酵母双杂总结
酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交文库构建基本实验流程
一第一链cDNA合成
1. 准备高质量的Poly A 或总RNA
2. 在微量离心管中混匀以下试剂
RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA) 1–2 μl
1.0 μl CDS III 1–2 μl
去离子水补齐体系到4.0 μl
注: 对照实验时，请使用1μg的对照RNA。
CDSIII = Oligo-dT；
CDSIII/6 =随机引物
3. 72°C ，孵育2 min。
4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10s，瞬时离心。
5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。5X First-Strand 缓冲液 2.0 μl
DTT (100 mM)
1.0 μl
dNTP 混合物(10 mM ) 1.0 μl
SMART MMLV 反转录酶 1.0 μl
6. 42°C，孵育10 min。
7. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 h。
8. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。
9. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。
10. 37°C，孵育20 min。
11. 继续进行LD-PCR 扩增。
二第二链cDNA合成（LD-PCR）
1. 建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组，往实验组离心管中加入以下试剂并混合：
第一链cDNA 2 μl
蒸馏水70 μl
10X Advantage. 2 PCR缓冲液10 μl
50X dNTP 混合物 2 μl
5’PCR 引物 2 μl
3’PCR引物 2 μl
10X溶解液10 μl
50X Advantage 2聚合酶混合物 2 μl
总体积100 μl
2. 扩增程序：
30 sec
95°C
x Cycles
95°C 10s
68°C 6 min
5min
68°C
3. 对每个样品取7 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
三CHROMA SPIN.+TE-400纯化柱纯化ds cDNA
1. 将剩余的93ul的cDNA样品加入CHROMA SPIN TE-400 纯化柱中，颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。移除顶端帽子，掰断柱底部的break away,将柱放置在2ml 的收集管中。
2. 700 rpm，5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让matrix半干。
3. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上方加入93ul的样本。
4. 700 rpm，5 min离心，样本便流到了收集管中。
5. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA：
加入1/10体积的3 M 醋酸钠。
加入2.5倍体积的冰乙醇(95–100%)。
–20°C ，1 hr放置沉淀。
14,000 ，室温离心20 min。
弃上清，14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。
空气干燥10 min。
6. 20 μl 去离子水重悬cDNA，用于酵母文库构建。
四建立Mate & Plate 文库
1. 遵循酵母转化系统文库规模酵母转化操作，向0.5ml Y187感受态中共转化下列组份：
已纯化的ds cDNA 2–5 μg
pGADT7-Rec (0.5 μg/μl) 6 μl
2. 按照转化操作的第二步，将酵母重悬于15ml 0.9% (w/v) NaCl中。
3.将100 μl 的1/10 、1/100稀释液分别铺板于SD/–Leu 100 mm 固体培养基上，30°C，孵育3–4d，确定文库的库容。
4. 将剩下的悬浮液铺板于150 mm SD/–Leu选择培养基上，每板100 μl 悬浮液，约使用150板，30°C 孵育3-4d
5. 收获Step4中的转化子：
a. 4°C ，3–4 h冷却培养板。
b. 加入5 ml 的冻存液（YPDA/25%甘油）。
c. 使用无菌的玻璃珠分离菌落（缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。
d. 将所有的液体收集于无菌的单管中(收集后的体积要达到0.5 L)。
e.用血球计数板来计算细胞密度，若细胞密度小于<2 x 107/ml，离心来减少悬浮液的体积。
f. 将文库分装到2ml的离心管中（1ml/管），-80℃贮存。
6. 取1ml单管文库进行筛选。
酵母细胞感受态的制备及转化
小样转化文库转化
1 在转化实验的两天前，于YPD培养基的平皿上活化酵母菌株(Y2H/Y187)。
2. 转化前一天，挑取活化的酵母细胞（单克隆）于YPDA液体培养基中，30°C，
200rpm培养8-12h。
50ml 150ml
3. 取5μl上述酵母细胞液于50ml的YPDA培养基中， 30°C，200rpm培养
8-12h至OD600>1.5。
300ml 1L
4.将上述酵母细胞液离心后转接到新的YPDA液体培养基中，使OD600=0.2，
30°C 200rpm培养4-6h，使OD600=0.5
1.0
5. 700g 离心 5分钟收集酵母细胞，用无菌水或TE洗酵母细胞。
25-50ml 500ml
6. 再次700g 离心 5分钟。
7. 弃上清，用1.1×TE/LiAc重悬酵母细胞。
1.5ml 8ml
8. 往离心管里加入如下试剂及DNA:
?DNA-BD/baita
?AD/library
?Herring testes carrier DNA 0.1 μg
0.1 μg
0.1 mg
0.2–1.0 mg
0.1–0.5 mg
20 mg
9. 加入感受态细胞，吸打均匀
0.1 ml 8 ml
10. 加入PEG/LiAc缓冲液，高速漩涡混合
0.6 ml 60 ml
11. 200rpm,30度孵育30min
12. 加入DMSO，轻轻混合
70 μl7.0 ml
13. 42度，40min水浴
14. 冰浴1-2min
15. 室温高速离心(14000g)
5s 5min
16. 弃上清，用1×TE重悬，进行涂皿操作
0.5ml 10ml
酵母文库的筛选
A 诱饵质粒自激活活性检测和毒性检测
1. 诱饵载体和对照空载体转化酵母Y2H细胞，取100μL涂布SD/-Trp固体培养板，30°C倒
置培养3-4天待菌落长出。
2. 挑(2-3 mm)单克隆至50 ml SD/–Trp 液体培养基中，30°C摇床230-260 rpm，16-24 hr后，菌落
PCR检测目的基因是否转入Y2H中，-70°C保存阳性菌种。
3. 将阳性克隆在SD/-Trp/X-gal(SDO/X) SD/-Trp/X-gal/Aba(SDO/X/A)平板上划线，30°C
倒置培养2天。
4．观察有无蓝色菌斑的出现，菌斑不显蓝色则表明无自我激活活性；若实验菌斑与对照生长状况相同，则诱饵载体对酵母无毒。
注：所需涂的皿及其生长结果如下表：
sample Selective agar plate 2mm colony colour
Y2H[pGBKT7::bait] SDO[SD/-Trp] Yes white
Y2H[pGBKT7::bait] SDO/ X-Gal Yes white
Y2H[pGBKT7::bait] SDO/ X-Gal /Aba NO no
DDO/ X-Gal /Aba NO NO
Y2H[pGBKT7::Lam]+
Y187[pGADT7-T]
DDO/ X-Gal /Aba Yes blue
Y2H[pGBKT7::53]+
Y187[pGADT7-T]
B 结合实验及筛库
1．在冰上冻融1ml文库（酵母菌株≥ 2 x 107cells Y187文库）。
2．在2L三角瓶中，加入5ml 含Y2H酵母菌（≥1 x 109cells/ ml目的蛋白bait）的培养基和上述冻融的1ml文库。
3．加入45ml 2×YPDA/Kan (50μg/ml)，30-50rpm，30℃，mating 20-24小时，mating 20小时后可取5μl到显微镜下观察，如还没有结合子存在，再mating 4小时，否则停止mating进入下面操作。
4．准备SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp（QDO）培养基平板，约150个（涂皿前应在超净工作台上吹2-3小时）。
5．转移mating体系至2个50ml离心管中，1000g室温离心10分钟，弃上清液。然后再加入2×YPDA洗一次酵母细胞，1000g室温离心10分钟，弃上清液。再用灭菌水清洗酵母细胞，两管合并，1000g室温离心10分钟，弃上清液，加入约10 ml灭菌水重悬酵母细胞。
6．涂皿，每平板加入150μl上述悬浮酵母细胞用玻璃珠涂开至无流动液体。
7．封皿后置于30℃恒温生长箱，生长4-6天后，选取菌斑大于2mm的菌落，在QDO 平板皿上划线，2-3d后长出的菌落可挑出来做插入片段扩增PCR。
8．将（7）中扩增片段大小不同（PCR验证3次，可大大降低假阳性菌落（约40%））的菌落于QDO、QDO/X-Gal和QDO/X-Gal/Aba培养基上划线（可适当增大X-Gal和Aba 的浓度，以提高筛选的严谨性），封皿后置于30℃恒温生长箱，生长2-3d后观察生长状况。若在QDO上生长，QDO/X-Gal菌落变蓝，QDO/X-Gal/Aba不生长，则存在互作。
将存在互作的菌落进行菌落PCR，将PCR产物送去测序，对测序结果进行分析，看是否存在与花粉的发育、能量传递和合成、核酸结合或者剪切、毒性蛋白等相关的基因。9．挑互作酵母菌株至2ml 2×YPDA中，30°C摇床230-260 rpm，16-24 hr，提取酵母质粒，再转入大肠杆菌中扩增含目的基因的载体，测序，到数据库中比对测序结果，标记感兴趣的互作蛋白。
10．阳性克隆验证：抽出互作的酵母质粒后做点对点验证，注意排除自激活情况。
注：点对点验证涂皿情况及其对应生长情况：
sample DDO QDO QDO/ X-Gal QDO/X-Gal/Aba
Y2H[pGBKT7::bait]+
Yes Yes Blue No
Y187[pGADT7::prey]
Yes No No No
Y2H[pGBKT7]+
Y187[pGADT7::prey]
Yes No No No
Y2H[pGBKT7]+
Y187[pGADT7]
Y2H[pGBKT7::Lam]+
Yes No No No
Y187[pGADT7-T]
Yes Yes Blue Yes
Y2H[pGBKT7::53]+
Y187[pGADT7-T]
酵母双杂实验步骤
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母双杂(共转)
酵母双杂交的原理及实验步骤 吴健2015.12.25 一酵母双杂交的原理 在酵母细胞中，有半乳糖存在的情况下，GAL4 可以激活半乳糖代谢酶GAL1 的转录。GAL4 蛋白包含两个结构域，单独的N 端的结构域(BD)可以特异地结合DNA 但是不能够激活转录；单独的C 端包含一个激活区域（AD）但是如果不能结 合到17-mer 上游激活序列USA G 也不能激活转录。将来自大肠杆菌的LecA DNA 结合域BD 和酵母的GAL4 转录激活域AD 重组后，在酵母中实现了下游基因的转录激活。说明转录因子的BD 和AD 功能域可相互独立地发挥各自的作用，并且在 重组后仍然具有基因转录的活性(Brent and Ptashne, 1985)。酵母双杂交系统就是在 这一分子基础上开发出来的，GAL4 的BD 和AD，分别与能够互作的蛋白X 和Y 融合表达。由于XY 蛋白的结合，实现了GAL4 的BD 和AD 重组，GAL4 就重新获得了转录活性，转录因子就可以驱动报告基因表达(Fields and Song, 1989)。除了 将两个杂合载体BD-X 或AD-Y 转化入同一酵母细胞外，利用两个不同性别的酵母杂交（mating）也是实现BD 和AD 蛋白重组和蛋白互作检测的有效方法(Bendixen et al., 1994)。 Fig1. 酵母双杂原理图
Fig2. 常用两种酵母菌的基因型 Fig3. 常用两种酵母菌的报告基因
Fig4. 常用AD和BD载体图Fig5. 酵母双杂流程图
二酵母双杂交的基本步骤 1 酵母感受态的制备 配制培养酵母YPAD 培养基，以及筛选和转化酵母的SD 培养基，灭菌备用。 1) 用灭菌的接种环从保存的菌种中挑取一小块，在YPAD 培养基上划线分离单菌 落，在30℃培养箱中倒置培养 3 d 活化菌种； 2) 用灭菌的接种环挑取一个2-3 mm，生长时间小于一个月的单克隆到3 ml 的 YPAD 培养基中，剧烈震荡1 min，打散所有的细胞块，30℃震荡培养8 h； 3) 接种5 μl 的培养物到含有50 ml YPAD 的250 ml 的烧瓶中，30℃，250 r/min 震 荡培养20 h，直到OD 600 =0.3； 4) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用100 ml 的YPAD 重悬细胞块，30℃230-250 r/min 震荡培养3-5 h，直到OD 600 =0.4-0.5； 5) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用60 ml 的灭菌的dd H2O 重悬细胞块； 6) 700 g 室温离心5 min，去除上清，用3 ml 的1.1×TE/LiAc 溶液重悬细胞块； 7) 将上清分装到2 个无菌的1.5 ml 的离心管，室温13200 g 离心15 sec； 8) 去除上清，用600 μl 1.1×TE/LiAc 溶液悬浮细胞块，感受态制备完成。制好的 感受态细胞应该立即使用（2 h 以内），不能长时间保存。 2 酵母小规模转化 2) 在预冷无菌的1.5 ml 的离心管中依次加入： 质粒DNA 0.5 μg herring testes carrier DNA（10mg/ml） 5 μl （使用前沸水煮5min，立刻放入冰上）感受态细胞50 μl 轻轻震荡混匀； 3) 加入0.5 ml 的PEG/LiAc 溶液，轻轻在振荡器上震荡混匀； 4) 在30℃水浴中孵育30 min，每隔10 min 混匀一次； 5) 加入20 μl 的DMSO（Dimethyl sulfoxide），42℃水浴热休克15 min，每隔5 min 混 匀一次； 6) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml YPD plus 液体培养基悬浮细胞块； 7) 30℃震荡培养90 min； 8) 最高转速离心15 sec，去除上清，用1 ml 的0.9%的NaCl 溶液悬浮； 9) 取1:10, 1:100, 1:1000 的稀释度涂皿；或者直接取100 μl涂于相应的SD平板上， 10) 30℃倒置培养直到单克隆长出，统计转化效率。挑取单克隆检测以及保存菌种， 备用。
蛋白的酵母双杂交操作手册大全
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
酵母双杂交系统
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂试验
pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。 转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。 另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent 的）。还有什么问题可以继续问我。 1.YPDA配制方法如下： 先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ，加水885ml/L 另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度，20min 。 灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。 121° 15min -80°取菌种，划线，30° 培养3天, 表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。 2.设置阴性对照最好用空载体，因为pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD\-Trp-Leu-His 板上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD\-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。 常用试剂的配制 (1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全 溶解后定容到50 ml, 0.22^011滤膜过滤除菌,-2(rC保存. (2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶 解后定容到50 ml, 0.22^m滤膜过滤除菌,-201保存. (3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶 解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22^011滤膜过滤除菌,4°C保存。 (4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完 全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.22^1111滤膜过滤除菌,4°C保存。 (5) 60%甘油的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121 °C高温蒸汽灭菌20min,4°C保存。 (6) Tris-乙酸(TAE)的配方: 50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0) 工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA YPD培养基 20g/L Difco peptone lOg/L Yeast extract 20g/L Agar(for plates only) 对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可加入15ml0.2%的腺 噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003%)。 加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右
CLONTECH酵母双杂中文版
目录 一）介绍4二）试剂盒物品清单7三）额外附加物品列表9四）酵母菌株11五）酵母载体14六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16方法简述：双杂交文库的构建和筛选17七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19九）构建生成cDNA文库21十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35十三）分析阳性相互作用结果38十四）问题解决指南44十五）参考文献47十六）相关产品50附录A:双链cDNA 合成的典型结果51附录B:酵母感受态的制备—LiAc 法52附录C：单杂交对照载体信息53附录D：双杂对照载体信息54表格列表 Table I．BD Matchmaker 酵母菌株的基因型11 Table II．BD Matchmaker 酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI．RNA 起始浓度和PCR 扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR 筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交实验流程
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母双杂交实验步骤
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株： KC8株 4. 对照质粒：
酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息
酵母双杂总结
酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物(mammal;mammalian)的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。
酵母双杂交实验
酵母双杂交相关实验方法 一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、酵母质粒提取试剂 Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、操作步骤： (1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2)37℃水浴1h。 (3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6)4℃12000rpm离心15min，取上清。 (7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。 (9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。 (10)12000rpm离心15min。 (11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。 (12)取上清，加入等体积的异丙醇。 (13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14)4℃10000rpm 离心5min。 (15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。
二、小规模酵母转化 1、酵母转化试剂： 转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。 (1)M 醋酸锂（Lithium Acetate） (2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v） (3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配） 800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积 (4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE (5)11ml 10×LiAc (6)78ml ddH20 2、操作步骤： (1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2)第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3)下午3:00收集菌体。 (4)室温离心，700g，5min。 (5)弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6)室温离心，700g，5min。 (7)弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。 (8) 1.5ml/管分装细胞。 (9)12000rpm离心15-30s。 (10)弃上清，每管加入600μl 1.1×TE/LiAc重悬细胞，100μl分装到1.5ml管中。 (11)冰上准备转化混合物(与收集菌体同步进行)： PEG3350 (50%) 240μl LiAc (1.0M) 36μl Carrier DNA (10mg/ml) 10μl
酵母双杂交实验
酵母双杂交相关实验方法 1、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、酵母质粒提取试剂 Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、操作步骤： (1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶 （30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。 (3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一 次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。 (7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小 时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。 (9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽 提。 (10) 12000rpm离心15min。 (11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃放 置30min。
(12) 取上清，加入等体积的异丙醇。 (13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14) 4℃10000rpm 离心5min。 (15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。 2、 小规模酵母转化 1、酵母转化试剂： 转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。 (1) M 醋酸锂（Lithium Acetate） (2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50% （w/v） (3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配） 800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积 (4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE (5) 11ml 10×LiAc (6) 78ml ddH20 2、操作步骤： (1) 第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2) 第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3) 下午3:00收集菌体。 (4) 室温离心，700g，5min。 (5) 弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6) 室温离心，700g，5min。 (7) 弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。
酵母双杂交
酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 1、基本思想 酵母双杂交由Fields在1989年提出.他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究.GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合.而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录.DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录. Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动特异基因序列的转录.他们利用Snf1与Snf4的相互作用，将Snf1与BD融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上.其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是他的一个结合蛋白.研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因.该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录.一般地，将BD-X的融合蛋白称作诱饵（bait),X往往是已知蛋白，AD-Y称作猎物（prey），能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因，通过对报告基因的检测，反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用. 2、基本原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的（modular）,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域（DNA binding domain，简称为BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。主要有二类载体：a含DNA-binding domain的载体；b含DNA-activating domain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd）；另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad，VP16）。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动