限制性核酸内切酶的命名和类型

限制性核酸内切酶的命名和类型

第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节DNA 连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。

基本概念及其生物功能特异水解断裂RNA分子核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶底物或者为DNA或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷酸叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段叫内切核酸酶按水解断裂核酸分子的方式:根据作用的核酸底物不同:*

基因工程的操作是在分子水平上的操作是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割拼接和扩增等操作。

所以把这些酶称之为“工具酶”。

工具酶、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(bp)并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

限制性核酸内切酶概念性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸

分子链的内部制造切口的酶。

形成’P和’OH末端自我保护作用功能细菌的限制和修饰系统（RM体系）来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制大肠杆菌B大肠杆菌Kphageλ(B)EOP=（限制作用）EOP=（限制作用）EOP=（修饰作用）修饰的phageλ(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。

即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（RM体系）。

细菌的RM体系类似于免疫系统能辨别自身的DNA与外来的DNA并能使后者降解掉。

寄主的限制与修饰现象EOP成斑率efficiencyofplatingEOP=限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解切成小片断。

（）限制（Restriction）限制作用:实际就是限制性内切酶降解外源DNA维护宿主遗传稳定的保护机制。

细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护不能被自身的限制性内切酶识别切割。

（）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C 位置上引入甲基修饰作用:宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

（）限制与修饰系统相关的三个基因①hsdR:编码限制性内切酶②hsdM:编码限制性甲基化酶③hsdS:编码限制性内切酶和甲基化酶的

协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化即起修饰DNA的作用。

作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。

入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株B株中）宿主细胞甲基化酶将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点（修饰）大肠杆菌宿主细胞K株B株有各自的限制和修饰系统。

限制和修饰作用的分子机制外来DNA入侵时遭到宿主限制性内切酶的特异降解（限制）由于降解不完全外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰虽然是外来却不被降解。

．接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记丧失在原宿主细胞中的存活能力。

基因工程中应采用缺少限制作用的菌株作为受体。

、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶年HOSmith和DNathans提议的命名系统命名原则如下：限制性内切酶的命名用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成个字母的略语表示寄主菌的物种名组成酶的基本名称。

大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示如果酶存在于一种特殊的菌株

中则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。

如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。

如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶所有的限制酶除以上名称外还要冠以系统名称。

限制性内切酶的系统命名为R甲基化酶为M。

如RHindⅢ表示限制性内切酶MHindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中R常被省略。

EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry株系编号若种名头个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。

目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。

据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型

据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。

基因工程中使用注：SAM为S－腺苷甲硫氨酸主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点双功能（具甲基化）异源三聚体ATPMgSAM距识别序列kb处随机性切割单一功能同源二聚体Mgbp回文序列识别序列内或附近特异切割双功能（具甲

基化）异源二聚体ATPMg距识别序列下游bp处随机性切割首先由MMeselson和RYuan在年从大肠杆菌B株和K株分离的。

（）识别位点序列EcoB：TGA(N)TGCTEcoK：AAC(N)GTGCⅠ型限制性内切酶的基本特性如EcoB和EcoK。

未甲基化修饰的特异序列。

N：表示任何一种核苷酸需ATP、Mg和SAM（S腺苷甲硫氨酸）（）辅助因子在距离特异性识别位点约bp处随机切开一条单链不产生特异片断应用不大Recognizesitecutkb（）切割位点首先由HOSmith和KWWilcox在年从流感嗜血菌中分离出来。

分离的第一个酶是HindⅡ未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）与DNA的来源无关。

A’B’N’BAABNB’A’或Ⅱ型限制性内切酶的基本特性（）识别位点序列识别位点处。

切开双链DNA。

形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。

如：（）切割位点EcoRI’G AATTC’’CTTAA G’PstI’CTGCA G’’G ACGTC’产生粘性末端EcoRV’GAT ATC’’CTA TAG’产生平齐末端AAGCTTTTCGAAABCDDNADNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用在完全肯定的位点切割DNA(识别位点下游bp)但不是对称的回文顺序且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。

反应需要ATP、Mg和SAM（S腺苷蛋氨酸）。

EcoP:AGACCEcoP:CAGCAG在基因工程操作中用途不大。

Ⅲ型限制性内切酶的基本特性IV型限制性内切酶新鉴定出来的一类限制酶。

只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖－羟甲基化的DNA序列。

除EcoKMcrBC外识别序列尚未确定目前尚无应用。

*核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性I型内切酶II型内切酶III型内切酶内切酶的蛋白结构种不同的亚基单一成分种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg和SAMMgATP、Mg和SAM 寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)TGCTEcoK：AAC(N)GTGC 回文序列旋转对称（IIs型除外）EcoP:AGACCEcoP:CAGCAG*切割位点在距离识别位点至少bp外随机切开一条单链。

位于寄主特异性位点或其附近识别位点‘端bp处甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是不是基因工程中的用途无用十分有用用处不大*、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶识别序列识别顺序的碱基数一般为bp少数识别更长多数识别位点具有旋转对称性（回文结构）少数的识别位点在切割位点之外具旋转对称性。

bp

HpaⅠC CGG

HaeⅢGG CC

bp

AvaⅡ

G GWCC

EcoRⅡCCWGG

bp

BamHⅠ

G GATTC

SmaⅠ

CCC GGG

bp

BgⅠGCCNNNN NGGC

bp

BstXⅠCCANNNNN NTGC

、以某一对核苷酸为中轴左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。

、这两股DNA链若按同方向阅读（如’’）其核苷酸顺序相同。

′···GAATTC···′′···CTTAAG···′特点有二：回文序列：反向重复序列双链DNA中含有两个结构相同方向相反的序列′···GTNAC···′′···CANTG···′

Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA水解磷酸二酯键中’位酯键产生两个末端末端结构是’P和’OH产生种不同的切口。

切割方式与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端(cohesiveends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。

平末端(Bluntend):因酶切位点在两条DNA单链上相同酶切后形成的平齐的末端结构这种末端不易重新连接起来。

’突出的末端’突出的末端i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。

这比连接两个平齐末端容易得多。

粘性末端的意义①连接便利ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。

粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。

③补平成平齐末端B’末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT）即同聚物加尾造成人工粘性末端。

A’末端可用DNA多核苷酸激酶进行P标记。

②末端标记平头末端平齐末端的特点连接困难连接效率低只有粘性末端连接效率的这种连接常出现多联体连接。

粘性末端与平齐末端连接的处理方法ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。

ⅱ）削除(平)法利用S和Bal等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去使其成为平齐末端不同来源的酶识别相同的序列切割方式相同或不同。

识别位点和切点完全相同如HindⅢ和HsuIHindⅢ’A AGCTT’’TTCGA A’HsuI’A AGCTT’’TTCGA A’同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：识别位点相同但切点不同。

如XmaI和SmaI。

②不完全同裂酶：XmaI’C CCGGG’’GGGCC C’SmaI’CCC GGG’’GGG CCC’识别的序列不同但能切出相同的粘性末端。

如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等’G GATCC’’CCTAG G’BamHIBclI’T GATCA’’ACTAG T’’A GATCT’’TCTAG A’BglⅡ’U GATCY’’YCTAG U’XhoⅡU代表嘌呤Y代表嘧啶。

同尾酶(Isocaudamers）’GATC’’CTAG’SauA同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。

’G’CCTAGGATCT’A’BamHIBglⅡ’GGATCT’’CCTAGA’BamHIBglⅡSauA、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶标准酶解体系的建立一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中在μl的反应体系中h完全酶解μgDNA所需要的酶量。

推荐：稍过量的酶（倍）和较长的反应时间Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件酶解过程配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定①酶解体系一般μl保证酶液体积不超过反应总体积的前提下尽量降低反应

总体积。

加样顺序一般是：ddHObufferDNA酶大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：②混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA）应避免强烈振荡。

混匀后微量高速离心机进行短暂离心使管壁液体全部下沉。

③反应终止三种方法：ⅰ）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度mmolL加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度(WV)ⅱ）℃加热min或者℃加热minⅲ）酚氯仿抽提④酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。

局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。

通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。

酶切后发现除了目的DNA条带外还有其它条带造成非特异性切割不正确的操作导致其它内切酶污染底物DNA中可能存在其它DNA污染。

电泳后电泳条带扩散电泳条带移动距离异常底物DNA不纯内切酶不纯酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。

DNA的纯度一般采取①纯化DNA②加大酶的用量（~U酶gDNA）③延长保温时间（~h）④扩大反应体积使潜在的抑制因素被

稀释（l）⑤加入亚精胺提高消化作用需要适当的温度影响限制性内切酶活性的因素*DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：dam甲基化酶（修饰GATC中的A）dcm甲基化酶（修饰CCATGG的C）。

基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。

*不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。

大多数是℃少数例外。

温度酶最适温度℃酶最适温度℃酶最适温度℃ApaIBclIMaeIITaqIApyIBstEIIMaeIIIBanIMaeISmaI*酶切超螺旋DNA 分子所需酶量多于线性DNA分子最高可达倍DNA分子的构型对同一DNA分子上不同位置的识别序列切割效率具有位点偏爱性识别序列的侧面序列影响酶切效率。

“保护碱基”*是影响限制酶活性的重要因素。

缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成：XbufferMgCl、NaClKCl：提供Mg和离子强度TrisHCl：维持pH二硫苏糖醇（DTT）：防止酶的氧化保持酶稳定性牛血清白蛋白BSA等：提高溶液中蛋白质的浓度防止酶失活商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。

*

高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性即所谓的“星活性”（staractivity）现象。

EcoRI*代表EcoRI的星号活力。

星活性的特点:限制酶识别序列特异性降低

商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。

*需两种酶切同一分子酶对盐浓度相同可同时反应。

需两种酶切同一分子酶对盐浓度要求差别不大中高盐可同时反应。

利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。

两种酶切同一分子酶对盐浓度要求差别大低高盐不可同时反应。

a)低盐组先切加热灭活后补加盐浓度再切。

b)沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液c）两种酶不能同时反应有先有后。

EcoRI和BamHI等都有*活性。

EcoRI*在低盐、高pH（）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！*概括起来诱发星活性的因素有如下几种：（）高甘油含量（％,v／v）（）限制性内切核酸酶用量过高（U／ugDNA）（）低离子浓度（mmol／L）（）高pH（以上）（）含有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）乙醇等（）有非Mg的二价阳离子存在（如MnCuCoZn等）。

但在实际应用中一般要用稍过量的酶（μg加~U酶）反应较长的时间才能达到完全酶解。

但是不能过分加大酶的用量酶过量对酶切反应的影响：）酶过量（一般为?UμgDNA）会影响识别序列的正确性如：BamHI的正常识别序列:GGATTC酶过量识别序列NGATCN）酶制剂含甘油成分酶过

量会因为甘油量大而影响其识别的专一性诱发星号活力。

酶对消化效率的影响U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下h完全水解μgDNA所需的酶量*R表示AGY表示CTM表示ACK表示GTS表示CGW表示ATH表示ACTB表示CGTV表示ACGD表示AGTN表示ACGT。

、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶限制性内切酶对DNA的消化内切酶与识别序列的结合模式年JAMcClarin等通过X射线晶体衍射发现II型限制性内切酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。

GAATTCCTTAAG*双酶切消化两种不同的限制酶切割同一种DNA分子构建载体。

对盐浓度要求不同的酶可采取下列方法：使用两种酶均适用的缓冲液同时酶解低盐酶先切然后补加盐高盐酶再切一种酶先切然后更换缓冲液另一种酶再切对盐浓度要求相同的酶原则上可以同时酶切。

低温酶先切然后升温加入高温酶再切*双酶切反应体系内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开完全消化DNA分子的GC含量为而且种碱基的分布是随机的。

最终片段大小是nbp只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。

局部消化限制性核酸内切酶的应用：

重组DNA前的切割构建新质粒构建物理图谱DNA分子杂交用限制性内切酶消化受体DNA制备DNA探针亚克隆以用作序列分析基因定位DNA同源性研究本节重点掌握的内容

、限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。

、II型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星活性的原因、影响酶活性的因素。

第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶**********需两种酶切同一分子酶对盐浓度相同可同时反应。

需两种酶切同一分子酶对盐浓度要求差别不大中高盐可同时反应。

利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。

两种酶切同一分子酶对盐浓度要求差别大低高盐不可同时反应。

a)低盐组先切加热灭活后补加盐浓度再切。

b)沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液c）两种酶不能同时反应有先有后。

**R表示AGY表示CTM表示ACK表示GTS表示CGW表示ATH 表示ACTB表示CGTV表示ACGD表示AGTN表示ACGT。

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