土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法
1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）
1.1 基本原理
新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器
自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CHCL3）；
2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中
3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、
70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，
仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）
1.4 操作步骤
1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）
1.4.2 熏蒸
称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸
腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理
熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※
1.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。
1.4.5 TOC仪器测定
吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。
1.5 计算
SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.45
2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）
土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下
2.1 基本原理（茚三酮比色法）
Amato和Ladd（1988）研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为α-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反应定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反应态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮（FE-Nnin）。
2.2 实验仪器
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
2.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CH3Cl）；
2）0.5mol/L (K2SO4)溶液：称取硫酸钾（K2SO4）87g，溶于去离子水中，稀
释至1000ml；
3）pH5.2的乙酸锂（LiOH?H2O）溶液：称取氢氧化锂（LiOH?H2O）168g，加
入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶
液调节pH至5.2。
4）茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（C2H6OS）和乙酸锂溶液50ml加入4g 水
合茚三酮（C9H4O3?H2O）和0.12g还原茚三酮（C18H10O6?2H2O）搅拌
至完全
溶解；
5）50%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；
6）1mol/L的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵（称前105℃烘2h）溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，
摇匀，于4℃冰箱中保存。
7）0.1mol/L 的硫酸铵[(NH4)2SO4]标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准储存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此
溶液最好现配现用。
8）工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、
4.00ml、
5.00ml 0.1mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液
定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、
1.5mol/L、
2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。
2.4 操作步骤
2.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
2.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，2g土：8ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表
明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃※，否则将影响浸提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。
2.4.5 分光光度计比色测定（此处沸水浴不好控制※）
吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置于10ml的塑料离心管中，加入2ml茚三酮显色剂，涡旋搅拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min，迅速冷却（冰浴约2min），加入5ml稀释液（50%乙醇水溶液），摇匀于570nm 下比色。
2.5 结果计算
SMBN=(E C CHCL3—E C CK)*稀释倍数*原来的水土比*5
?土壤微生物生物量氮的测定（全氮测定法,建议使用此法）注意：所配的试剂和全自动凯氏定氮仪的试剂一样，具体见农化分析课本
2.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
2.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
2.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，2g土：16ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃※，否则将影响浸提液的效果，，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。
2.4.5 全自动凯氏定氮仪的测定
吸取10ml滤液与消煮管中，加入K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，加入4ml浓硫酸；同时设置2—3空白（10ml的0.5mol/l的K2SO4，加入K2SO4—CuSO4—Se混合催化剂1.08g，加入4ml浓硫酸）；在高温消化（340℃消煮3个小时）至澄清后放置2-3h。然后用全自动凯氏定氮仪测定浸提液中的全氮含量。
2.5 结果计算
E N=(V S-V O)*C H2SO4*14*1000*(16/10)÷W S
式中：E N为全氮，V O为滴定空白对照所消耗的标准硫酸体积（注意：消煮一批土样至少需要3个对照※），V S为滴定土样所消耗的标准硫酸体积，C H2SO4为硫酸浓度（这个浓度要进行标定的，具体见农化分析课本），14为氮的摩尔质量，1000为千克转化成克，16/10为从16ml的提取液中吸取10ml，W S为干土重
所以：土壤微生物生物量氮B n=(E N CHCL3—E N CK)/0,54
见《土壤微生物研究原理与方法》，主编：林先贵中科院南京土壤研究所
3 土壤微生物生物量磷（无机磷测定法）
Brookes等（1982）报道土壤熏蒸处理所释放出来的磷大部分为无机磷酸盐，可被0.5mol/LNaHCO3等提取剂提取，而且熏蒸和未熏蒸土壤之间无机磷的差异，能够反映土壤微生物生物量磷的高低。于是，Brookes等建立了土壤微生物生物量磷的熏蒸提取---无机磷测定法。
3.1 基本原理
新鲜土壤经氯仿熏蒸后（24h），采用0.5mol/LNaHCO3溶液提取被杀死的土壤微生物生物量磷，在锑钼抗混合试剂作用下提取液中正磷酸与钼酸络合形成磷钼杂多酸（在一定酸度条件下），可用磷钼比色法测定提取液最好全磷含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机磷量的差值和转换系数（k p，这个系数很重要，因为如果没有这个系数，所测定的结果就是土壤的速效磷，但是土壤微生物熏蒸后释放的磷大多数是无机磷，而速效磷包括全部水溶性磷、部分吸附态磷及有机态磷，有的土壤中还包括某些沉淀态磷，因此速效磷和无机磷的范畴不一样，不要搞混※）以及外加无机磷的回收率（Rpi）作为校正系数，
从而估算土壤微生物生物量磷。
3.2 实验设备
分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、离心机、烧杯、三角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等
3.3 实验试剂
1）无乙醇氯仿（CH3Cl）；
2）0.5mol/L碳酸氢钠（NaHCO3）浸提液：溶解NaHCO342.0g于800ml 水中，
以0.5mol/LNaOH溶液调节浸提液的pH至8.5，再用蒸馏水稀释至1000ml。
此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pH增高，可于液面加一层矿物油保存。
此溶液储存于塑料瓶中比在玻璃瓶中容易保存，若储存超过一个月，应检查
pH是否改变；
3）磷酸二氢钾溶液【p（KH2PO4）=250 ug p /ml】：称取1.0984g分析纯磷酸二
氢钾（称量前105℃烘2~3h※），溶于去离子水并定容至1000ml；
4）钼锑抗试剂：（间鲍士旦的土壤农化分析课本）
5）磷标准液：准确称取在105℃烘箱中烘干的KH2PO4（分析纯）0.2195g，溶
解在400ml水中，加浓硫酸5ml（加硫酸放置霉菌，可是溶液长期保存），转
入1000ml容量瓶中，加水定容至刻度。此溶液为50ug/ml磷标准液。吸取上
述磷标准液25ml，定容至250ml，即得5ug/mL磷标准液（此溶液不可久
存※）
6）工作曲线：准确吸取5ug/ml磷标准液0、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml分别放入25ml容量瓶中，加水至约20ml，然后加钼锑抗试剂4ml，最后用水定容至25ml。30min后开始进行比色。各瓶比色液磷的浓度分别为0ug/ml、0.1 ug/ml、0.2 ug/ml、0.4 ug/ml、0.6 ug/ml、0.8 ug/ml、1.0 ug/ml磷。
3.4 操作步骤
3.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）
3.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）
3.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）
3.4.4 浸提过滤
从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到250ml聚乙烯提取瓶中，加入200ml 0.5mol/L NaHCO3浸提液（土水比为1:20，考虑到土样的不足，这个部分称取2g土，比值为2g土：40ml NaHCO3），300r/min振荡30min，用慢速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）。
3.4.5无机磷的回收率（很重要※）
另称取经前处理相当于干土2.0g土样2份，分别放入三个50ml聚乙烯提取瓶，加入0.2ml 250 ug p /ml磷酸二氢钾溶液，再加入40ml 0.5mol/L碳酸氢钠（NaHCO3）浸提液，同上进行提取。用于测定外加正磷酸盐态无机磷的回收率（Rpi），以校正土壤对熏蒸处理所释放出来的微生物生物量磷的吸附和固定。土壤提取液也立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）。
3.4.6 分光光度计比色测定
吸取10ml提取液（依样品的含磷而定）于25ml容量瓶中，加入适量的1.0mol/LHCl溶液进行中和，HCl溶液的加入量通常为提取液体积的1/2，放置4h并间隙振荡，以排除溶液中的CO2。补充去离子水至20ml，加入4ml混合显色剂，再加水定容，摇匀。显色完全（约30min）后，在882nm波长处进
行比色。
3.5 结果计算
土壤微生物生物量磷B P= Ept/（Kp*Rpi）单位为mg/kg
式中Ept为熏蒸和未熏蒸的土壤差值，即：(E P CHCL3—E P CK),E P CHCL3（E P CK）=W1(分光光度计的值)*2.5(容量瓶的稀释倍数)*4（40nl浸提液中取10ml）*20（水土比），Rpi=[(外加KH2PO4溶液土壤的测定值—未熏蒸土壤的差值)/25]*100%,其测定和算法也是和E P CHCL3（E P CK）一样；Kp为转化系数，取值为0.4
土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物量碳测定方法
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃
凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定
土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至
土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展(精)
土壤微生物生物量碳及其影响因子研究进展3 黄辉(1陈光水(1谢锦升(1黄朝法(2 (1.福建师范大学福州350007;2.福建省林业调查规划院福州350003 摘要:笔者较为全面地综述了国内外土壤微生物生物量碳的研究成果。笔者针对土壤微生物生物量碳主要受到碳氮限制、树种类型、土地利用方式、管理措施、土壤湿度和温度、土壤质地等因素的影响,提出了今后的研究应集中在以下几个方面:(1加强不同尺度土壤微生物生物量碳的影响因子及调控机理研究;(2进一步加强不同土壤类型下土壤微生物生物量碳动态及调控机理研究;(3对影响土壤微生物生物量碳高低不确定性的因子进行深入研究;(4加强其他因子对土壤微生物生物量碳影响的研究;(5探讨全球气候变化对土壤微生物生物量碳的影响。 关键词:微生物生物量碳;土壤;影响因子;全球变化 Adva nces on Soil Microbial Biomass Ca rbon a nd Its Effect Factor Huang Hui(1Che n Gua ngshui(1Xie J ingsheng(1Huang Chaof a(1 (1.Fujia n N or mal U niversity Fuzhou350007;2.Fujian Provincial Forest ry Survey a nd Planning Institute Fuzhou350003 Abstract:The aut hors review current knowledge of t he p roperty and deter mination of soil microbial biomass carbon a nd several f act ors cont rolling its dynamics bot h at home a nd abroad.By now,t here are several f ac2 t ors influe ncing soil microbial biomass carbon w hich include inhere nt p roperties of t he soil like texture,mois2 ture and temp erature a nd etc.Besides t hese,external f act ors(C a nd N limitation,sp ecies typ e,ma nageme nt measures and diff ere nces in la nd usealso cont rol on soil microbial biomass carbon.Despite intensive resear2 ches in recent years,t he uncertainties of soil microbial biomass still re main f or f urt her studies:(1St re ngt he2 ning eff ect f act ors of soil microbial biomass carbon a nd its cont rol mecha nism at diff erent scale;(2Paying
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
土壤微生物生物量的测定(滴定法)(精)
1. 土壤微生物生物量的测定 (滴定法 一、实验目的和内容 土壤微生物生物量是指土壤中体积小于5~10μm 3活的微生物总量, 是土壤有机质中最活跃的和最易变化的部分。耕地表层土壤中,土壤微生物量碳(Bc 一般占土壤有机碳总量的 3%左右,其变化可直接或间接地反映土壤耕作制度和微生物肥力的变化,并可以反映土壤污染的程度。近 30年来,国外许多学者对土壤微生物生物量的测定方法进行了比较系统的研究,但由于土壤微生物的多样性和复杂性,还没有发现一种简单、快速、准确、适应性广的方法。目前广泛应用的方法包括:氯仿熏蒸培养法(FI 、氯仿熏蒸浸提法(FE 、基质诱导呼吸法(SIR 、精氨酸诱导氨化法和三磷酸腺苷(A TP 法。 氯仿熏蒸浸提法(FE 的原理是:土壤经氯仿熏蒸处理,微生物被杀死,细胞破裂后, 细胞内容物释放到土壤中,导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量碳。 二、实验材料和用具 仪器:培养箱;真空干燥器;真空泵;往复式振荡机(速率 200次每 min ; 1L 广口玻璃瓶;定量滤纸;紫外分光光度计; LNK-872型消煮炉(江苏省宜兴市科教仪器研究所试剂: 1. 无乙醇氯仿:市售的氯仿都含有乙醇(作为稳定剂 ,使用前必须除去乙醇。方法为:量取 500ml 氯仿于 1000ml 分液漏斗中,加入 50ml 硫酸溶液[ρ(H2SO 4=5%], 充分摇匀, 弃除下层硫酸溶液, 如此进行 3次。再加入 50ml 去离子水, 同上摇匀, 弃去上部的水分,如此进行 5次。将下层的氯仿转移存放在棕色瓶中,并加入约 20g 无水 K 2CO 3,在冰箱的冷藏室中保存备用。 2. 硫酸钾溶液 [c(K2SO4=0.5mol·L -1]称取硫酸钾(K 2SO 4,化学纯 87.10g ,先溶于
土壤微生物数量测定方法整理
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。
土壤可溶性有机氮,硝态氮,铵态氮和微生物量氮测定
土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法 1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存 2.测定 可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮） 要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方便的。 以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。
土壤可溶性全氮测定 氧化剂:将6g NaOH 和30g K2S2O8溶于蒸馏水中并定容至1 L(K2S2O8 比较难溶，在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，致其温度达到常温后与K2S2O8 溶液混合定容至1L) 测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A220和A275，空白需加入1ml氧化剂并同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。） 标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L 的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加入1ml 氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A220和A275。以A（A= A220-A275）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。 硝态氮测定1 注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可采用硝态氮测定2进行测定
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。 三、操作步骤 （1）土壤系列稀释液制备 取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。 （2）平板制备和培养 从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。 （3）镜检计数
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法 1．主题内容与适用范围 本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。 2．方法提要 土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K 2SO 4 溶液浸提，提取液一部分用K 2 CrO 7 （重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H 2SO 4 消煮、碱化蒸馏法测定微生 物量氮。 3．提取液的制备 3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量： 0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的 冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜 3.2试剂的制备：0.5 M K 2SO 4 溶液（化学纯）、 无醇氯仿（提纯方法：用1N H 2SO 4 溶液与氯仿(CHCl 3 三氯甲烷)按体积比2:1 于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1 混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无 水硫酸钠，保存） 3.3分析步骤： 3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。 另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。 3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。用注射器注入每 瓶50ml 0.5M K 2SO 4 溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸 过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。如不立即测定，用保鲜膜封口（防止污染和挥发），保存在40C的冰箱中。 4．生物量碳的测定—K 2CrO 7 氧化法 4.1仪器、设备：DOC测定仪(冷凝装置4套、配套沸瓶装16个)、玻璃沸珠、1500W电炉两 个、变压器两个、滴定管（25ml） 4.2试剂的制备：蒸馏水、混合酸(浓硫酸:浓磷酸=2:1,分析纯) 、0.1000N K 2CrO 7 标准溶 液 邻菲罗啉指示剂、66.7mM（0.4 N）K 2CrO 7 溶液（19.6125g/L，分析纯） 0.02M (NH 4) 2 Fe(SO 4 ) 2 溶液：取15.69g/L溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%， 分析纯）酸化，而后定容至1L、4.3分析步骤： 4.3.1吸取2ml 0.4 N K 2CrO 7 溶液放入沸瓶，再吸15ml 混酸放入沸瓶，混合，加入等量的 玻璃球（约一小药匙，10个）。吸取步骤（3.2.2）中的过滤液8~10ml（根据含碳量多少而
土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法-全国土壤质量标准化技术委员会
《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》Determination of soil microbial biomass ?Fumigation-extraction method 国家标准（征求意见稿） 编制说明 《土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法》编制组 二0一七年四月
项目名称：土壤微生物生物量的测定-熏蒸提取法 计划编号：20153803-T-326 项目负责单位：中国科学院亚热带农业生态研究所 项目负责人：吴金水 技术委员会：全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC 404）
目录 1、立项背景 (1) 1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 (1) 1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 (1) 2、任务来源 (3) 3、标准制定的原则和依据 (3) 3.1 原则 (3) 3.2确定依据 (4) 4、标准制定的主要技术内容及方法应用评价 (4) 4.1 适用范围 (4) 4.2 总体框架和主要内容 (4) 4.3熏蒸和提取 (5) 4.4 提取物中碳的测定 (6) 4.5 方法的评价 (8) 4.6方法的应用 (9) 5、与现行法律、法规、标准的协调性 (11) 6、对标准贯彻的建议 (11) 7、参考文献 (11)
1、立项背景 1.1 土壤微生物生物量的研究意义重大 土壤微生物生物量（soil microbial biomass）是指体积小于5×103μm3活体微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但在有机物质、氮、磷、硫等转化和循环过程中起着关键的作用，不仅是土壤有机质中最活跃的组分，而且可作为土壤养分的储存库，是植物生长吸收利用养分的重要来源，与单个微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际数量与作用潜力。据估计植物吸收N、P、S 的60%，47%和28%分别来自微生物生物量N、P和S。 微生物是土壤中最为活跃的生命体之一，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分( C, N, P, S 等) 循环转化的驱动力，参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等各个生物化学过程（林先贵，2010）。而且，微生物对土壤各种环境因子的变化极为敏感，因而土壤微生物量的变化常被作为土壤肥力、土壤环境污染等其他各种扰动对土壤健康质量影响的灵敏性指标。因此，土壤微生物生物量的研究为从整体上了解土壤微生物的演变与功能提供了一个有效的途径，其对于更好地把握与理解土壤健康的主要影响因素有极其重要的作用，对制定良好措施来提高土壤质量也有重要意义。 1.2 土壤质量标准化与土壤科研工作的需要 土壤微生物生物量是植物有效养分的储备库和来源，其对土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陆地生态系统中的循环具有重要的影响。土壤微生物生物量库的长期或是季节性变化，不仅可指示土壤质量的变化，而且对于了解土壤养分的动态变化也具有重要的作用，同时也可快速地监控并反映土壤管理的改变和污染的影响。土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物对土壤有机质与养分循环和转化作用的重要方法。 土壤微生物生物量的测定方法有很多，既有传统方法，也有现代方法。20
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪 一、方法原理 土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。 1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。 2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。 直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。 二、主要仪器 振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。 二、试剂 1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。 2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57g分析纯K2SO4定溶至1L。 四、操作步骤 称取过2mm筛的新鲜土样12.5g六份，置于小烧杯中。将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。 将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30min，过滤。未熏蒸土样操作相同，同时做空白。 五、结果计算 土壤微生物量碳 =（熏蒸土壤有机碳-未熏蒸土壤有机碳）/0.45 式中：0.45——将熏蒸提取法提取液的有机碳增量换算成土壤微生物生物量碳所采用的转换系数（kEc)。 一般量容法采用的kEc值为0.38，仪器分析法kEc 取值0.45。 六、注意事项 1．氯仿致癌，操作时应在通风厨中进行。 2．打开真空干燥器时，要听声音，如没空气进去的声音，试验需重做。 3．应注意试剂的厂家，有些厂家的K2SO4试剂不宜浸提土壤微生物量碳。 4．浸提液应立即用TOC-V CPH有机碳分析仪测定或在-18℃下保存。 1.23.2土壤微生物量氮的测定 一、方法原理 土壤微生物态氮是土样在CHCl3熏蒸后直接浸提氮含量，并进行测定，以熏蒸和不熏蒸
土壤微生物量研究综述
土壤微生物及微生物量研究综述 陈建国20092133 水保09级 一、研究背景 土壤微生物是生态系统的重要组成部分[1]。土壤微生物一方面对土壤有机物质起分解作用，使有机物质转化成有效养分，另一方面，对土壤中的无机营养元素起固持和保蓄作用[1-4]。土壤微生物在土壤养分转化与循环、维护生态平衡和保护环境等方面具有非常重要的意义。 土壤微生物与植物在根际微环境中进行着复杂频繁的互作。土壤有益微生物通过其代谢活动提高土壤中植物营养元素的有效性，改变了植物根系生理状态，最终促进了植物的定植、生长和发育；植物通过其根际分泌物影响着土壤微生物的群落结构和代谢活性。土壤微生物与植物相互作用不是完全独立的，还受到土壤、温度、水分等多种环境因素影响，进一步研究植物、土壤微生物与环境关系，特别是研究植物一土壤一微生物所构成的系统可为今后进行绿色农业、林业保护和环境保护等提供更有价值的信息[17]。 森林土壤微生物是森林生态系统的重要组成部分之一，在林地枯枝落叶分解、腐殖质合成、土壤养分循环和能量转化中起着重要作用，其数量不仅直接影响土壤的生物化学过程和土壤养分的组成与转化，也是土壤中生物活性的具体体现，是维持和恢复林地生产力的主要因素。森林土壤微生物的种群、数量直接影响土壤理化性质、土壤肥力和森林的生长发育；其分布及活动是森林生产环境综合评价的主要依据之一；也是反映土壤质量、人类干扰以及土地利用变化最为敏感的指标之一。开展森林土壤微生物的研究有助于了解森林生态环境下植被的演替动态，进而揭示天然林土壤生态系统的退化机理和过程，为退化林地土壤生态系统的恢复和重建对策，森林生态安全保障系统的构建提供科学依据。目前，森林土壤微生物的动态变化多见报道，但对其变化规律和调控机理仍缺乏系统全面的认识[25]。 20世纪70年代以来，国内外对此进行了广泛深入的研究，尤其在林地土壤上的研究更加深入细致。近10年来，人们开展了土壤微生物量与环境生态及养分循环等方面的研究，取得了重要进展，如不同生态环境下土壤微生物量的变化，人类活动对土壤微生物量的影响关系等微生物量的空间分布规律明显，如水平分布与植物根系的分布有密切的关系，大量的微生物都集中在根系周围；土壤中微生物分布还具有明显的垂直地带性。微生物量的时间分布及其影响因子分析表明，土壤微生物量的季节变化规律与生境的变化有关，但其变化量的