土壤微生物生物量的测定
《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》Determination of soil microbial biomass ?Fumigation-extraction method
国家标准（征求意见稿）
编制说明
《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》编制组
二0一七年四月
项目名称：土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法
计划编号：20153803-T-326
项目负责单位：中国科学院亚热带农业生态研究所
项目负责人：吴金水
技术委员会：全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC 404）
目录
1、立项背景 (1)
1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 (1)
1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 (1)
2、任务来源 (3)
3、标准制定的原则和依据 (3)
3.1 原则 (3)
3.2确定依据 (4)
4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价 (4)
4.1 适用范围 (4)
4.2 总体框架和主要内容 (4)
4.3熏蒸和提取 (5)
4.4 提取物中碳的测定 (6)
4.5 方法的评价 (8)
4.6方法的应用 (9)
5、与现行法律、法规、标准的协调性 (11)
6、对标准贯彻的建议 (11)
7、参考文献 (11)
1、立项背景
1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大
土壤微生物生物量（soil microbial biomass）是指体积小于5×103μm3活体微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但在有机物质、氮、磷、硫等转化和循环过程中起着关键的作用，不仅是土壤有机质中最活跃的组分，而且可作为土壤养分的储存库，是植物生长吸收利用养分的重要来源，与单个微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际数量与作用潜力。据估计植物吸收N、P、S 的60%，47%和28%分别来自微生物生物量N、P和S。
微生物是土壤中最为活跃的生命体之一，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分( C, N, P, S 等) 循环转化的驱动力，参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等各个生物化学过程（林先贵，2010）。而且，微生物对土壤各种环境因子的变化极为敏感，因而土壤微生物量的变化常被作为土壤肥力、土壤环境污染等其他各种扰动对土壤健康质量影响的灵敏性指标。因此，土壤微生物生物量的研究为从整体上了解土壤微生物的演变与功能提供了一个有效的途径，其对于更好地把握与理解土壤健康的主要影响因素有极其重要的作用，对制定良好措施来提高土壤质量也有重要意义。
1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要
土壤微生物生物量是植物有效养分的储备库和来源，其对土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陆地生态系统中的循环具有重要的影响。土壤微生物生物量库的长期或是季节性变化，不仅可指示土壤质量的变化，而且对于了解土壤养分的动态变化也具有重要的作用，同时也可快速地监控并反映土壤管理的改变和污染的影响。土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物对土壤有机质与养分循环和转化作用的重要方法。
土壤微生物生物量的测定方法有很多，既有传统方法，也有现代方法。20
世纪初发展起来的传统的微生物计数方法至今仍在应用。直到1976年Jenkinson 提出了测定土壤微生物生物量的熏蒸-培养法（FI），土壤微生物生物量库在生态学和微生物学上才得到重视。该方法是基于氯仿熏蒸将土样中微生物细胞杀死和溶解，再用土壤接种，测定培养10天内土样的呼吸，与未熏蒸对照土样比较，由于熏蒸土样微生物被杀死和微生物生物碳的分解，从而使释放的CO2增加。但该方法误差大，耗时长，仅适用pH 5~8的旱土。与此同时还提出采用FI 法测定土壤微生物生物量氮。Anderson等在1978年提出了测定微生物生物量的另一生理学方法，即所谓的底物诱导呼吸法（Substrate-induced respiration，SIR），基本原理是根据添加的易分解基质后，培养初期CO2呼吸速率来估计土壤微生物生物量。SIR方法操作简单，快速，费用低，重现性好，是土壤微生物生物量分析中的经典方法，业已形成国际标准（ISO 14240-1:1997: E）。同时，本单位牵头于2013年开始制定土壤微生物生物量测定的国家标准，于2017年3月颁布了《土壤微生物生物量的测定—底物诱导呼吸法》的国家标准，等同于国际标准（ISO 14240-1:1997: E）。但是，FI和SIR法都有其不足之处。FI法需较长时间（10天），且不适合酸性土壤。SIR法是采用FI法校准，不同的校正系数使采用SIR测定的数据计算得到的微生物生物量碳常常会产生争议，此外SIR 法不适合添加了新鲜有机底物的土壤。Brooks等在1982和1985年分别提出了更直接的估算土壤微生物生物量磷和氮的方法。经氯仿熏蒸的土样直接提取（即熏蒸－提取法，Fumigation-extration，FE）后测定土壤微生物生物量磷和氮。Wu 等（1990）将熏蒸-提取法中碳分析改进为仪器自动分析，重新确定了转换常数，创建了快速、精确、适合各种条件的土壤微生物生物量碳（MBC）测定新方法。以该方法与14C标记技术结合，创建了土壤MBC周转速率、有机底物转化动力学参数、土壤释放CO2-C的微生物与非微生物来源比例测定等3个方法（Brookes et al, 1991; Wu et al, 1993; 2005），并解决了土壤MBC周转速率、有机底物的“激发效应”机理、矿化碳构成等以往长期未明的土壤科学重大学术问题（Wu et al, 1993; 2005；Kouno et al, 2002）。FE法已成为测定土壤微生物生物量最常用的方法，是土壤微生物生物量分析中的经典方法，业已形成国际标准。为了准确地测定土壤微生物生物量，加强科学交流，增进数据共享，促进土壤学科发展，制定《土壤微生物生物量-熏蒸提取法》的国家标准十分必要。
1.3 国家及土壤质量主管部门的要求
标准是经济活动和社会发展的技术支撑，是国家治理体系和治理能力现代化的基础性制度。但是，与经济社会发展需求相比，我国标准化工作还存在较大差距。目前，我国越来越重视标准化工作，相继颁布了《中共中央关于制定国民经济和社会发展第十三个五年规划的建议》和《国务院关于印发深化标准化工作改革方案的通知》（国发〔2015〕13号），以及《国家标准化体系建设发展规划（2016-2020年）》文件。为贯彻落实文件，推动实施标准化战略，加快完善标准化体系，提升我国标准化水平，要求形成具有我国自有知识产权国家标准。借此机遇，我国成立了“全国土壤质量标准化技术委员会”，以期大力发展土壤质量标准化工作，制定适合我国土壤质量监测与分析的相关标准，逐渐构建我国土壤质量标准化体系。2015年，国家标准化管理委员会审核通过并立项了“土壤微生物生物量-熏蒸提取法”（20153803-T-326）国家标准的制定。根据国家标准制定工作的任务及土壤质量国家标准制定的需要，完成该标准的制/修订，对于指导我国土壤质量监测与监管有重要意义。
2、任务来源
根据国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会文件国标委综合【2015】73号《关于下达2015年第三批国家标准制修订计划的通知》，《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》顺利立项。本标准由中国科学院亚热带农业生态研究所承担，归口全国土壤质量标准化技术委员会，计划编号20153803-T-326。
3、标准制定的原则和依据
3.1 原则
（1）本标准的编写依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准
的结构和编写》
（2）本标准的制定与国际标准《Soil quality-determination of soil microbial biomass-Part 2 Fumigation-extraction method》（ISO 14240-2:1997: E）的一致性为等同的原则
3.2确定依据
（1）转化ISO 14240-2:1997方法，形成标准文本
（2）通过实验和验证，确定方法的可行性和适用性
（3）本标准方法准确可靠，能满足土壤科学研究与土壤质量监测分析测试的要求
（4）本标准方法具有普遍适用性广，操作简单，耗费低，易于推广应用。
4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价
4.1 适用范围
本标准详细描述一种通过提取经熏蒸杀死的新鲜土壤微生物中总的有机生物量物质，估算土壤微生物生物量的方法。
本方法适用于估算土壤微生物生物量氮及微生物茚三酮反映的氮，但本标准仅仅描述了测定可提取的有机碳的方法。
熏蒸提取法（FE）适用土壤pH值范围广泛的好氧和厌氧（淹水，稻田）土壤。
本标准适用于包含易分解有机底物和硫酸钾溶液过饱和土壤生物量的测定。
4.2 总体框架和主要内容
本标准在满足GB/T 1.1-2009规定的前提下，总体框架仿照ISO 14240-2:1997方法编排。首先是共性内容，如前言、范围、规范性引用文件、术语和定义，接着是具体的实验方法，如原理、试剂与材料、仪器等，以及最后附录内容。根据以上框架原则，本标准涉及的内容主要有：
（1）范围；
（2）规则型引用文件；
（3）术语和定义；
（4）原理；
（5）试剂与材料；
（6）仪器；
（7）熏蒸和提取；
（8）提取物中碳的测定；
（9）精度；
（10）规范性（A）和资料性附录（B、C）；
（11）参考文献。
4.3熏蒸和提取
熏蒸
干燥器底部平铺湿润滤纸，将进行土样的熏蒸。
称取经前处理（5.1）相当于25～50.0g烘干基的新鲜土样3份，置于玻璃烧杯（6.4）或有盖培养皿（6.5）中。将烧杯或培养皿放入真空干燥器中，并放置盛有25 ml去乙醇氯仿（5.2.2）的烧杯1只，烧杯内放入少量防瀑沸的颗粒（6.10），同时放入一小烧杯碱石灰溶液。抽真空使氯仿剧烈沸腾约2 min。关闭干燥器抽真空阀门，将其在25±2℃暗室孕育22～24h。
如果没有足够的土壤，使用较小的样品规模提供土壤与提取剂的比例保持不变（土水比为1 : 4；w : v）。为获得最大的提取物质，土壤有机质含量超过20％时（有机质含量的测定参照ISO10694）增加土壤与提取液的比例（当土壤有机质含量超过95％时，最大比例是1：30，例如土壤L－layer）。记录使用土壤的质量。
熏蒸结束后，从干燥器中取出含氯仿的烧杯和滤纸。干燥器反复抽真空（6次，每次2min）直到土壤无氯仿味为止。熏蒸好的土壤以备提取用。
另称取不熏蒸土样（50.0g烘干基的新鲜）3份，置于塑料瓶作为对照土样。参照7.2方法，立即用200 ml的K2SO4（5.2.3）进行提取。
提取
为提取有机碳,将熏蒸土样无损地转移到聚乙烯塑料瓶（6.6）中，加入200ml
K 2SO 4（5.2.3），用水平振荡器（6.8）振荡30min （200r min-1），或用立式振荡器振荡45min （60 r min-1），提取液用滤纸(6.3)过滤到塑料瓶中。未熏蒸的对照土壤用同样的方法提取和过滤。
若未即时分析，将熏蒸和未熏蒸的土样在–15℃到-20℃的冰箱中保存。取样分析前在室温下解冻并充分摇匀。
4.4 提取物中碳的测定
土样中微生物有机碳含量可被分析测定，也可以进行土壤样本之间的比较。微生物生物量的确定需要乘以转换系数，此系数是通过添加已知碳含量的微生物细胞后进行熏蒸提取分析，然后换算而得。所有的转换系数都与这个初使数值相关。
碳含量的测定使用重铬酸钾氧化容量法或仪器分析法
重铬酸钾法
（1）原理：强酸条件下，有机质被氧化同时Cr 5+被还原为Cr 3+，剩余的重铬酸钾用来滴定，从所消耗的重铬酸钾量，计算碳的含量。
（2）程序：吸收8 ml 的过虑提取液于圆底烧瓶中，用吸管加入2ml 的重铬酸钾和15ml 的酸混合液。通过冷凝器轻轻地回流混合液30分钟，用20到25ml 水冲洗来使其冷却和稀释。
用同样的方法消化含8ml 的硫酸钾溶液的重复空白样。
加入几滴邻啡罗啉硫酸混合液作为指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴过剩的重铬酸钾来测定。
（3）结果计算
有机碳含量的计算按照公式（1）和（2）
()()H S C D S C g/ml =V V /V MP E 1000/P μ-??????? (1)
式中：
V S ——样品消耗的滴定体积，单位ml;
V H ——回流空白消耗的滴定体积，单位ml;
V C ——未回流空白消耗的滴定体积，单位ml;
M ——重铬酸钾的浓度，单位mol/L
P D ——添加的重铬酸钾溶液的体积，单位ml;
P S ——添加的样本的体积，单位ml ；
E ——有机碳转换为CO2的转换系数，取值3；
()()()K W
W C g /g d r y s o i l =C g /m l P /D +S μμ? (2)
式中：
P K ——提取物的质量，单位g ；
D W ——样本烘干重（按照ISO11465的标准测定），单位g ；
S W ——土壤水（水重（g ）/烘干土重（g ））（按照ISO11465的标准测定）； 微生物生物量碳BC 的计算按照公式（3）：
C C E C B = E / k
(3) 式中：
E C =熏蒸土样提取有机碳的质量?不熏蒸土样提取有机质的质量；
k EC =0.38。
碳光谱分析法
（1）原理：提取的土壤有机碳在过硫酸钾（K 2S 2O 8）溶液中能够氧化为二氧化碳，二氧化碳可以通过红外(IR)或紫外(UV)光谱分析测定。
（2）程序：对于自动化的紫外过硫酸氧化方法，需取5ml 硫酸钾土壤提取液与5ml 聚合偏磷酸钠溶液混合。这个过程可以将土壤提取液中CaSO 4沉淀溶解。过硫酸钾试剂被自动送入紫外氧化室，在这里由紫外光激活使有机碳氧化为CO 2，通过红外线吸收光谱或紫外光谱测定CO 2的含量。
（3）结果计算
计算提取土壤有机碳含量使用公式（4）
()()()()V B K W W C g/g dry soil = V D - B D P /D +S μ??????? (4)
式中：
V ——样本C 浓度，单位μg / ml ；
D V ——磷酸钠稀释样本的体积，单位ml ；
B ——空白
C 浓度，单位μg / ml ；
D B ——磷酸钠稀释空白的体积，单位ml ；
P K——见公式2；
D W——见公式2；
S W——见公式2。
计算生物量BC使用公式（5）
B= E/ k(5)
C C EC
式中：
E C=熏蒸土样提取的有机碳的质量?不熏蒸土样提取的有机质的质量；
k EC=0.45
4.5 方法的评价
氯仿上广泛应用的熏蒸处理方法，不少研究证实氯仿熏蒸对提取土壤非生命有机碳无显著影响。对于可提取有机碳和微生物生物量碳含量很低的土壤，可将提取的土水比由1 : 4（w : v）降为1 : 2，以提高重铬酸钾容量分析法的测定精确度（林启美等，1999；Manjaiah等，2000）。
目前采用的转换系数k EC值，是根据EC与FI法测定的土壤微生物生物量碳的统计学回归关系间接获得的（Vance等，1987；Wu等，1990）。Wu等（1990）提出的k EC值（0.45）高于Vance等（1987）提出的数值（0.38）的原因，是由于仪器分析法测定的结果比容量分析法高18%。其它研究者也提出了不同的k EC值（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990；Dictor等，1998），如Sparling等（1993）比较了熏蒸培养法、底物诱导法和熏蒸提取容量分析法，发现澳大利亚21个土壤的k EC值平均为，低于Vance等（1987）的推荐值。一些研究者将14C标记的微生物加入土壤测定k EC值，如Tate等（1988）发现k EC值与菌龄、生长和收获状态等有关，Eberhardt等（1996）报道细菌的k EC值为0.11～0.39，放线菌和真菌为0.44～0.68，若按土壤细菌和真菌生物量的比例30%和70%推算，其k EC值与Wu等（1990）的推荐值几乎相同。Joergenson（1996）对仪器分析法的k EC值进行了专门研究，结果也与Wu等（1990）的推荐值一致。
FE法比以往的土壤微生物生物量碳测定方法更为快速而简便，适合大量样品分析。但是对于微生物生物量碳含量较低的土壤，熏蒸提取—容量分析法
的精度较低，熏蒸提取—仪器分析法是目前测定土壤微生物生物量碳最为快速和精确的方法，并且适用于各种类型的土壤（Vance等，1987；Ocio等，1990；Inubushi等，1989）。
4.6方法的应用
土壤微生物生物量是土壤N、P、S养分库，在有机物质、N、P、S等循环转化过程中起关键作用。传统的微生物学研究方法是在单个或种群层面上研究其数量与功能，对于土壤微生物生物量缺乏定量地了解。土壤微生物生物量碳不仅是土壤微生物群体大小的指标，而且为从整体上了解土壤微生物的演变与功能提供了一个有效的途径，已广泛应用于土壤生物学、土壤生态学、环境生态学等研究领域。
耕地表层（0～23cm）土壤微生物生物量碳一般为1100～3000 kg hm-2，而草地表层土壤高达1600～7500 kg hm-2，我国耕地和草地表层土壤中土壤微生物生物量碳分别为500～1400 kg hm-2和750～3500 kg hm-2（吴金水，1999；刘守龙等，2003）。尽管土壤微生物生物量碳只是土壤有机碳很少的一部分，一般占土壤有机碳1%～5%（Jenkinson等，1981），但是土壤有机碳最活跃的部分，直接调控土壤有机质的转化过程。已有的研究结果表明，土壤微生物生物量与土壤有机质含量呈线性关系（Jenkinson等，1981；Manjaiah等，2000），并且当土地利用和耕作管理方式等发生变化时，土壤微生物生物量碳的变化更加迅速，短期内（3～5年）就可以检测到，5～10年即可达到新的平衡状态；而土壤有机质的变化需要较长的时期（5～10年）才能检测出来，经过几十年甚至上百年才能达到稳定和新的平衡状态（吴金水，1991）。由于土壤微生物生物量碳与土壤有机质总量的变化有相同的趋势，因此，土壤微生物生物量碳可作为土壤有机质含量变化的早期指示（Powlson等，1987；Insam等，1989；Brookes，1995；Manjaiah等，2000）。
土壤微生物生物量碳主要受气候和环境条件、土壤肥力、施肥和作物种植方式等因素的影响，由于土壤微生物生物量碳随土地利用及管理方式的变化比土壤有机质更为敏感，所以在初期土壤微生物生物量碳与土壤有机碳的比值（B C : O C）必然发生变化。在相同的成土母质和环境条件下，B C :O C比值与土壤管理方式特别是施肥条件有着密切的关系。Wu（1991）根据英国洛桑试验站长期试
验地土壤的测定结果，总结出不同处理的B C : O C比值依次为：休闲0.5%～1.4%，不施肥1.6%～2.0%，施NPK化肥2.0%～2.5%。以该试验地土壤为例，不施有机肥的土壤（有机碳> 1%）B C : O C比值为2.0%～2.5%，低于这一比例范围时，土壤有机质含量趋于下降，反之趋于升高。Powlson（1994）也提出B C : O C比值可作为土壤质量提高或降低的早期警示指标。应当指出的是，在不同的环境条件下土壤微生物生物量碳高低，并不指示土壤有机质含量多寡。在缺少长期实验数据时，不能单独应用土壤微生物生物量碳来反映土壤有机质含量的变化趋势（吴金水等，1999）。
土壤微生物生物量碳的周转时间（Turn-over time），是指土壤中微生物生物量碳组分的流通量达到其总量时所需的理论时间，即土壤微生物生物量碳总量与其代谢速率之比（Wu，1991），反映了土壤微生物生物量的活性及其对土壤有机质的转化能力。据估计，在温带地区土壤微生物生物量碳的周转时间为1.5～2.0年，约为土壤有机碳周转时间的1/15，而在热带和亚热带地区为1年以上。土壤微生物生物量碳周转速率的快慢与土壤有机质变化有密切的关系，土壤微生物生物量碳周转越快，土壤有机质的分解和消耗越快，不利于其积累（吴金水等，2004）。
进入土壤的植物和动物残体以及施入的有机肥料中的碳素，首先经过土壤微生物的矿化作用，转化为微生物生物量碳、腐殖质或腐殖化有机碳、CO2–C 及其他有机物质或称为微生物代谢产物碳。形成的腐殖化有机碳、微生物代谢产物碳，再在微生物的作用下继续分解转化，土壤微生物生物量碳自身也在不断地循环，这些过程构成了土壤碳素循环。土壤微生物生物量碳不仅是土壤碳素循环中的重要环节，同时也是土壤碳素循环的驱动力。
Wu（1991）将14C标记的葡萄糖添加到7个英国土壤中，25℃下培养30 d 后，发现14C标记的葡萄糖碳的矿化率（即释放为CO2–14C的比率）、转化为微生物生物量14C和代谢产物14C（包括腐殖质）的比例分别为48%～69%、11%～26%和20%～30%，葡萄糖的矿化率与土壤粘粒含量成反比，而与微生物生物量和代谢产物（包括腐殖质）的形成比例则相反。
Wu等（1993）另外一个试验结果表明，将14C标记的葡萄糖和黑麦草分别加入到英国草地土壤（加入量均为5 mg C g-1土）培养20～40 d后，14C标记的
葡萄糖的处理，尽管土壤微生物生物量碳增加了33%，而非标记的微生物生物量碳却降低了45%，说明土壤中原有的微生物生物量碳被14C标记的微生物生物量碳取代。加入14C标记的黑麦草处理，在培养期间土壤中原有的微生物生物量碳相对稳定，14C标记的微生物生物量碳增加了60%，表明不同有机碳在土壤中的转化途径存在差异。培养到100 d时，添加葡萄糖和黑麦草的土壤，其土壤微生物生物量碳增加很少，这可能是由于土壤中基础微生物生物量很难改变，因为其生存依赖于相对稳定的土壤腐殖化有机碳库。然而，黄敏等（2004）的试验结果表明对于我国红壤水旱轮作地土壤添加葡萄糖和稻草处理，培养至60 d时土壤微生物生物量碳含量亦显著高于对照处理。
5、与现行法律、法规、标准的协调性
本标准等同转化ISO 14240-2:1997规定的土壤微生物生物量-熏蒸提取法，是对已于2017年3月颁布的国家标准《土壤微生物生物量-底物诱导呼吸法》（GB/T 32723?2016/ISO 14240?1：1997）是有益补充，更具有实用性和操作性。
本标准的制定主要是规范我国土壤微生物生物量的测定方法，扩大其应用范围，为推荐性标准，与现行的法律、法规无冲突。
6、对标准贯彻的建议
《土壤微生物生物量测定-熏蒸提取法》标准操作简单，耗费低，适用土壤pH值范围广泛的好氧和厌氧（淹水，稻田）土壤，能够适用我国土壤肥力监测的要求。本标准完成后，将在增强学科交流和数据共享、促进土壤学科发展方面具有重要的意义。建议中国科学院亚热带农业生态研究所，联合相关的标准化研究机构、检测公司和企业统一组织标准宣传，并提供技术咨询。
7、参考文献
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土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃
凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展(精)
土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展3 黄辉(1陈光水(1谢锦升(1黄朝法(2 (1.福建师范大学福州350007;2.福建省林业调查规划院福州350003 摘要:笔者较为全面地综述了国内外土壤微生物生物量碳的研究成果。笔者针对土壤微生物生物量碳主要受到碳氮限制、树种类型、土地利用方式、管理措施、土壤湿度和温度、土壤质地等因素的影响,提出了今后的研究应集中在以下几个方面:(1加强不同尺度土壤微生物生物量碳的影响因子及调控机理研究;(2进一步加强不同土壤类型下土壤微生物生物量碳动态及调控机理研究;(3对影响土壤微生物生物量碳高低不确定性的因子进行深入研究;(4加强其他因子对土壤微生物生物量碳影响的研究;(5探讨全球气候变化对土壤微生物生物量碳的影响。 关键词:微生物生物量碳;土壤;影响因子;全球变化 Adva nces on Soil Microbial Biomass Ca rbon a nd Its Effect Factor Huang Hui(1Che n Gua ngshui(1Xie J ingsheng(1Huang Chaof a(1 (1.Fujia n N or mal U niversity Fuzhou350007;2.Fujian Provincial Forest ry Survey a nd Planning Institute Fuzhou350003 Abstract:The aut hors review current knowledge of t he p roperty and deter mination of soil microbial biomass carbon a nd several f act ors cont rolling its dynamics bot h at home a nd abroad.By now,t here are several f ac2 t ors influe ncing soil microbial biomass carbon w hich include inhere nt p roperties of t he soil like texture,mois2 ture and temp erature a nd etc.Besides t hese,external f act ors(C a nd N limitation,sp ecies typ e,ma nageme nt measures and diff ere nces in la nd usealso cont rol on soil microbial biomass carbon.Despite intensive resear2 ches in recent years,t he uncertainties of soil microbial biomass still re main f or f urt her studies:(1St re ngt he2 ning eff ect f act ors of soil microbial biomass carbon a nd its cont rol mecha nism at diff erent scale;(2Paying
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
土壤微生物生物量的测定(滴定法)(精)
1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于
土壤微生物研究土壤采集方法
土壤微生物研究规范——II. 土壤样品的运输和贮存 1. 土壤微生物样品的运输 土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。 微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。 如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。 如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下： （1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2 d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。 （2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。 （3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。 （4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。 如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。 如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地
土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数
土壤微生物测定指标的分析方法和适用范围
土壤微生物监测常规测定指标的分析方法和适用范围
其他方法： 一、土壤DNA提取和纯化： 方案1，参考(1, 2) 1.称取样品土样5g, 加入灭菌的石英砂，液氮研磨；
不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min，弃上清。 2.加入1 3.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇30min-2h 3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次； 4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；可考虑再 增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。 5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层； 6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀； 这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。 7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体； 8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。 方案2： 购买DNA提取试剂盒，如SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 或UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO) 二、DNA定量和质量检测： 提取后的DNA使用紫外分光光度法进行浓度和纯度检测。DNA纯度以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值<1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA 。和定量，应用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小及完整度。 三、土壤宏基因组测序 将质检合格的土壤DNA随机打断，加接头序列构建测序文库，利用Roche 454或Illumina Hiseq系统进行测序反应。 四、生物信息分析： 1.原始数据整理、过滤及质量评估： 应用中科院青能所自主开发的质量控制软件QC-Chain进行原始测序数据的质量控制，去除低质量碱基和read，并进行污染序列的监控(3)。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理
土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法-全国土壤质量标准化技术委员会
《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》Determination of soil microbial biomass ?Fumigation-extraction method 国家标准（征求意见稿） 编制说明 《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》编制组 二0一七年四月
项目名称：土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法 计划编号：20153803-T-326 项目负责单位：中国科学院亚热带农业生态研究所 项目负责人：吴金水 技术委员会：全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC 404）
目录 1、立项背景 (1) 1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 (1) 1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 (1) 2、任务来源 (3) 3、标准制定的原则和依据 (3) 3.1 原则 (3) 3.2确定依据 (4) 4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价 (4) 4.1 适用范围 (4) 4.2 总体框架和主要内容 (4) 4.3熏蒸和提取 (5) 4.4 提取物中碳的测定 (6) 4.5 方法的评价 (8) 4.6方法的应用 (9) 5、与现行法律、法规、标准的协调性 (11) 6、对标准贯彻的建议 (11) 7、参考文献 (11)
1、立项背景 1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 土壤微生物生物量（soil microbial biomass）是指体积小于5×103μm3活体微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但在有机物质、氮、磷、硫等转化和循环过程中起着关键的作用，不仅是土壤有机质中最活跃的组分，而且可作为土壤养分的储存库，是植物生长吸收利用养分的重要来源，与单个微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际数量与作用潜力。据估计植物吸收N、P、S 的60%，47%和28%分别来自微生物生物量N、P和S。 微生物是土壤中最为活跃的生命体之一，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分( C, N, P, S 等) 循环转化的驱动力，参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等各个生物化学过程（林先贵，2010）。而且，微生物对土壤各种环境因子的变化极为敏感，因而土壤微生物量的变化常被作为土壤肥力、土壤环境污染等其他各种扰动对土壤健康质量影响的灵敏性指标。因此，土壤微生物生物量的研究为从整体上了解土壤微生物的演变与功能提供了一个有效的途径，其对于更好地把握与理解土壤健康的主要影响因素有极其重要的作用，对制定良好措施来提高土壤质量也有重要意义。 1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 土壤微生物生物量是植物有效养分的储备库和来源，其对土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陆地生态系统中的循环具有重要的影响。土壤微生物生物量库的长期或是季节性变化，不仅可指示土壤质量的变化，而且对于了解土壤养分的动态变化也具有重要的作用，同时也可快速地监控并反映土壤管理的改变和污染的影响。土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物对土壤有机质与养分循环和转化作用的重要方法。 土壤微生物生物量的测定方法有很多，既有传统方法，也有现代方法。20
农田土壤中微生物的检测
农田土壤中微生物的检测01 农田土壤中微生物的检测及探究；摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构；土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子；Microbiologyinthesoilisa；关键词：农田土壤微生物检测展望；土壤微生物是生态系统的重要组成部分,其数量和种类；材料和方法1）材料；1.1仪器和其他用品三角烧瓶培养皿，吸管试管涂布；1.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基农田土壤中微生物的检测及探究 摘要：土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了 土壤的质量，是土壤生态系统稳定性的重要指示因子。通过对农田土壤中微生物的检测，了解农田中微生物的多样性，并从生态功能方面阐述了土壤微生物多样性的作用，并探讨其发展前景。 Microbiology in the soil is a important part of the soil . The diversity and chang eable of its community reflect the quality of the soil to some extend .It is the import ant factor of the soil’steady .we can know the diversity of soil by detect the farmlan d’soil .and account the function of the microbiology from the aspect of ecology. Final ly ,we researched the future of microbiology. 关键词：农田土壤微生物检测展望 土壤微生物是生态系统的重要组成部分, 其数量和种类受耕作制度、地理位置、土壤层次、植被、土壤肥力、气候变化及土壤类型等诸多因素的影响, 在土壤环境中起着重要作用。微生物在土壤中的数量、分布与活动情况, 反应了土壤肥力的高低。不同的土地利用方式导致土壤环境不同。农田中含有着许许多多的微生物，千百年来，微生物在默默的为人类服务而不为人知。了解农田土壤中微生物的种类，从而能够更好的为人类做贡献。通过不同的培养基对土壤中的微生物进行测定，从未得
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸
土壤微生物量研究综述
土壤微生物及微生物量研究综述 陈建国20092133 水保09级 一、研究背景 土壤微生物是生态系统的重要组成部分[1]。土壤微生物一方面对土壤有机物质起分解作用，使有机物质转化成有效养分，另一方面，对土壤中的无机营养元素起固持和保蓄作用[1-4]。土壤微生物在土壤养分转化与循环、维护生态平衡和保护环境等方面具有非常重要的意义。 土壤微生物与植物在根际微环境中进行着复杂频繁的互作。土壤有益微生物通过其代谢活动提高土壤中植物营养元素的有效性，改变了植物根系生理状态，最终促进了植物的定植、生长和发育；植物通过其根际分泌物影响着土壤微生物的群落结构和代谢活性。土壤微生物与植物相互作用不是完全独立的，还受到土壤、温度、水分等多种环境因素影响，进一步研究植物、土壤微生物与环境关系，特别是研究植物一土壤一微生物所构成的系统可为今后进行绿色农业、林业保护和环境保护等提供更有价值的信息[17]。 森林土壤微生物是森林生态系统的重要组成部分之一，在林地枯枝落叶分解、腐殖质合成、土壤养分循环和能量转化中起着重要作用，其数量不仅直接影响土壤的生物化学过程和土壤养分的组成与转化，也是土壤中生物活性的具体体现，是维持和恢复林地生产力的主要因素。森林土壤微生物的种群、数量直接影响土壤理化性质、土壤肥力和森林的生长发育；其分布及活动是森林生产环境综合评价的主要依据之一；也是反映土壤质量、人类干扰以及土地利用变化最为敏感的指标之一。开展森林土壤微生物的研究有助于了解森林生态环境下植被的演替动态，进而揭示天然林土壤生态系统的退化机理和过程，为退化林地土壤生态系统的恢复和重建对策，森林生态安全保障系统的构建提供科学依据。目前，森林土壤微生物的动态变化多见报道，但对其变化规律和调控机理仍缺乏系统全面的认识[25]。 20世纪70年代以来，国内外对此进行了广泛深入的研究，尤其在林地土壤上的研究更加深入细致。近10年来，人们开展了土壤微生物量与环境生态及养分循环等方面的研究，取得了重要进展，如不同生态环境下土壤微生物量的变化，人类活动对土壤微生物量的影响关系等微生物量的空间分布规律明显，如水平分布与植物根系的分布有密切的关系，大量的微生物都集中在根系周围；土壤中微生物分布还具有明显的垂直地带性。微生物量的时间分布及其影响因子分析表明，土壤微生物量的季节变化规律与生境的变化有关，但其变化量的