微生物产酶的研究工作，（电话）132********（电子信箱）fengpeiyong2004＠yahoo．com．cn 。 纤维素是广泛存在于自然界中的一种由许多葡萄糖基组成的大分子物质，可被存在于微生物中的纤维素酶所降解。纤维素酶指的是降解纤维素酶生成葡萄糖的一组酶的总称。目前认为，完全降解纤维素至少需要3种功能不同且互补的纤维素酶组分，即内切葡聚糖酶（C1酶或EG ）、外切葡聚糖酶（Cx 酶或CBH ）、β－葡萄糖苷酶（简称βG ）［1］。纤维素酶的应用随着工业的发展而日趋广泛，不仅能用于生产葡萄糖、酿酒、饲料工业、纺织行业、环卫污物的处理、农产品加工及生物工程等方面［2］，而且可用于服装加工行业［3］。由于野生型菌种的纤维素酶 活力不高，因此，利用各种诱变手段选育高产纤维素酶生产菌一直是国内外研究的热点。本研究通过化学诱变剂NTG 、硫酸二乙酯和LiCl 对一株黑曲霉菌株进诱变，获得了纤维素酶活性显著提高且遗传性状稳定的突变株。 1 材料与方法 1．1材料 1．1．1出发菌株黑曲霉（Aspergillus niger F1）， 本实验室分离保存。 1．1．2 培养基 ①斜面培养基（PDA 培养基）：马铃 高产纤维素酶黑曲霉菌株的化学诱变选育 冯培勇，宿红艳，张 丽，王艳华 （鲁东大学生命科学学院，山东烟台 264025） 摘要：以1株黑曲霉（Aspergillus niger F1）为出发菌株，经过亚硝基胍、硫酸二乙酯和氯化锂诱变处理，选育出1株纤维素酶高产菌株L1。在适宜条件下，其产CMCase 活力为出发菌株的150．2％。关键词：纤维素酶；化学诱变；黑曲霉中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）01－0088-03 Breeding of High-Yield Cellulase Aspergillus niger Mutated by Chemicals FENG Pei－yong ，SU Hong－yan ，ZHANG li ，WANG Yan－hua （College of Life Science ，Ludong University Yantai 264025，Shandong ，China ） Abstract ：A strain ，Aspergillus niger F1，was used as starting strain and mutated by NTG ，DES and LiCl．The strain named L1was bred which could produce high－yield cellulase．Under suitable conditions ，its CMCase activity was 150．2％of the starting strain． Key words ：cellulase ；chemical mutatation ；Aspergillus niger !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
微生物毕业论文题目100例
微生物毕业论文题目100例 生物学中微生物学专业主要涉及微生物制药，环境能源微生物，临床微生物，生物发酵等类别，研究方向不同，论文题目选择也有所不同。以下整理了一些优秀的微生物毕业论文题目。希望对正在写论文的同学一个参考。 1、脲解型微生物诱导碳酸钙沉积研究 2、马铃薯连作对根际土壤微生物生理类群的影响 3、“食品微生物学”实验教学体系的改革与实践 4、病原微生物对人体健康的危害及检测 5、贺兰山东麓荒漠微生物结皮发育过程研究 6、原代鸡胚成纤维细胞中的污染微生物分析 7、油脂降解微生物的筛选及代谢能力影响因素研究 8、深海微生物硝化作用驱动的化能自养固碳过程与机制研究进展 9、地膜降解物对土壤微生物群落结构和多样性的影响 10、微生物酶技术在食品加工与检测中的应用 11、草莓不同生育时期根区微生物多样性及动态变化 12、台湾林檎叶片浸提液对致腐微生物的抑制效果 13、细胞、微生物及其相关培养技术 14、食品微生物学实验模块化教学体系的构建 15、有机无机缓释复合肥对土壤微生物量碳、氮和群落结构的影
响 16、东北传统豆酱发酵过程中微生物的多样性 17、不同教学方法在微生物学教学中的比较研究 18、环境微生物实验教学体系改革和管理 19、食品微生物学课堂教学改革与实践 20、应用型大学微生物学课程教学改革 21、关于有机磷农药的微生物降解技术研究探讨 22、外源汞添加对土壤微生物区系的影响 23、论研讨式教学在《食品微生物学》课程教学中的应用 24、采煤塌陷复垦区先锋植物根际微生物数量的变化 25、微生物实验室培养基的质量控制 26、食品微生物学双语教学模式的探索与实践 27、土壤微生物总活性研究方法进展 28、浅水湖泊沉积物中水生植物残体降解过程及微生物群落变化 29、应用型本科院校微生物实验模块化教学的探索与实践 30、外源生物炭对黑土土壤微生物功能多样性的影响 31、浅谈土壤微生物对环境胁迫的响应机制 32、秸秆还田深度对土壤微生物碳氮的影响 33、水质微生物学检验实验模块的教学探索与实践 34、高师院校微生物学课程探究式教学实践与思考 35、5种江西特色盆景植物根际微生物群落特征比较研究 36、生物工程专业《微生物学》双语教学探索
产纤维素酶细菌的筛选及培养
产纤维素酶细菌的筛选及培养 一、筛选步骤 1、菌种的采集 采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。 2、菌种初筛 （1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。 （2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。 （3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。 （4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。 （5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。 （6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。 （7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。 （8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。 3、菌种复筛 （1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。 二、培养方法 1清洗实验器具 2灭菌 3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基） 4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床） 5稀释菌样 6涂布平板或平板划线 7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了 8观察记录（数量、分布等） 三、培养基种类及其组成 1、初筛 CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。 刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。 无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。 2、复筛 基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min
微生物实验报告
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A 培养基的制备(已提前制备好) B 周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C 土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D 菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
1班3组微生物自主实验论文—高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测
高产纤维素酶菌株的分离与酶活性检测 一班3组 摘要：本组实验通过从土壤中取样并经过选择培养和梯度稀释，将所得样品进行纯化培养 后染色鉴别，之后挑取菌落进行涂布培养，即可分离出高产纤维素酶菌株。为确定分离得到 的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，我组采用液体发酵法。我组培养基在 培养过程中有菌落生长，后来观察到产生透明圈的菌落，经过分离纯化，进一步筛选出了单 菌落，然后又进行了镜检，最后通过液体发酵，检验了纤维素酶的活性。 关键词：高产纤维素酶菌株、分离、酶活性检测 1.研究方法： 1.1实验材料及用具 土壤、滤纸、刚果红染料、试管、培养皿、玻璃棒、烧杯、酒精灯、称量纸、天平、揺瓶、 摇床、胶头滴管、接种环、接种针、酒精棉球、无菌操作台、离心管、高速离心机、牛津杯 培养基、鉴别培养基、液体发酵法所需培养基 1.2实验方法 1.2.1高产纤维素酶菌株的分离 (1)土壤取样：在富含纤维素的环境中土壤取样，比如取树林中多年落叶形成的腐殖土。 (2)制备选择培养基： 纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 溶解后， 蒸馏水定容至1000mL (3)制备鉴别培养基： 纤维素钠 5g NaNO3 1g KCl 0.5g Na2HPO4·7H2O 1.2g KH2PO4 0.9g MgSO4 ·7H2O 0.5g酵母膏 1.0g 琼脂 20g 刚果红 0.2g 溶解后，蒸馏水定容至1000mL (4)选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于 摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5 mL），转 移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。 (5)梯度稀释：按照前面的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释10～1000000 倍。 (6)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上：制备鉴别培养基后涂布平板，将稀释度为 104～106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30℃倒置培养。 (7)纯化培养：在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上， 在300C－ 370C培养，可获得纯化培养。 1.2.2纤维素酶活力鉴定 (1)发酵培养：取上鉴别培养基长出的单菌落，在无菌环境中将菌株接种到液体培养基中， 然后摇床发酵培养24h。 (2)纤维素酶液获取：取发酵液2ml加入离心管，共加4支，高速离心5min后取出，上清液 即为欲获取的酶液。 (3)酶活性检测：将所取酶液加入到插有牛津杯的鉴别培养基中的牛津杯中，然后30度左右， 放置24h，观察透明圈大小，透明圈越大，说明酶活力越高。
微生物学实验报告--第八周
年级：2009 专业：医学检验班级：一班姓名：赵富海学号：2009221792 实验八、细菌的药物敏感试验 【K-B法】 菌种（均为幼龄菌）：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml 药物纸片：青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星 方法： 1.涂菌（棋盘划线法），室温放10min； 2.贴药敏纸片，注意间距（大于24mm）和边距（大于15mm）； 3.置35℃ 24h判读结果。 结果如图所示： 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果 实验结论：金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。 【试管稀释法】 菌种：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml 抗生素：庆大霉素32u/ml 方法： 1.对倍稀释抗生素 2.加菌液0.1ml/管，摇均35℃ 16—18h
3.判读MIC 试验操作如下图所示： 注意 :设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图： 实验结论：MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml 【联合药敏试验】（示教） 金黄色葡萄球菌大肠b 结果判断： 金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读： ①青+链=青单+链单→相加作用 ②青+红=青单+红单→相加作用
③青+万=青单+万单→相加作用 ④青+林＞青单+林单→协同作用 大肠b联合药敏试验结果判读： ①青+红=青单+红单→相加作用 ②青+链=青单+链单→相加作用 ③青+林=青单或林单→无关作用 ④青+南＞青单+南单→协同作用 【实验讨论】 1．K-B法原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。 2.K-B法影响因素 ①培养基的质量，如PH、深度、硬度和表面湿度等； ②药敏纸片的质量，含药量和保存方式； ③接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存； ④试验操作质量：接种细菌后贴片时5~15分钟； ⑤孵育条件，温度和时间：培养时间 16~18h,不要超过24h。 3．稀释法原理： 以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。 4. 稀释法影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。 5．抗生素药物敏感性试验（AST）的意义 ①可预测抗生素治疗的效果，既AST试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败； ②指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给予病人经验性治疗24~48h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物； ③提供所选择药物的依据； ④监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。 6．通过此次实验掌握纸片扩散法（K-B法）、试管稀释法的原理、操作方法、结果的判读及其临床意义，并掌握联合药敏试验结果的观察、判断。