基因治疗血友病指南
血友病的基因治疗概述
血友病分为遗传性血友病和获得性血友病。前者是一组先天性单基因遗传性凝血因子Ⅷ(FⅧ)、IX(FIX)或者Ⅺ(FⅪ)缺乏而导致的凝血功能障碍的出血性疾病，而后者一般同时缺乏2种或者多种凝血因子，常继发于肝炎、肝硬化、肝癌转移等肝脏疾病，某些血液病(如急慢性白血病)、淋巴瘤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和尿毒症等。我们主要就就遗传性血友病(简称血友病)的基因治疗作一综述。
1血友病的机理及传统治疗方法
血友病特点为早年发病，轻微外伤或小手术后的持续反复甚至自发出血，多有家族史并多发于男性。根据凝血因子所缺乏的种类可以分为血友病A(FⅧ缺乏)、血友病B(FIX缺乏)和血友病C(FⅪ缺乏)，血友病A约占血友病的85％，血友病C在临床上比较罕见，血友病A、B均为X染色体隐性遗传，而血友病C则为常染色体不完全隐性遗传。血友病的基础研究(包括血友病相关凝血因子的SNP、STS、STR等多态性位点)已经比较成熟，其基因突变有着高度的异质性，包括基因缺失、异常基因片段的插入、基因片段的重排和点突变等。对于小片段的缺失、插入和点突变来说，血友病的严重程度取决于该突变所在结构域的功能，但也有极少数血友病患者编码区及其旁侧序列并未发生突变。在FⅧ等凝血因子的转运过程中，许多蛋白质也参与其活性、非活性形式转换的调控，编码这些蛋白质基因的突变也会引起血友病样症状的出现。
随着发病率较高的疾病得到越来越好的诊治，以前被人们认为发病率较低的血友病，因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。目前血友病的传统疗法主要有替代疗法(对症补充血浆制剂和凝血因子浓缩制剂)、重组凝血因子疗法[3]和预防疗法等。替代疗法中患者会产生相应凝血因子的抑制物而抵消
3O％甚至更多的凝血因子活性，且存在传播病毒的危险。针对传统的浓缩或高纯凝血因子所产生的抑制物，临床上有采用猪FⅧ浓缩制剂来解决，因为猪FⅧ与抑制物的亲和力比人FⅧ要高的多；另外，绕过内源性凝血途径利用FⅧ旁路制剂(凝血酶原复合物(PCC)和激活的凝血酶原复合物(APCC))也可以促凝；目前有
1种新的旁路制剂，即重组活化的FⅦ(rⅦa)，由于它的酶促反应局限在细胞表面，所以大大降低了全身凝血活化和血栓并发症等副反应，其高效性和安全性已得到认可；但是高昂的治疗费用及副作用，使猪源性FⅧ及rFⅦa的应用均大打折扣[4]，通过基因工程方法生产的重组凝血因子虽然减少了传播病毒的危险，可也存在一些副反应(第1、2代制品)和理论上的危险[5]。预防疗法则主要是针对降低血友病发病率、提高患者生活质量而采取的措施。此外，中医药在血友病治疗上也取得了一定的进展，北京椿树医院血友病治疗中,6E报告了他们对424例血友病(A型、B型)患者采用中药治疗的情况，结果比较乐观，但相关的项目监测还有待进一步证明。以上疗法均需终身治疗且收费昂贵，因此血友病被形象地称为“贵族病”。基于传统治疗的缺点，2O世纪中末期兴起的基因治疗在血友病治疗领域的研究备受关注。
2血友病基因治疗
基因治疗是一种以改变基因表达为基础的治疗与预防遗传性疾病和多因素疾病的方法，它通过基因工程的实验手段，将正常基因(包括调控序列)导入基因缺陷的患者体内，使导入的基因发挥作用或使缺陷基因在原位得以校正和修复，从而纠正基因缺陷导致的各项异常表现。自1979年被首次运用于疾病治疗研究以来，基因治疗经过了准备期(1980—1989年)、狂热期(1990—1995年)和理性期(1996年至今)3个阶段[7]，这其问，因其所引发的毒副反应以及生殖细胞水平的基因治疗所涉及的一些伦理问题，曾一度处于停滞状态。国内自薛京伦等[8于1991年首次开展血友病基因治疗以来，血友病的基因治疗受到了广泛关注，并于2O 世纪末期有了长足进展。
血友病所以成为基因治疗研究的首选在于：1)血友病系单基因造成的凝血紊乱，基因水平上的发病机制已较为清楚，如FⅪ基因突变的相关数据库已建立(http：／／www．fac—torxi．org)。较之以前在血友病相关凝血因子基因、蛋白结构及其功能上的研究，近年来有不少学者致力于研究患者血小板聚集率以及FⅧ基因表达的调控[9]。2)正常血浆中凝血因子的含量很少[(g—mg)／L]，并且约正常凝血因子浓度的1O就可以维持正常凝血，而对于FⅧ缺乏患者来说，1％一5就能维持正常凝血[1。3)凝血因子在血浆中的水平没有很严格的调控，凝血因子在正常人群中的范围跨度较大，FⅧ、FIX的正常上限可达150。4)除肝脏能产生
凝血因子外，其它一些器官也能产生，靶器官的可选择范围较宽。5)凝血因子的相关基因已经克隆分离。6)构造动物模型时可选用体型较大的动物(如狗)，与人体环境较为相近。腺病毒载体于上世纪9O年代开始应用于人体内的基因治疗，在以小鼠、狗和猴子等动物为模型的实验中，均成功地表达了凝血因子并纠正了凝血紊乱的表型，这都显示出血友病基因的希望。随着载体在基因治疗中的重要性被人们所认识，载体的开发和改造也进一步深入和拓展，尤其是重组腺病毒的使用，使血友病的基因治疗有了可喜的前景Il。迄今为止，虽然尚无1项动物实验得到凝血因子终生持续表达的阳性结果，但长达几年的表达效果已显示出其巨大的潜在价值。1994年的首次临床实验方案采用了逆转录病毒载体途径；1995年则以人皮肤角质细胞为靶细胞，以鼠科白血病病毒为载体，将FIX的cDNA转入角质细胞中进行培养，结果外源基因稳定地整合到了角质细胞的染色体上。目前国际上关于血友病基因治疗的临床实验正在如火如荼地展开，GenStar公司研制的MAx—ADFⅧ腺病毒载体由1种普通的感冒病毒改造而成，该载体中所有与递呈病毒相关的基因都被编码FⅧ的基因所替代，目前MAX-ADFⅧ已进入临床试验阶段Il。Avigen生物技术公司用于治疗血友病B的Coagulin—B(TM)基因疗法通过肌内注射给药，临床试验进展良好，并已申请新药调查。我国在此研究领域起步较早，薛京伦等Il。]在国内首先开展了血友病B基因治疗研究，以皮肤成纤维细胞等为靶细胞，采用逆转录病毒、腺病毒及其相关病毒等介导的基因转移方法，作了人FIX的离体表达、动物试验和安全性检测等一系列研究，并早在1993年就进行了血友病B成纤维细胞的临床I期基因治疗试验，该课题组研制的AAV2一hFIX注射液已经获得国家食品药品监督管理局的药物I期临床研究批文，标志着我国血友病基因治疗已获得突破性进展。
3血友病基因治疗的影响因素及对策
目前影响基因治疗效果的主要因素包括载体引起的免疫反应、载体的安全性和外源基因不能持续高效表达等，解决的途径主要是选择合适的载体类型、适宜的载体剂量、载体进入宿主的途径以及特异性的靶器官等，除此之外，治疗时机的把握、患者情况的确认以及细胞因子对转入基因启动子的影响等也应考虑在内。3．1载体的类型主要分为病毒载体和非病毒载体，目前应用较多的是病毒载体。每种载体都有不同的应用对象，并且各有其优缺点。一般来说，AAV病毒[2]和
逆转录病毒所引发的副反应要弱些，而腺病毒载体则较强[2，但也有研究显示，由逆转录病毒介导的基因治疗所诱发的致癌风险远比预期的要高；此外，所引发免疫反应的强弱与质粒DNA中GpC模块的含量及其甲基化程度也有关。如何改造载体值得高度重视，目前主要是改变病毒载体的衣壳结构，修饰或尽可能削减病毒的编码基因]。有研究用血清型为2／5／6／8的AAv-cFⅧ载体对血友病小鼠和狗进行基因治疗，经过长时间的观察后发现，以血友病A小鼠和狗为动物模型，分别应用血清型为6／8和2／6／8的AAV—cFⅧ为载体，均持续表达了治疗活性水平的FⅧ，并且在长达3年的时间内没有检测到抗体或其它相关的毒性。目前一些特异性细胞靶向载体、新病毒或非病毒载体的开发正在有条不紊地开展。Essner等认为沉默的转座子可能成为以染色体为靶目标的非病毒载体，并且已有一系列针对血友病和I型糖尿病等疾病的试验结果表明转座子系统确实效果良好，相关研究现主要集中在靶位点的选择和插入后突变的形成等方面，它可能成为比病毒载体更安全可靠的另一种基因治疗途径。关于腺病毒依赖性辅助病毒的研究结果也比较乐观，这种病毒几乎缺失所有的病毒编码顺序，只产生很小的免疫反应以及几乎可以忽略的副反应l_2。Moayeri等[。。]利用逆转录病毒载体使造血干细胞表达转入的FⅧ，并待诱导免疫耐受后将造血干细胞移植人小鼠体内，在实验的6个月中凝血因子持续表达(正常血浆的11)，并只检测到极少量的FⅧ抗体。
3．2载体的剂量及进入宿主的途径不管是通过自体(直接体内)还是回体(间接体内)途径进入宿主，诱导产生免疫反应的细胞因子取决于载体的剂量。通过肝脏途径向小鼠体内注射大剂量的AAV一Ⅸ载体会引发对转入基因表达产物的耐受，通过肌肉注射则会产生FIX抗体，而使用低剂量的载体可避免对AAV病毒衣壳产生的特异性体液免疫反应，此外，转入基因的表达水平也可能影响免疫耐受。有研究对狗和大鼠通过骨骼肌注射包装有凝血因子FIX的AAVs，结果FIX的表达持续稳定，且未检测到FIX抗体，免疫反应较弱，这可能与其诱导产生TGF—B 和其它组分的CD4T细胞有关[3。也有研究将整合有外源基因的细胞装入经磁化处理的铁磁流体藻酸盐微胶囊中，分别输给患有血友病等疾病的小鼠，结果证明这种基因治疗方法效果较好，再通过核磁共振成像(MRI)对小鼠体内微胶囊进行追踪和尸解，发现微胶囊具有良好的渗透性和生物适应性，这为人类基因治疗中
免疫隔离方法的应用提供了有利的依据[32]。另外，Cao等I33研制了预防免疫反应的草案：预先在血友病B小鼠的鼻腔内，用含人FIX特异的CD4T细胞抗原决定簇反复处理，同时在将小鼠的FIX基因敲除后，利用腺病毒介导转人人FIX 至肝脏，即可诱导产生人FIX的IgG。结果显示经鼻腔处理的小鼠，其产生的抑制物大为减少，且体内FIX水平较恒定，基因敲除小鼠的部分凝血紊乱也得到持续纠正，这种免疫偏差是由IL-10和TGF-~的升高、CD4CD25T细胞调控机制的激活引发了T辅助细胞的一系列反应而造成的。
3．3靶(细胞)器官的选择目前血友病基因治疗的靶细胞主要是皮肤成纤维细胞和肝细胞。有研究对2条患血友病B狗的静脉注射辅助依赖性腺病毒载体(携带含FIX开放读框基因)，注射后2条狗的凝血时间从>60min下降到≤20min，并且在没有明显抑制剂产生的情况下分别持续了604和446d，这是此种载体在较大型动物上首次实现的长时间的表型纠正，虽然有几项实验指标异常，但尚未发现毒副作用]。
3．4基因治疗的时机基因治疗的时机对疗效的影响目前尚未达成共识。Xu等[35]的1项研究以新出生的血友病A小鼠和狗为模型动物，用与治疗无关的序列逆转录病毒为载体(如敲除了Ⅷ基因的B结构域等)作基因治疗，结果检测到动物体内血浆FⅧ：C达到了正常动物(139±22)和(116士5)的活性值，且保持了1．5年；凝血试验结果正常且未发现抑制因子，说明新出生的小鼠和狗所接触到的相关危险因素较少，因而存在的影响抑制因素也较少，新生儿期也应是基因治疗的适宜时机；对新生儿肝脏的基因治疗的研究结果显示，治疗后新生儿能持续分泌FⅧ，且治疗相关免疫副反应大为减少，这使得动物试验结果在人体试验的水平上得到了进一步的支持。另1项在母亲妊娠后期对基因缺陷确诊胎儿基因治疗的研究表明，该治疗的器官靶向性很强，这是在婴儿、青少年或成年时期的治疗所不能比拟的，该实验利用超声导向将包装有牛乳糖报告基因和FⅨ的腺病毒载体，从脐静脉进人胎儿的胎肝，随后转人的基因表达产物通过PCR、PT-PCR免疫组织化学法检出Es6]。但是也有人认为在胎儿期进行基因干预，会避免一些早发型的严重表征出现。对此，Coutelle等[3]用2年时间以小鼠为模型动物对胎儿血友病B作了基因治疗，发现小鼠在出生后都显示了较好的治疗效果，然而伴随着治疗却产生了发生率很高的肝癌并发症。这为基因治疗越早越好的观点提出
了一个较有力的反证。
3．5患者的情况患者暴露于危险因素的早晚会影响血友病的轻重程度，研究表明如果宿主在早期就感染过野生型AAV或AV，那么应用相关载体的基因治疗所引发的免疫反应会更强烈l3。当在小鼠中转人包装有人类基因的载体时，小鼠所产生的免疫反应因其遗传背景而异[3。此外，1项AV-LacZ载体介导的由上皮细胞转导的实验表明IFN一．y、IL-IO会下调启动子的活性，而TFN-AIL-I~和IL-4会上调启动子的活性，因此细胞因子对转人基因启动子的影响也不可忽视。
4展望
虽然肿瘤等发病率较高的疾病在目前是基因治疗研究的热点。但是基因治疗作为肿瘤治疗的手段之一尚不成熟，将血友病这种有典型意义的疾病作为模式是开启基因治疗这扇大门的金钥匙。科学正确地了解血友病的分子和细胞学病因，以及导致出血表型的致病机理是基因治疗的基本前提，再加上近些年对凝血因子的基础研究日臻完善。血友病的基因治疗也更加有的放矢。基因治疗在血友病方面的研究也会为凝血因子活性升高等其它凝血疾病。甚至肿瘤的治疗提供可借鉴的经验。根据历史的经验和教训，我们总结出正确对待基因治疗的思路是：重视基础研究，包括选好靶基因、加强病毒的生理周期、分子生物学与疾病发生发展的关系等基础研究。结合化学、物理和材料科学等学科，拓展具有实用性的病毒或非病毒型载体并加以有效地改造；深人研究各种疾病的整个病理生理过程；用细胞一组织一特异性启动子介导基因进人特殊类型的细胞，发展更多的基因转导动物模型；此外，在整个基因治疗过程中，全面、客观和正确的评价也是十分重要的，既要认识到基因治疗的巨大潜值，也要充分认识到其危险性，只有这样才能更快更好地完成血友病乃至多种疾病基因治疗的攻关任务。
血友病诊断和治疗的专家共识
?血友病论坛?血友病诊断和治疗的专家共识 编写人员(按姓氏笔划为序) 丁秋兰 上海交通大学医学院附属瑞金医院 王学锋 上海交通大学医学院附属瑞金医院 王鸿利 上海交通大学医学院附属瑞金医院 孙 竞 南方医科大学附属南方医院 华宝来 中国医学科学院北京协和医院 吴竞生 安徽医科大学附属省立医院 陈丽霞 中国医学科学院北京协和医院 杨仁池 中国医学科学院血液学研究所血液病医院 张心声 山东省血液中心 钟小红 南方医科大学附属南方医院 赵永强 中国医学科学院北京协和医院 血友病(hemop hilia)是一组性联隐性遗传的出血病。其临床上分为血友病A(凝血因子Ⅷ缺 陷症)和血友病B(凝血因子Ⅸ缺陷症)两型,分别由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)基因突 变所致。在男性人群中,血友病A的发病率约为1/5000,血友病B的发病率约为1/25000;所有 血友病男性患者中,血友病A约占80%～85%,血友病B约占15%～20%。女性血友病患者极 其罕见。 临床上,血友病以关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难止为特征。该病 患者的身心健康终生受到疾病的摧残和折磨,求学、就业,家庭、婚姻、经济来源和社会活动因病 而受到困扰和挫折。血友病患者属社会弱势群体,应受到家庭、社区、学校和单位等全社会的关 爱和扶持。作为医护人员,要“尽心、尽力、尽责任”地为患者及其家属排忧解难,应熟练掌握血友 病的基础知识和规范化诊治手段,全心全意地为患者服务。 本《共识》包括血友病的规范化诊断、替代治疗、围手术期处理、抑制物的诊治、辅助治疗、预 防治疗、康复/物理治疗、护理和教育及凝血因子制品简介等内容。着重从我国实际情况出发,适 当参考国外资料,在诺和诺德血友病基金会的大力资助下,由国内部分血友病专家分工撰写、集 体修订和反复定凿,最后达成共识,仅供国内同行参考使用。限于编者的水平和经验不足,文中 难免有缺点或不妥之处,敬请读者在使用过程中提出宝贵意见和建议,以便今后逐渐修改、充实 和完善。着重声明,本《共识》不负法律责任。 编写者 2008年9月
麻醉科临床诊疗指南
麻醉科临床诊疗指南 麻醉前病情估计和术前准备 第一节麻醉前病情分级 参考美国麻醉医师协会(ASA)病情分级 Ⅰ级:正常健康。 Ⅱ级:有轻度系统疾病 Ⅲ级:有严重系统性疾病，日常活动受限，但未完全丧失工作能力。 Ⅳ级:有严重系统性疾病，已丧失工作能力，且面临生命威胁。 V级:不论手术与否，生命难以维持24小时的濒死病人。 急症手术在每级前加注“急”或(E)。 I.Ⅱ级病人的一般性麻醉耐受力良好，Ⅲ级病人麻醉有一定危险性，应做好充分麻醉前准备和并发症防治，IV级病人的危险性极大，应做好积极抢救，围麻醉期随时都有发生意外的可能，术前必须向手术医师和家属详细交代清楚。 第二节常见伴随疾病的评估与准备 一、高血压病 1. 高血压病病人的麻醉风险取决于是否继发重要脏器的损害及损害程度，包括脑、心脏、冠脉供血和肾功能等改变。 2. 高血压病病人术中，术后可能发生高血压，低血压，心力衰竭，心脑血管意外等并发症。合并糖尿病和肥胖者麻醉手术的危险性更大。 3. 术前经内科治疗，应用降压药使血压控制在160/90mmHg以下，改善其他重要脏器功能及水电解质平衡后，方可进行手术麻醉。 4. 急症手术前亦应调控好血压及全身状态后，方可施行麻醉。 二、心脏病 1. 心功能1~2级病人对麻醉耐受性较好，心功能3~4级者对麻醉耐受性差，术前应改善心功能，控制慢性心衰。控制心率和快速房颤，心室率应控制在 100次/min以下。室性早搏应小于5次/min，除外多源性室性早搏或R on T，应掌握有效控制室性早搏的药物。
2. 心电图明显异常者，应经心内科会诊治疗。 3. 对缺血性心脏病，应从病史中明确是否存在心绞痛，既往有无心肌梗死史，目前心脏功能代偿情况，心肌梗死后6个月以上才能进行选择性手术麻醉。 4. 特殊传导阻滞并有心动过缓，晕厥史，对药物治疗反应差的病人，术前应安置临时起搏器，已安装起搏器的病人术前须经心内科确定起搏器功能正常;术中使用电灼器有一定危险性。 5. 按Goldman心血管功能危险指数，可作为非心脏手术的危险性评估（见表1)0 表1心脏危险性指数（Cardiac risk index，CRI)评估 评估项@ 指数 1病史 (1)年龄>70岁 5 (2)最近6个月内发生过心肌梗死 10 2体检 (1)有主动脉瓣狭窄 3 (2)有舒张期奔马律、第三心音或颈靜脉充血 11 3 ECG (1)有非窦性心律失常 7 (2)室性早溥>5次/hnin 7 4 HQ气分析与生化检查 (1 )PaO2<60mmHg(8.OkPa) 或PaCO2>50mmHg(6.6kPa) 3 (2)血钾<3.Ommoi/L或 HCQ3- <20mmoi/L (3)BUN>17.85mmoi/L 或 Cr->265. 2mmol/L (4)ALT异常,有慢性肝病 5手术种类 (1)腹腔内、胸腔内手术 3 (2)急症手术 4 CRI指数点越多，其心脏危险性越大 三、呼吸系统疾病 (-)呼吸困难程度分级
基因治疗的现状与展望
基因治疗的现状与展望 朱双喜 在生命进化的漫长历程中，生物体通过基因突变以适应环境，基因突变是生物进化的基础。同时，不利的突变会造成细胞形态和功能的异常，导致疾病，甚至机体的死亡。人体某些疾病的发生与基因的核苷酸序列变化有关，那么从校正核苷酸序列着手来治疗疾病的设想也就顺理成章了。基因治疗是向靶细胞引入正常的或野生型基因，纠正和补偿致病基因产生的缺陷从而达到治疗疾病的目的。．Anderson于80年代初首先阐述了基因治疗的前景；1990年美国成功地进行了ADA(腺苷脱氨酶)缺陷患儿的人体基因治疗；1991年我国首例基因治疗B型血友病也获得了成功。目前，基因治疗已从遗传病扩展到肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、传染病，包括AIDS病等领域。它依然存在例如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主产生免疫反应等一些问题。但随着人类基因组计划的实施、大批新基因的发现以及新技术的发展，治疗范围将大大拓宽，从而给人类健康事业带来深远的影响。一、基因治疗的前提 在基因治疗成为一种普通的医疗手段之前必须首先明确两个前提。 1．1 基因治疗需要有清晰定义的靶组织通常以疾病类型来选择进行基因治疗的细胞，例如在肺部系统纤维疾病的临床治疗中选择肺作为靶器官，使用呼吸道气雾剂法，可使含有补偿缺陷基因的DNA直接传递到肺中；治疗类似血友病的凝血因子疾病需要在血浆里含有达到治疗水平的凝血蛋白，这种蛋白可以由肌肉、活细胞、成纤维细胞或甚至血细胞提供，于是就可有多种接受基因治疗的靶组织。此外，靶组织的最终选择还必须考虑基因传递的效率、表达蛋白变性、机体免疫状态、可行性和治疗费用等因素。 1．2 究竞要往靶组织内传递多少治疗基因B型血友病的病因是缺乏一种称为第九因子的凝血蛋白，然而病人只需正常水平5％的这种蛋白，其生存机会就能提高，假设经治疗后的细胞能稳定表达这种蛋白，那么需要传递基因给人体全部1013个细胞中的5xlO11细胞；然而相对于大脑来说，只需几百个细胞被基因转染，神经性疾病的患者就可减轻痛苦；如果考虑对成血干细胞(或生殖细胞)进行基因转染，治疗几个细胞将会对其数以百万计的子代产生影响，所起的负作用也同样如此。 二、基因治疗的方法 基因治疗的应用有两种途径：(1)把一个健康基因拷贝插入靶细胞以补偿缺陷基因；(2)引进经过改造的基因以赋予细胞新的特性。最常用的技术有：(a)体外处理(ex vivo)疗法～将有基因缺陷的细胞取出，引入正常基因拷贝后再送回体内；(b)原位疗法，使用载体将目的基因直接导入靶组织。(c)体内疗法(in vivo)，将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将遗传信息安全有效地导入。 基因治疗载体可分为病毒型和非病毒型[4]两类。病毒型载体包括：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒和疱疹病毒，目前最有效的方法是使用经过改造的、具有穿膜特性的病毒作为载体，定向地将目的基因导入细胞。然而由于人体自身具有抗病毒的免疫系统，使用病毒载体作为媒介来传递DNA时就不得不面对宿主的免疫反应。非病毒型载体包 括：脂质体、裸露DNA和DNA包装颗粒，范围从裸DNA显微注射，电激法、基因枪技术等各类物理学方法到聚阳离子赖氨酸或阳离子脂质体。 三、基因治疗面临的问题 缺乏某种单基因产物而患病的病人，一旦获得一个野生型的基因拷贝并能正常表达，就有被治愈的可能。基因治疗亟待解决的问题是目的基因的定向表达，目的基因导入靶细胞是定向表达的基本条件。目前，必须优先发展有更强适用性和灵活性的能准确调控转导基因表达的基因传递系统，即发展一种理想的“载体”(能帮助新的基因"潜入")，人体细胞的特殊
《血友病治疗中国指南(2020年版)》要点
《血友病治疗中国指南（2020年版）》要点 血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B两种。前者为凝血因子（F）缺乏，后者为凝血因子（F）缺乏，分别由相应的凝血因子基因突变所致。近两年来，各种长效凝血因子产品和非因子类产品相继问世，部分产品已经在我国上市。因此，有必要对于过去的共识/指南进行更新。 一、治疗原则 血友病患者应该在血友病中心接受综合关怀团队的诊疗与随访。急性出血时应及早到附近的专业医疗机构接受治疗或者在家庭进行自我注射。早期治疗可以减少疼痛、功能障碍以及远期残疾，并显著减少因并发症导致的住院。家庭治疗必须由血友病中心的专业人员密切监管，且只有在患者及其家属得到充分的教育和培训后才能开始进行。 血友病患者应避免肌肉注射和外伤。原则上禁服阿斯匹林或其他非甾体类解热镇痛药以及所有可能影响血小板功能的药物。若有出血应及时给予足量的替代治疗，进行手术或者其他创伤性操作时，应进行充分的替代治疗。二、替代治疗的药物选择和给药方法 血友病A的替代治疗首选基因重组F制剂或病毒灭活的血源性F制剂，无上述条件时可选用冷沉淀或新鲜冰冻血浆等。每输注1IU/kg体重的F可使体内F活性（FC）提高2％。F在体内的半衰期约8～12h，要使体内F保持在一定水平需每8～12h输注1次。 血友病B的替代治疗首选基因重组F制剂或病毒灭活的血源性凝血酶原复合
物（PCC），无上述条件时可选用新鲜冰冻血浆等。每输注1IU/kg体重的F 可使体内F活性（FC）提高1％，F在体内的半衰期约为 18～24h，要使体内 F保持在一定水平需每天输注1次。 三、替代治疗的实施 （一）按需治疗和围手术期替代治疗 按需治疗是指有明显出血时给予的替代治疗，目的在于及时止血。及时充分的按需治疗不仅可以及时止血止痛，更可阻止危及生命的严重出血的发展。围手术期替代治疗是指手术前、手术中和手术后进行的替代治疗，目的在于保证血友病患者手术的顺利实施和手术后的顺利康复。具体替代治疗方案见表1和表2。 （二）预防治疗 预防治疗是指为了防止出血而定期给予的规律性替代治疗，是以维持正常关节和肌肉功能为目标的治疗，通常分为以下三种： （1）初级预防治疗： （2）次级预防治疗： （3）三级预防治疗： 我们建议在发生第一次关节出血或者严重肌肉出血或颅内出血或其他危及生命的出血即应开始预防治疗关于预防治疗，国际上没有统一的标准方案。最低剂量为英国1976年在血友病A中使用12IU/kg，每周1次。 基于我国实际情况，目前仍普遍采用的是以下低剂量方案：血友病A：F制剂10IU/kg体重每周2～3次；血友病 B：F制剂 20IU/kg 体重每周1 次。非因子类产品的上市彻底改变了血友病 A 替代治疗模式。
基因治疗的发展现状和存在风险分析
基因治疗的发展现状和存在风险分析 发表时间：2019-06-24T10:40:47.343Z 来源：《成功》2019年第1期作者：傅思博 [导读] 随着生物科学的发展，科学家们逐渐解开了生命的密码——基因，作为遗传信息的DNA片段，人们发现可以通过改善或改变基因的排列组合，或通过外源性基因的植入，可以解决非常多的遗传疾病，乃至于改善后代生育的质量。但同时外源性基因侵入的风险和伦理问题也是基因工程面临的主要问题。 傅思博 西安市铁一中陕西西安 710016 【摘要】随着生物科学的发展，科学家们逐渐解开了生命的密码——基因，作为遗传信息的DNA片段，人们发现可以通过改善或改变基因的排列组合，或通过外源性基因的植入，可以解决非常多的遗传疾病，乃至于改善后代生育的质量。但同时外源性基因侵入的风险和伦理问题也是基因工程面临的主要问题。 【关键词】基因；基因工程；基因治疗；风险分析 一、基因与基因工程概述 （一）基因就是带有遗传信息的DNA片段，它是控制生物性状的基本遗传单位 基因（遗传因子）是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。基因支持着生命的基本构造和性能。储存着生命的种族、血型、孕育、生长、凋亡等过程的全部信息。环境和遗传的互相依赖，演绎着生命的繁衍、细胞分裂和蛋白质合成等重要生理过程。生物体的生、长、衰、病、老、死等一切生命现象都与基因有关。它也是决定生命健康的内在因素。因此，基因具有双重属性：物质性（存在方式）和信息性（根本属性）。 基因有两个基本特点：一是能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；二是在繁衍后代上，基因能够突变或变异，当受精卵或母体受到环境或遗传的影响，后代的基因组会发生有害缺陷或突变。 （二）基因工程的基本定义 基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译、表达。也就是说，它是将一种生物体的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状。基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展的基础上诞生的一门崭新的生物技术科学。它与细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。 实施基因工程一般包括四个操作步骤：一是提取目的基因；二是目的基因与运载体结合；三是将目的基因导入受体细胞内；四是目的基因的检测和表达。 二、基因治疗的发展现状 随着人类对基因研究的不断深入，发现许多疾病是由于基因结构与功能发生改变所引起的。科学家将不仅能发现有缺陷的基因，而且还能掌握如何进行对基因诊断、修复、治疗和预防，这是生物技术发展的前沿。这项成果将给人类的健康和生活带来不可估量的福音。 （一）基因治疗的原理 基因治疗是指以改变人类遗传病物质为基础的生物医学治疗,即通过一定方式将人正常或野生型基因或有治疗作用的DNA顺序导入人体靶细胞,以矫正或置换致病基因的治疗方法[1]。已发现的遗传病有6500多种，其中由单基因缺陷引起的就有约3000多种。因此，遗传病是基因治疗的主要对象。第一例基因治疗是美国在1990年进行的。当时，两个4岁和9岁的小女孩由于体内腺苷脱氨酶缺乏而患了严重的联合免疫缺陷症。科学家对她们进行了基因治疗并取得了成功。这一开创性的工作标志着基因治疗已经从实验研究过渡到临床实验。1991年，我国首例B型血友病的基因治疗临床实验也获得了成功。 （二）基因治疗的最新进展 基因治疗的最新进展是即将用基因枪技术用于治疗。其方法是将特定DNA用改进的基因枪技术导入小鼠的肌肉、肝脏、脾、肠道和皮肤获得成功的表达。这一成功预示着人们未来可能利用基因枪传送药物到人体内的特定部位，以取代传统的接种疫苗，并用基因枪技术来治疗遗传病。 按照遗传基本原理，如果某些基因能帮助父母生存和繁殖，父母就会把这些基因传给后代。但一些研究表明，真实情况要复杂得多：基因可以被关闭或沉默，以应对环境或其他因素，这些变化有时也能从一代传到下一代。美国马里兰大学遗传学家提出了一种特殊机制，父母通过这种机制可以把沉默基因遗传给后代，而且这种沉默可以保持25代以上。这一发现可能改变人们对动物进化的理解，有助于将来设计广泛的遗传疾病疗法。 所以，据此我们可以设想，第一、在孕期进行产前诊断，检测出遗传病基因后提取胚胎内细胞团，通过基因重组将人工编辑的dsRNA 基因导入内细胞团中，使遗传病的基因暂时性无法正常表达后进行基因编辑与剪辑替换。第二、暂时延缓遗传类疾病的病情恶化，延缓发病时间，为医生和患者争取更多治疗时间。如果实验疗效得到进一步确证的话，就有可能将胎儿基因疗法扩大到其它遗传病，以防止出生患遗传病症的新生儿，从而从根本上提高后代的健康水平。 三、基因治疗的风险分析 （一）现阶段基因治疗的技术风险 基因治疗的技术风险是指，由于技术本身的不成熟而导致患者，受试者的身心伤害。它包括疾病的种类，致病概率的大小和风险的严重程度等三个方面。[2] 在基因临床试验中，技术风险表现在三个方面：1.如何选择有效的治疗基因；2.如何构建安全载体，病毒载体效率较高，但却有潜在的危险性；3.如何定向导入靶细胞，并获得高表达。 （二）现阶段基因治疗的伦理风险 基因工程同其他科学技术成果一样也是一把双刃剑：它一方面给人类带来了巨大的福祉,但同时也产生了巨大的伦理风险。基因治疗技术的快速发展使我们不得不认真思考“人是什么”这个问题，如果人类可以改良基因，那么人类基因的权利何在？因此,由基因的特殊性所引
血友病A临床路径
血友病A临床路径 （2011年版） 一、血友病A临床路径标准住院流程 （一）适用对象。 第一诊断为血友病A（ICD-10：D66.x01）。 （二）诊断依据。 根据《血液病诊断和疗效标准》（张之南、沈悌主编，科学出版社，2008年，第三版）、《血友病》（杨仁池等主编，上海科学技术出版社，2007)、《临床诊疗指南-血液病学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社，2006）。 1.患者几乎均为男性（女性患者为纯合子，极罕见）,有或无家族史，有家族史者符合X性联隐性遗传规律。 2.关节、肌肉、深部组织及内脏出血,外伤或手术后延迟性出血为其特点，但也可自发性出血。反复出血可见关节畸形和假肿瘤。 3.实验室检查： （1）凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原定量正常，活化的部分凝血活酶时间（APTT）延长，能被正常新鲜血浆及吸附血浆纠正。血小板计数、出血时间、血块收缩正常。（出血时间，血块收缩：建议根据条件选择性做）
（2）凝血因子Ⅷ活性（FⅧ:C）减少，FⅧ:C>5–40％为轻型，1–5％为中型，≤1％为重型。 （3）血管性血友病因子（vWF）抗原正常。 （三）治疗方案的选择。 根据《血友病》（杨仁池等主编，上海科学技术出版社，2007)、血友病治疗指南（英国血友病中心医师组织，Haemophilia，2008）、《临床诊疗指南-血液病学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社，2006年）。 1.局部止血措施和注意事项：包括制动、局部压迫包扎和放置冰袋、局部用止血粉、凝血酶或明胶海绵贴敷等。口腔出血可含服氨加环酸。避免肌肉注射、外伤和手术，如必须手术，需行凝血因子替代治疗。禁服阿斯匹林或其他非甾体类解热镇痛药及所有影响血小板聚集的药物。 2.替代疗法： （1）因子Ⅷ制剂：首选血浆源性因子Ⅷ制剂。因子Ⅷ半衰期8–12小时，常需每日输注2次（首次输注后2-4小时需重复，后8-12小时重复）。重组人凝血因子Ⅷ，为人工合成，病毒等病原污染的可能性更低，有条件者可选用。 （2）冷沉淀物：含因子Ⅷ、纤维蛋白原等凝血因子，因子Ⅷ较新鲜血浆高5–10倍，用于无条件使用因子Ⅷ制剂者。 （3）新鲜血浆或新鲜冰冻血浆：含所有的凝血因子等血浆蛋白，仅用于无条件使用因子Ⅷ制剂和冷沉淀者。
儿童血友病诊疗规范(2019年版)
附件3 儿童血友病诊疗规范 （2019年版） 一、概述 血友病（Hemophilia）是一组遗传性出血性疾病，呈X 染色体连锁隐性遗传。临床上主要分为血友病A（凝血因子Ⅷ缺乏症）和血友病B（凝血因子Ⅸ缺乏症）两型。临床表现以关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难止，常在儿童期起病，反复关节出血导致患儿逐渐出现关节活动障碍而残疾。男性人群中，血友病A的发病率约为1/5 000，血友病B的发病率约为1/25000。所有血友病患者中，血友病A占80%～85%，血友病B占15%～20%。女性血友病患者极其罕见。由于经济等各方面原因，血友病的患病率在不同国家甚至同一国家的不同时期都存在很大的差异。我国1986～1989年期间在全国24个省的37个地区进行的调查结果显示，我国血友病的患病率为2.73/10万人口。 因此，对血友病的早期识别和诊断，以及积极、合理的治疗十分重要。确诊血友病的患儿，通过合理的、正确的预防治疗，可以避免出血以及出血造成的骨关节病及残疾等并发症，能够保护儿童身心的健康成长。 二、适用范围
经临床症状、家族遗传病史、实验室检测等检查确诊的儿童血友病。不包括获得性血友病。 三、诊断 （一）临床表现 血友病患儿可以发生任何部位的出血，但多数出血集中在关节、肌肉；其他部位也可有皮肤、黏膜出血，如瘀斑、鼻衄、口腔出血、消化道出血、泌尿道出血等；严重危及生命的出血，如内脏出血、颅内出血等。重型患儿出血表现明显，且常在没有明显外伤诱因时自发性出血、而轻型患儿仅表现为外伤或手术后的出血倾向。 由于凝血因子Ⅷ和Ⅸ在内源性凝血途径中具有重要的作用，血友病患儿的出血常呈现血液缓慢渗出表现，其出血损伤程度与出血量相关，而出血量又与出血持续时间相关，因此，早期判断和及时止血处理非常重要。 如发现患儿有异常的瘀斑增多、粘膜出血、手术或外伤后的过度出血、延迟出血、不寻常的血肿、无确定病因的关节肿痛等，即要考虑出血性疾病的可能，尤其是血友病。可疑患者需追问家族史，进行有关实验室检查予以确诊。 （二）实验室检查 1.筛选试验：疑为出血性疾病的患儿需做以下筛选试验。包括：血常规和血涂片（血小板计数和形态），首先排除血小板异常导致的出血；凝血谱[凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APPT）、凝血酶时间（TT）和/或纤
血友病治疗
综合治疗的内容 血友病的综合治疗是血友病的最佳治疗，不仅包括血友病 的替代治疗(专业医生的治疗和家庭治疗)、药物治疗，还包括出血的预防、止血后的功能恢复锻炼、如何解决所遇到的诸如学习和就业等的一些特殊的社会问题。 4．1替代治疗仍然是目前血友病最有效的止血措施。4．1．1血友病A的替代治疗 (1)血浆冷沉淀：冷沉淀是从献血者全血分离的FFP制 备的，未经病毒灭活及FV!含量不稳定已被发达国家弃用，但仍为我国等发展中国家的部分患者使用，适用于无浓缩物条件的轻、中型血友病A患者。 (2)新鲜冰冻血浆：适合无浓缩条件时轻、中型血友病A 的治疗。重型血友病A患者、大出血患者或手术患者不能单纯应用新鲜冰冻治疗出血。 (3)中纯度凝血因子FW浓缩制剂：适用于中型或重型血 友病A患者。该制品的优点是经过病毒灭活，纯度高，便于存放。 (4)高纯度凝血因子FVl浓缩制剂：适用于重型血友病A。 该制剂的优点是改进溶解性，降低纤维蛋白原的同种凝集素，对患者很少有免疫作用，输血后病毒感染率大大降低。 (5)重组凝血因子Ⅷ浓缩制剂：该制品不受病毒污染，避 免了血液制品相关疾病(如HIV感染、输血后肝炎等)的发生，
安全性高，无明显毒副作用。国外研究显示，采用rFⅧ进行预防性治疗，可以预防严重血友病A患儿关节损伤，降低其关节和其他部位出血发生一o。 4．1．2血友病B的替代治疗 (1)血浆：一般不适用于血友病B，仅用于无浓缩物时。 (2)凝血酶原复合物浓缩剂(PCC)：是目前国内血友病B 万方数据·90· 替代治疗的主要制品，但PCC治疗血友病并不十分理想，因其含有多种其他凝血闪子，有增加发生血栓栓塞的危险。 (3)高纯度FⅨ制剂：国外目前广泛使用。许多研究证实， 高纯度FⅨ制刺疗效高，无病毒、血栓危险，无抑制物的血友病B患者，应首选纯化的FIX制品。 4．2药物辅助治疗 4．2．1 l-去氨基-8·D-精氨酸加压素(DDA VP) 是治疗轻型 血友病A出血的首选药物，町避免替代治疗所致相关疾病的 发生(如肝炎、HIV或抑制物产生)，但对血友病B无效。常见的副作用可引起水潴留、低钠血症‘10,11]。 4．2．2抗纤溶药物临床上常用的抗纤溶药物有氨基乙酸和 氨甲环酸等。此类药物对口腔、舌、扁桃体、咽喉部的出血及拔牙引起的出血有效，但对关节腔、深部肌肉和内脏出血疗效较差，血尿，肾功能不全出现时禁用。 4．2．3肾上腺皮质激素对减少出血，加速血肿吸收，减轻关
血友病A
血友病A临床路径 一、血友病A临床路径标准住院流程 （一）适用对象。 第一诊断为血友病A（ICD-10：D66.x01）。 （二）诊断依据。 根据《血液病诊断和疗效标准》（张之南、沈悌主编，科学出版社，2008年，第三版）、《血友病》（杨仁池等主编，上海科学技术出版社，2007)、《临床诊疗指南-血液病学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社，2006）。 1.患者几乎均为男性（女性患者为纯合子，极罕见）,有或无家族史，有家族史者符合X性联隐性遗传规律。 2.关节、肌肉、深部组织及内脏出血,外伤或手术后延迟性出血为其特点，但也可自发性出血。反复出血可见关节畸形和假肿瘤。 3.实验室检查： （1）凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原定量正常，活化的部分凝血活酶时间（APTT）延长，能被正常新鲜血浆及吸附血浆纠正。血小板计数、出血时间、血块收缩正常。（出血时间，血块收缩：建议根据条件选择性做）
（2）凝血因子Ⅷ活性（FⅧ:C）减少，FⅧ:C>5–40％为轻型，1–5％为中型，≤1％为重型。 （3）血管性血友病因子（vWF）抗原正常。 （三）治疗方案的选择。 根据《血友病》（杨仁池等主编，上海科学技术出版社，2007)、血友病治疗指南（英国血友病中心医师组织，Haemophilia，2008）、《临床诊疗指南-血液病学分册》（中华医学会编著，人民卫生出版社，2006年）。 1.局部止血措施和注意事项：包括制动、局部压迫包扎和放置冰袋、局部用止血粉、凝血酶或明胶海绵贴敷等。口腔出血可含服氨加环酸。避免肌肉注射、外伤和手术，如必须手术，需行凝血因子替代治疗。禁服阿斯匹林或其他非甾体类解热镇痛药及所有影响血小板聚集的药物。 2.替代疗法： （1）因子Ⅷ制剂：首选血浆源性因子Ⅷ制剂。因子Ⅷ半衰期8–12小时，常需每日输注2次（首次输注后2-4小时需重复，后8-12小时重复）。重组人凝血因子Ⅷ，为人工合成，病毒等病原污染的可能性更低，有条件者可选用。 （2）冷沉淀物：含因子Ⅷ、纤维蛋白原等凝血因子，因子Ⅷ较新鲜血浆高5–10倍，用于无条件使用因子Ⅷ制剂者。
基因治疗(Gene Therapy)的研究概况及前景展望
基因治疗(Gene Therapy)的研究概况及前景展望 摘要:基因治疗(Gene Therapy)是一种新的治疗手段，也是基因工程在应用领域一项较为常见的技术。主要是指向靶细胞或组织中引入外源基因DNA 或RNA 片段,以纠正或补偿基因的缺陷,关闭或抑制异常表达的基因,从而达到治疗遗传性或感染性疾病的目的[1]。 它可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、传染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入到特异的细胞。本文主要介绍基因治疗的基本概念、基本方法及面临的主要问题，就基因转移的载体、基因表达的调控、基因治疗的安全性等方面的研究进展进行综述和评价，并探讨今后基因治疗的发展方向。 关键词:基因治疗；基因导入系统；基因表达调控；安全性；发展方向 21世纪是生物科学与生物技术的世纪，随着转基因技术、反义核酸技术、RNAi技术等基因操作方法的发展与完善，采用分子生物学手段治疗遗传疾病、
肿瘤、心血管和代谢性疾病等已成为本世纪的一大热点领域[2]。从1990年美国FDA批准第1项人类基因治疗的临床试验方案至今,基因治疗的研究已经走过了20年余的历程,其研究迅速发展,已取得很多突破，但仍处于比较幼稚的阶段，还不能成为临床常规的治疗手段[3]。目前，治疗已成为一项跨世纪工程，越来越多的受到科学界的关注，已有少数有确切疗效的临床试验。现将基因治疗及其研究的现状综述如下。 1 基因治疗的简介及概况 1.1 基因治疗的概念 经典的基因治疗指在基因水平上对遗传缺陷进行纠正。但临床实践表明,基因治疗在后天获得性疾病如肿瘤等方面的应用,要远多于先天性疾病,所以现在基因治疗已转变为:为达到治疗目的而在基因水平进行的操作。基因治疗已从对单基因缺陷性遗传病的基因替代治疗,拓展至对致病基因的修正和基因增强治疗,以及采用外源调理性细胞因子基因、核酶类及反义核酸类基因药物进行治疗[4]。 1.2 基因治疗的种类[5] 基因治疗根据靶细胞的类型可分为生殖细胞(germ cell)基因治疗和体细胞(somatic cell)基因治疗。从理论上讲,体细胞基因治疗只涉及体细胞的遗传转变,不影响下一代,现已被广泛接受做为严重疾病的治疗方法之一,在现代伦理道德上是可行的。方法上易于施行,而且已取得了可喜的成果。 根据基因转移的途径可将基因治疗分为in vivo (活体直接转移,或称一步法)和ex vivo(回体转移或称二步法)。前者指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNA直接导入体内。后者通过选择适当的靶细胞,在体外进行基因转移,筛选可表达外源基因的细胞,再将这些细胞转移至体内。体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质,目前对其研究日益增多,可能将成为基因治疗最有前途的方法。 1.3基因治疗的策略 根据宿主病变的不同,基因治疗的策略也不同,概括起来主要有下列四种: (1)基因替代(gene replacement)，去除整个变异基因,用有功能的正常外源基因取代之,使致病基因得到永久地更正。 (2)基因修正(gene correction)，指将致病基因的突变碱基序列纠正,而正常部分予以保留。 (3)基因增强(gene augmentation)，指将目的基因导入病变细胞或其它细胞,目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。 (4)基因抑制(gene constraint)和基因失活(gene inactivation)，导入外源基因去干扰、抑制有害的基因表达。 1.4 基因治疗的基本环节 1.4.1 目的基因的选择 用于基因治疗的目的基因选择原则为:(1)该基因的异常是疾病发生的根源;(2)该基因遗传的分子机制清楚;(3)基因已被克隆,一级结构和表达调控机制较为清楚;(4)可在体外操作,而且安全有效;(5)转移基因在受体细胞内最好能够完整地、稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白质。随着分子生物学与基因重组技术的发展，基因获取的手段也逐步成熟。目前，获取目的基因的主要方法有利用分子生物学手段分离和克隆目标基因，如利用酶切或逆转录等方法，或采用人工手段合成目的基因片段。
血友病B的基因治疗
中华血液学杂志2013-10-15分享 血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子Ⅸ（F Ⅸ）的缺乏。在男性中发病率约为1/25 000 ，依据血浆FⅨ活性（FⅨ∶C）分为重型（F Ⅸ∶C<1%）、中间型（F Ⅸ∶C 1%~5%）和轻型（F Ⅸ∶C >5% ，≤40%）。 目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组FⅨ制剂），但反复输注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。 基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、F Ⅸ基因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B 成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。 一.载体系统 1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA 病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。 AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多种血清型。AAV2 是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV。 总体而言，AAV7、8、9 产生的免疫反应较AAV1、2、5 轻。Wang 等分别应用AAV1、2、5、7、8、9 对FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FⅨ∶C、抗FⅨ特异性IgG1 和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。 结果显示以肌肉组织作为靶组织时，AAV7、8、9 转染效率高于AAV1、2、5，未发现针对导入的FⅨ基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV 载体（self-complementaryAAV, scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV 载体（singlestrandedAAV, ssAAV）表达滞后的缺点。 ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1 个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1 条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。
血友病诊断与治疗中国专家共识(完整版)
血友病诊断与治疗中国专家共识（完整版） 一、定义 血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B两种。前者为凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺乏，后者为凝血因子Ⅸ（FⅨ）缺乏，均由相应的凝血因子基因突变引起[1]。 二、流行病学 血友病的发病率没有种族或地区差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5 000，血友病B的发病率约为1/25 000。所有血友病患者中，血友病A占80%~85%，血友病B占15%~20%。女性血友病患者极其罕见。由于经济等各方面的原因，血友病的患病率在不同国家甚至同一国家的不同时期都存在很大的差异。我国1986至1989年期间在全国24个省的37个地区进行的调查结果显示，我国血友病的患病率为 2.73/100 000人口[1]。 三、临床表现与分型 血友病A和血友病B的临床表现相同，主要表现为关节、肌肉和深部组织出血，也可有胃肠道、泌尿道、中枢神经系统出血以及拔牙后出血不止等。若反复出血，不及时治疗可导致关节畸形和（或）假肿瘤形成，严重者可危及生命。外伤或手术后延迟性出血是本病的特点。根据患者凝血因子活性水平可将血友病分为轻型、中间型和重型[2]（表1）。轻型患者一般很少出血，只有在损伤或手术后才发生；重型患者自幼可有自发性出
血（可发生于身体的任何部位）；中间型患者出血的严重程度介于轻型和重型之间。 表1 血友病A和血友病B的临床分型 四、实验室检查 1．血小板计数正常、凝血酶原时间（PT）正常、凝血酶时间（TT）正常、出血时间正常；血块回缩试验正常，纤维蛋白原定量正常。 2．重型血友病患者激活的部分凝血活酶时间（APTT）延长，轻型血友病患者APTT仅轻度延长或正常。 3．确诊试验：确诊血友病有赖于FⅧ活性（FⅧ∶C）、FⅨ活性（FⅨ∶C）以及血管性血友病因子抗原（VWF∶Ag）的测定。血友病A患者FⅧ∶C减低或缺乏，VWF∶Ag正常，FⅧ∶C/VWF∶Ag明显降低。血友病B 患者FⅨ∶C减低或缺乏。 4．抑制物检测：若患者治疗效果不如既往，应检测凝血因子抑制物。对于儿童患者，建议在首次接受凝血因子产品后的前20个暴露日每5个暴露日检测1次，在21~50个暴露日内每10个暴露日检测1次，此后每年至少检测2次，直至150个暴露日[3]。此外，患者接受手术前必须检测抑制物。
血友病诊断与治疗中国专家共识(最全版)
血友病诊断与治疗中国专家共识（最全版） 一、定义 血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B两种。前者为凝血因子Ⅷ(FⅧ)质或量的异常所致，后者系F Ⅸ质或量的异常所致。 二、血友病的流行病学 在男性人群中血友病A的发病率约为1/5 000，血友病B的发病率约为1/25 000；血友病A占血友病患者80%～85%，血友病B占15%～20%。而女性血友病患者极其罕见。 三、临床表现 1．血友病A和血友病B的临床表现相同，主要表现为关节、肌肉和深部组织出血，也可有胃肠道、泌尿道、中枢神经系统出血以及拔牙后出血不止等。若不及时治疗可导致关节畸形和假肿瘤等，严重者可以危及生命。 2．外伤或手术后延迟性出血是本病的特点。 3．轻型患者一般很少出血，只有在损伤或手术后才发生出血；重型患者则自幼即有出血，身体的任何部位都可出血；中间型患者出血的严重程度介于轻型和重型之间。 四、实验室检查 1．血小板计数正常、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、出血时间等正常；血块回缩试验正常，纤维蛋白原定量正常。
2．重型血友病患者激活的部分凝血活酶时间(APTT)延长，轻型血友病患者APTT仅轻度延长或为正常高限。 3．简易凝血活酶生成纠正试验(仅限基层单位使用)可用于初步鉴别血友病的类型，血友病A能被吸附血浆纠正，不能被正常血清纠正；血友病B能被正常血清纠正，但不能被吸附血浆纠正。 4．确诊试验：要确诊血友病则有赖于FⅧ∶C、FⅨ∶C以及vWF∶Ag 的测定。血友病A患者FⅧ∶C减低或极低，vWF∶Ag正常，FⅧ∶C/vWF∶Ag比值明显降低。血友病B患者FⅨ∶C减低或缺乏。 5．抑制物检测：若发生患者治疗效果不如既往，应该考虑患者可能产生了抑制物，应进行凝血因子抑制物滴度测定。抑制物的滴度(以FⅧ为例)：不同稀释度的患者血浆与正常血浆等量混合，孵育2 h，测定残余FⅧ活性。能使正常血浆FⅧ活性减少50%时，则定义为FⅧ抑制物的含量为1个Bethesda单位(BU)，此时患者血浆稀释度的倒数即为抑制物滴度，以BU /ml血浆表示。2001年国际血栓与止血学会规定以5 BU为界：若抑制物滴度>5 BU，则为高滴度抑制物；若抑制物滴度≤5 BU，则为低滴度抑制物。基层单位可以进行凝血因子抑制物筛选，即APTT纠正试验(正常血浆和患者血浆按1∶1混合后再测定APTT，不能纠正至正常应考虑为可能存在抑制物)。 6．分型：根据FⅧ或FⅨ的活性水平可将血友病分为3型(表1)。
贫血诊治指南
贫血诊治指南 疾病简介： 贫血(anemia)是指人体外周血红细胞容量臧少，低于正常范围下限的一种常见的临床症状。由于红细胞容量测定较复杂，临床上常以血红蛋白(Hb)浓度来代替。我国血液病学家认为在我国海平面地区，成年男性Hb<120g/L，成年女性(非妊娠)Hb<110g/L，孕妇Hb<100g/L就有贫血。治疗上主要是对症、对因治疗。 发病原因 基于不同的临床特点，贫血有不同的分类。如：按贫血进展速度分急、慢性贫血;按红细胞形态分大细胞性贫血、正常细胞性贫血和小细胞低色素性贫血;按血红蛋白浓度分轻度、中度、重度和极重度贫血;按骨髓红系增生情况分增生性贫血(如溶血性贫血、缺铁性贫血、巨幼细胞贫血等)和增生低下性贫血(如再生障碍性贫血)。 临床上常从贫血发病机制和病因的分类： (一)红细胞生成减少性贫血 造血细胞、骨髓造血微环境和造血原料的异常影响红细胞生成，可形成红细胞生成减少性贫血。 1.造血干祖细胞异常所致贫血 (1)再生障碍性贫血(aplastic anemia，AA)：AA是一种骨髓造血功能衰竭症，与原发和继发的造血干祖细胞损害有关。部分全血细胞减少症的发病机制与B细胞产生抗骨髓细胞自身抗体，进而破坏或抑制骨髓造血细胞有关。 (2)纯红细胞再生障碍贫血(pure red cell anemia，PRCA)：PRCA是指骨髓红系造血干祖细胞受到损害，进而引起贫血。依据病因，该病可分为先天性和后天性两类。先天性PRCA即 Diamond-Blackfan综合征，系遗传所致;后天性PRCA 包括原发、继发两类。有学者发现部分原发性PRCA患者血清中有自身EPO或幼红细胞抗体。继发性PRCA主要有药物相关型、感染相关型(细菌和病毒，如微小病毒B19、肝炎病毒等)、自身免疫病相关型、淋巴细胞增殖性疾病相关型(如胸腺瘤、淋巴瘤、浆细胞病和淋巴细胞白血病等)以及急性再生障碍危象等。 (3)先天性红细胞生成异常性贫血(congenital dyserythropoietic anemia，CDA)：CDA是一类遗传性红系干祖细胞良性克隆异常所致的、以红系无效造血和形态异常为特征的难治性贫血。根据遗传方式，该病可分为常染色体隐陛遗传型和显性遗传型。
关于基因治疗的现状与发展
一前言 基因工程是70年代初发展起来的一门技术，由于它有广阔的理论和应用前景，进展极为迅速，现已广泛应用于药品、农业、工业各方面。在医学方面，基因治疗是人们极为关注的领域，因为人类的遗传疾病有2000中以上，但却没有有效的治疗方法。遗传疾病的根本原因是基因有了缺陷基因治疗就是在机体中而基因治疗是指应用DNA 重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的[1]。也就是将有缺陷的基因换上正常的基因，并使之适当表达，基因治疗是通过基因工程手段将正常基因包括它表达所需的顺序导入该基因有缺陷的遗传病患者体内，使导入基因发挥作用，从而纠正基因缺陷所导致的各种病变。
二本论 2.1 基因治疗的概念 基因治疗可以分为两类，生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。前者关系到伦理问题后者较易进行，所以基因治疗主要从体细胞基因着手。目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。广义的基因治疗是指利用基因药物治疗，而通常说的狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，一般用DNA序列，主要的治疗途径是体外基因治疗，即在体外用基因转染病人靶细胞，然后将经转染的靶细胞输入病人体内，最终给予病人的疗效物质是基因修饰的细胞，而不是基因药物。除间接体内法外，还可以用基因药物进行直接体内途径治疗，这些基因药物可以是完整基因，也可以是基因片段；可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗[2]。 2.2基因治疗的方法[3] 1基因转移的方法 （1）特异正常基因的分离与克隆：应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果，已有不少基因被分离和克隆，而且将有更多的基因会被克隆。在当代分子生物技术条件下，一般来说，只要有准确的基因定位和基因探针，任何基因都可被克隆。 在这个前提下，人工合成DNA探针和用DNA合成仪在体外人工合成基因，都是在基因治疗前，分离克隆特异基因的有利条件。 2外源基因转移：基因转移是将外源基因导入细胞内，其方法较多，常用的有下列几类： 物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。 a显微注射法：显微注射是在显微镜下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法一般情况下是有效的。但一次只能注射一个细胞，耗力费时。此法用于生殖细胞时，有效率可达10％。但直接用于体细胞却很困难。在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达后传代，这样的动物就称为转基因动物。目前成功较多的是转基因小鼠，它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。 b电穿孔法：电穿孔法是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性穿孔，使周围基质中的DNA可渗进细胞，但也有可能使细胞受到严重损伤。 c脂质体法：脂质体法是应用人工脂质体包裹外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，并使之表达。