神经干细胞的培养鉴定及分化

朱琼，女，1990年生，重庆市人，汉族，2009年第三军医大学毕业，在读硕士，主要从事神经干细胞治疗阿尔茨海默病的作用及机制研究。

通讯作者：徐亚丽，博士，副主任医师，副教授，解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037

Zhu Qiong, Studying for master’s degree,

Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

Corresponding author: Xu Ya-li, ., Associate chief physician, Department of Ultrasound, Second

Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

神经干细胞的培养鉴定及分化

朱 琼1

，皋月娟2

，高顺记1

，陈 重1

，刘 政1

，徐亚丽1(1

解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2

解放军第三○二医院超声科，北京市 100039)

引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，

21(17):2708-2713.

DOI: ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼) 文章快速阅读：

不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。

细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。

摘要

背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是

后续研究的基础。

目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。 方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin 的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP 、βⅢ-tubulin 和MBP 的表达。

结果与结论：①体外培养得到悬浮生长的神经球，生长曲线和细胞周期表明细胞增殖力强；②透射电镜观察到神经干细胞核浆比高，呈未分化状态；③Nestin 免疫荧光阳性；④不同体积分数的血清诱导后均可分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，体积分数为1%血清能诱导分化得到更多的神经元细胞；⑤结果表明，采用悬浮神经球培养法成功分离培养得到了神经干细胞，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化。 关键词：

干细胞；分化；神经干细胞；培养；鉴定；血清；诱导分化；国家自然科学基金 主题词：

神经干细胞；细胞, 培养的；血清；细胞分化；组织工程 基金资助：

Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells

Zhu Qiong 1, Hao Yue-juan 2, Gao Shun-ji 1, Chen Zhong 1, Liu Zheng 1, Xu Ya-li 1 (1Department of Ultrasound, Second

Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 2

Department of Ultrasound,

the 302nd

Hospital of PLA, Beijing 100039, China)

Abstract

BACKGROUND: Neural stem cell transplantation is an emerging therapeutic option in the recovery of neural lesions and neurodegenerative diseases. Neural stem cell culture and differentiation lay a foundation for the further study.

OBJECTIVE: To improve the techniques for the isolation, cultivation, differentiation and identification of neural

stem cells, and to explore the biological characteristics of cells.

METHODS: The neural stem cells from C57BL/6 fetal rats were isolated and cultured in vitro using neurophere culture method followed by morphological and ultrastucture examination. The growth curve and cell cycle of passage 3 cells were drawn and analyzed. Nestin expression was tested by immunofluorescence. Neural stem cells induced in 1% and 10% fetal bovine serum were identified using anti-GFAP, anti-βIII -tubulin and anti-MBP by immunofluorescence.

RESULTS AND CONCLUSION: The neurospheres exhibited strong cell proliferation ability. Under transmission electron microscope, there was a high nuclear/cytoplasmic ratio in the neural stem cells, indicating a low differentiation degree. Immunofluorescence analysis revealed that neural stem cells were positive for Nestin.

The induced cells were positive for GFAP, βIII-tubulin, and MBP, indicating these cells were induced to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes, and there were more neurons in 1% fetal bovine serum than those in 10% fetal bovine serum. In conclusion, we could successfully isolate neural stem cells in C57BL/6 mice, and low concentration of fetal bovine serum contributes to more neurons differentiated from neural stem cells.

Subject headings: Neural Stem Cells; Cells, Cultured; Serum; Cell Differentiation; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China

Cite this article: Zhu Q, Hao YJ, Gao SJ, Chen Z, Liu Z, Xu YL.Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(17):2708-2713.

0 引言 Introduction

神经干细胞是神经系统内具有自我复制更新和多向分化潜能的细胞[1-2]。许多神经系统疾病都与神经干细胞数量及功能紊乱有关[3]，因此神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景[4-6]，如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默症、脑卒中等[7-9]。神经干细胞散在分布于成年哺乳动物的大脑内，主要是海马齿状回颗粒下层和侧脑室的室管膜下区[10]，且具有自我更新能力，能分化为胶质细胞和神经元[11-12]，同时体内的神经干细胞具有向损伤区迁移的能力，但迁移数量和再生能力有限[13-14]，所以神经干细胞的体外扩增培养、移植及定向分化是目前研究的热点。研究表明，将人源性的神经干细胞移植到大鼠体内，能有效改善认知功能，为神经退行性疾病提供了新的治疗方法[15]。实验采用悬浮神经球培养法分离培养孕12-14 d C57BL/6胎鼠大脑半球神经干细胞，观察神经干细胞的形态及生物学特征，并采用不同浓度血清诱导神经干细胞分化，为应用细胞移植治疗神经系统疾病提供理论依据。

1 材料和方法 Materials and methods

设计细胞观察性实验。

时间及地点于2015年6至12月在第三军医大学第二附属医院中心实验室完成。

材料

1.3.1 实验动物孕12-14 d C57BL/6小鼠，体质量25- 35 g，由第三军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(渝)2005-0007。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.3.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12、B27、Accutase、胎牛血清(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；Anti-Nestin、Anti-Myelin Basic Protein(Millipore公司)；Anti-GFAP(Santa公司)；Anti-βⅢ-tubulin(Abcam公司)；二抗(中杉金桥)；流式细胞周期试剂盒(碧云天)。解剖显微镜、激光共聚焦显微镜(德国Leica公司)；透射电子显微镜(荷兰Philips公司)；酶标仪(澳大利亚Tecan公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickison公司)；

实验方法

1.4.1 原代神经干细胞的分离、培养取孕12-14 d的C57BL/6小鼠，解剖取出胚胎，断颈取头部，于解剖显微镜下依次剥离头皮、颅骨、脑膜和血管(图1)，分离得到两侧大脑半球。将得到的大脑半球用眼科剪剪碎成1 mm3的碎块，收集于离心管中，D-Hank’s液清洗2次。以上步骤均在冰上操作。然后加入%的trypsin-EDTA和DNAase 100 μL于37 ℃下消化10 min，加入胎牛血清终止消化，并用吸管反复轻柔吹打20次得到混悬液。取混悬液，用70 μm的细胞滤器过滤，得到单细胞悬液，1 000 r/min离心2次，每次5 min，加入神经干细胞培养基(95%DMEM/F12，2%B27，20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，1%双抗)重悬，以1×109 L-1的细胞浓度接种于50 mL透气培养瓶中，体积分数为75%乙醇消毒瓶口后置于体积分数为5%CO2，37 ℃的细胞培养箱中，次日首次换液，之后每2 d 半量换液1次，培养期间观察细胞生长情况。离心时采用差速离心法，即将细胞悬浮液收集于离心管中，根据神经球的大小，选用不同的离心时间，神经球越大，离心时间越短，前2 d换液是采用1 000 r/min离心 60 s，之后采用1 000 r/min离心30 s，使神经球沉淀，从而分离开单个悬浮细胞或死细胞。

1.4.2 神经干细胞的传代培养每天观察神经干细胞生长情况，待克隆球较大，球心折光度变暗时，收集到离心管中，1 000 r/min离心30 s，去上清，然后加入Accutase 于37 ℃下消化15 min，轻柔吹打20次，采用差速离心法，先进行1 000 r/min离心30 s，使消化不充分的神经球沉淀，再取上清进行1 000 r/min离心5 min，沉淀可根据情况再次消化。然后加入神经干细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×109L-1，接种于培养瓶中继续培养，隔日半量换液1次，5 d传代1次。

1.4.3 CCK-8法绘制神经干细胞的生长曲线将第3代培养第4天的神经干细胞消化成单细胞悬液，按照2×103/孔的密度，接种于用0.1 g/L多聚赖氨酸包被过的96孔板中，每孔100 μL，连续检测7 d，每天5个复孔，1个空白对照孔，于体积分数为5%CO2、37 ℃的孵箱培养。分别于第1，2，3，4，5，6，7天，在各孔中加入10 μL CCK-8试剂，然后放回孵箱继续培养2 h，用酶标仪检测各孔的吸光度值，激发波长为450 nm。取5个复孔的平均吸光度值减去空白对照孔的吸光度值，得到对应时间点的吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制神经干细胞的生长曲线。

1.4.4 流式细胞仪检测神经干细胞的细胞周期取第3代培养第4天的神经干细胞，消化成单细胞悬液，用PBS洗2次，加入体积分数为70%乙醇固定，4 ℃过夜，PBS洗涤2次，

加入100 μL RNase消化，然后加入PI 染料 mL ，于4 ℃条件下孵育30 min ，流式细胞仪检测细胞周期，根据公式计算增殖指数(PI)=[(S+G 2/M)/(G 0/G 1+S+ G 2/M)]x100%。

1.4.5 透射电镜观察神经干细胞的超微结构 取第3代培养第4天的神经干细胞，PBS 清洗2次后收集于 mL EP 管中，缓慢加入电镜级戊二醛固定细胞2 h ，再用生理盐水冲洗3次，每次10 min ，然后用1%锇酸后固定，乙醇和丙酮梯度脱水，送电镜室制片并于透射电镜下观察。

1.4.6 免疫荧光检测神经干细胞标志蛋白Nestin 的表达 取第3代培养第4天的克隆球或消化后的单细胞以适当的密度接种于用0.1 g/L 多聚赖氨酸包被过的共聚焦皿中，继续培养24 h ；37 ℃预热的PBS 轻轻漂洗细胞2次；40 g/L 多聚甲醛室温下固定细胞10 min ，PBS 洗3次，每次5 min ；%TritonX-100处理细胞10 min ，PBS 洗3次，每次5 min ；体积分数为10%山羊血清封闭15 min ；弃封闭液，加入200 μL按1︰200稀释的anti-Nestin ，4 ℃孵育过夜；弃一抗，PBS 洗涤3次，每次5 min ，用滤纸吸干多余的液体，加入200 μL按1︰200稀释的FITC-山羊抗小鼠IgG ，37 ℃温育45 min ，PBS 洗涤3次，每次5 min ，操作过程注意避光；DAPI 染色3 min ，PBS 洗3次，每次5 min ；封固后激光共聚焦显微镜观察。

1.4.7 神经干细胞的诱导分化及鉴定 将第3代培养第4天的神经干细胞消化成单细胞悬液，按2×106

L -1

的细胞浓度接种于多聚赖氨酸包被后的共聚焦培养皿中，分别用含体积分数为1%和10%胎牛血清的培养基培养7 d ，然后进行GFAP 、βⅢ-tubulin 和MBP 免疫荧光染色，抗体浓度均为1︰200稀释，操作步骤同上，于激光共聚焦显微镜下观察。

主要观察指标 神经干细胞的形态、生物学特征及分化能力。

2 结果 Results

神经干细胞的形态 在解剖显微镜下剥离脑膜及血管，得到大脑半球。采用机械分离和酶消化法得到大量单细胞。原代培养第1天光镜下见部分细胞贴壁，部分细胞悬浮呈单细胞，折光性好，第2天悬浮细胞部分聚集呈细胞团，大小不均，较大者约有十几个细胞，克隆球直径逐渐增大，呈桑葚状，随着直径的增大，部分克隆球中心变暗。将克隆球消化传代后，克隆球大小更加均匀，形态更加规整，未见明显突起，折光性好(图2)。

神经干细胞的增殖能力 由细胞生长曲线(图3)可见，前2 d 细胞生长缓慢，之后细胞增殖较快，进入对数生长期，从第6天开始，细胞增殖缓慢，进入平台期。细胞周期结果显示(图4)，%的神经干细胞处于G 0+G 1期，G 2期占%，S 期占%，G 2/G 1=。根据增殖公式计算得增殖指数为%，说明绝大部分细胞处于增殖状态。

神经干细胞的超微结构较小，胞核大且明显，核内染色质丰富，以常染色质为主，核仁较大，胞浆少，核浆比大，胞浆中含有大量的核糖体和线粒体，其余细胞器很少，表明该细胞分化程度低。大量的核糖体和线粒体表明细胞合成代谢能力旺盛，生命活动力强。细胞间可见细胞连接(图5)。

神经干细胞标志蛋白Nestin 的表达 免疫荧光结果显示(图6)，无论是接种的克隆球，还是单个细胞，细胞核均较小，被DAPI 染成蓝色，胞浆呈绿色，说明Nestin 呈阳性表达。克隆球向外呈放射状，越靠近中心，细胞密度越大，细胞越紧密，不易被染色，故中心未见染色细胞。

神经干细胞的诱导分化 免疫荧光结果显示，大多数细胞GFAP 反应阳性，胞浆丰富呈绿色，有多个短突起，贴壁牢固，说明大部分神经干细胞分化为星形胶质细胞(图7A )；少量细胞MBP 反应阳性，呈绿色，说明少数神经干细胞分化为少突胶质细胞(图7B )；部分细胞βtubulin Ⅲ反应阳性，呈红色，突起较少但较长，说明部分神经干细胞分化为神经元(图7C ，D )。其中，含体积分数为1%胎牛血清的培养基能诱导分化生成更多的神经元(图7D )，而含体积分数为10%胎牛血清的培养基能诱导分化生成更多的星形胶质细胞，说明低体积分数的血清有助于神经干细胞向神经元细胞分化，而高体积分数血清促使神经干细胞向胶质细胞分化。该分化结果进一步证实了分离培养得到的细胞为神经干细胞，且该细胞具有多向分化能力。

3 讨论 Discussion

原代取材培养神经干细胞，能较好的保持细胞本身的生物学特性。有研究表明，神经干细胞在胚胎第12天时开始出现，15 d 时达到高峰

[16]

，故实验用孕12-14 d 的C57BL/6

胎鼠，采用机械消化法和酶消化法分离得到神经干细胞，通过细胞的形态结构及标志性蛋白(Nestin [17]

、GFAP

[18]

、β

Ⅲ-tubulin

[19]

、MBP

[20]

)检测，证实成功分离得到神经干细

胞，为后续神经干细胞移植治疗奠定了良好的实验基础。由于神经干细胞呈悬浮生长，而胎鼠大脑半球的其他细胞呈贴壁生长，且表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子能够使培养的神经干细胞得到纯化

[21]

，故实验中直接取大

脑半球进行消化，通过后续的换液及表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的作用，筛选得到神经干细胞，该方法较单独分离海马区操作更简单。

神经干细胞的增殖、分化、迁移与所处的微环境密切相关，如细胞因子

[22-25]

、理化因素等

[26-28]

。有研究发现，

无血清培养条件下，神经元比例较高，而血清体积分数越高，胶质细胞的数量越多

[29]

。Hung 等

[30]

研究发现，神经球

在无血清培养基中，主要分化为纤维型星形胶质细胞，而在含体积分数为10%胎牛血清的培养基中，主要分化为原浆型细胞。实验分别用体积分数为1%和10%的血清诱导分化，均得到星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，但体积分

吸光度值

数为1%的血清能诱导神经干细胞分化产生更多的神经元细胞，而体积分数为10%的血清诱导神经元细胞数量相对较少，说明血清体积分数与神经干细胞的分化方向有关，低体积分数血清有利于向神经元分化，与报道相符。既往研究主要集中在神经干细胞移植后如何有效分化为神经元，重建神经环路，以改善神经功能[31-32]。随着对星形胶质细胞的深入认识，发现星形胶质细胞在神经轴突和突触可塑性方面发挥着重要作用[33-35]。高体积分数血清能够促进神经干细胞向星形胶质细胞分化，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化，因此能否通过调整血清体积分数以控制分化方向及比例，为神经干细胞移植治疗提供了新的思路。但血清成分比较复杂，具体是哪一种物质或某几种物质共同改变了神经干细胞的分化方向，尚无定论。

实验采用多聚赖氨酸包被培养板，使神经干细胞贴壁生长，以利于后续实验操作。有研究表明，多聚赖氨酸会促进神经干细胞分化，尤其是多聚赖氨酸的分子质量对神经干细胞的分化影响较大[36-37]。从Nestin免疫荧光结果可见，贴壁神经球周围细胞向四周爬行伸长，有“逃离”克隆球的趋势，单个细胞交织成网，出现这种现象的原因可能与多聚赖氨酸使神经干细胞贴壁生长导致分化有关。为避免多聚赖氨酸对神经干细胞分化产生影响，能否选用其他方式使神经干细胞贴壁，是后续实验中应该关注的问题。

实验还检测了神经干细胞的细胞周期、生长曲线和超微结构。从细胞周期和生长曲线来看，提取得到的神经干细胞生长旺盛，增殖能力强。从超微结构来看，细胞表现出幼稚细胞的特性，细胞间有细胞连接，为发育中的细胞间信息的传递提供了通道。

综上所述，实验建立了从C57BL/6孕鼠大脑半球分离培养神经干细胞的方法，并进行鉴定。但由于目前对神经干细胞分化的认识尚不全面，神经干细胞移植后能否维持干性，能否实现有效的定向分化，能否建立细胞间连接，改善神经系统症状等问题，仍是目前研究的热点和难点。

作者贡献：实验设计为朱琼、徐亚丽，实验实施为朱琼、皋月娟、高顺记、陈重，实验评估为所有作者。朱琼、皋月娟成文，刘政审校。

利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3

次查重。

文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发

稿宗旨。

作者声明：第一作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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图2 神经干细胞的形态

Figure 2 Morphology of neural stem cells

图注：图中A为原代神经干细胞培养第3天

(×200)；B为第1代神经干细胞培养第3天

(×200)；C为第2代神经干细胞培养第5天

(×400)。

图1 解剖显微镜下分离大脑半球过程

Figure 1 The process of isolating cerebral hemispheres under anatomic microscope

图注：图中A为剥离颅骨，暴露脑组织；B为剥离硬脑膜和蛛网膜；C为剥离脑膜后底面观；D为分离得到两侧大脑半球。

图4 第3代神经干细胞的细胞周期

Figure 4 Cell cycle of neural stem cells in passage 3图注：G0+G1期占%，G2期占%，S期占%，G2/G1=，增殖指数为%。图5 透射电镜观察神经干细胞超微结构(A：×12000，B：×20000) Figure 5 Ultrastructure of neural stem cells under transmission electron microscope (A: ×12000, B: ×20 000)

图注：神经干细胞核较大，染色质丰富，胞浆中含有大量的核糖体和线粒体。图A方框内为细胞间连接，图B箭头所指为线粒体。

BA

图6 免疫荧光检测神经干细胞标志蛋白Nestin

的表达(×800)

Figure 6 Immunofluorescence detection of

Nestin (×800)

图注：图中A，B为贴壁神经球免疫荧光染色；C

为单个神经干细胞贴壁后免疫荧光染色。蓝色为

细胞核(DAPI阳性)，绿色为胞浆(Nestin阳性)。

图7 免疫荧光检测神经干细胞分化能力

Figure 7 Immunofluorescence detection of neural stem cells differentiation

图注：图中A，B，C为体积分数为10%胎牛血清诱导分化(A：×800，B，C：×1600)，图A中绿色荧光为GFAP(+)，图B中绿色荧光为MBP(+)，图C中红色荧光为βtubulin Ⅲ(+)；D为体积分数为1%胎牛血清诱导分化(×800)，红色为βtubulin Ⅲ(+)。

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