人TNF(elisa)2
Human TNF-a ELISA Kit 操作手册说明书
Human TNF‑a ELISA KitCatalog Number KHC3011 (96 tests), KHC3012 (2 × 96 tests), and KHC3011C (5 × 96 tests)Pub. No. MAN0003931 Rev.5.0 (32)CAUTION! This kit contains materials with small quantities of sodium azide and Proclin™ 300. Sodium azide reacts with lead and copper plumbing to form explosive metal azides. Upon disposal, flush drains with a large volume of water to prevent azide accumulation. In case of contact, rinse affected area with plenty of water. Proclin™ 300 is toxic, corrosive, and a skin irritant. Avoid ingestion and contact with eyes, skin and mucous membranes. In case of contact, rinse affected area with plenty of water. Observe all federal, state, and local regulations for disposal.Note: For safety and biohazard guidelines, see the “Safety” appendix in the ELISA Technical Guide (Pub. no. MAN0006706). Read the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves.Product descriptionThe Invitrogen™ Human TNF-a ELISA Kit is a solid-phase sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). This assay is designed to detect and quantify the level of human TNF-a in human serum, plasma, buffered solutions, or cell culture medium. The assay recognizes both natural and recombinant human TNF-a.Human tumor necrosis factor alpha (Hu TNF-a), also called cachectin, is a 157 AA non-glycosylated polypeptide cytokine produced by activated macrophages. Lipopolysaccharide (LPS) is a potent stimulus for TNF-a production in macrophages, and TNF-a is an important mediator of the in vivo effects of LPS. The biological activities of TNF-a may be classified as:- Immunomodulating and proinflammatory: TNF-a regulates the production of antibodies by B cells and stimulates cytotoxic T cells.- Metabolic: TNF-a strongly inhibits lipoprotein lipase and adipocyte gene expression.Contents and storageUpon receipt, store the kit at 2°C to 8°C.Materials required but not supplied•Distilled or deionized water•Microtiter plate reader with software capable of measurement at or near 450 nm•Plate washer–automated or manual (squirt bottle, manifolddispenser, or equivalent)•Calibrated adjustable precision pipettes and glass or plastic tubes for diluting solutions Before you beginIMPORTANT! Reagents are lot-specific. Do not mix or interchange different reagent lots from various kit lots.•Review the Procedural guidelines and Plate washing directions in the ELISA Technical Guide available at .•Allow reagents to reach room temperature before use. Mix toredissolve any precipitated salts.Prepare 1X Wash Buffer1.Dilute 16 mL of Wash Buffer Concentrate (25X) with 384 mL ofdeionized or distilled water. Label as 1X Wash Buffer.2.Store the concentrate and 1X Wash Buffer in the refrigerator. Usethe diluted buffer within 25 days.Sample preparation guidelines•Refer to the ELISA Technical Guide at for detailed sample preparation procedures.•Collect samples in pyrogen/endotoxin-free tubes.•Freeze samples after collection if samples will not be tested immediately. Avoid multiple freeze-thaw cycles of frozen samples. Thaw completely and mix well (do not vortex) prior to analysis.•Avoid the use of hemolyzed or lipemic sera. If large amounts of particulate matter are present in the sample, centrifuge or filter sample prior to analysis.Pre-dilute samplesSample concentrations should be within the range of the standard curve. Because conditions may vary, each investigator should determine the optimal dilution for each application.Perform sample dilutions with Standard Diluent Buffer (serum/plasma) or with the corresponding cell culture medium (cell culture supernatant). Dilute standardsNote: Use glass or plastic tubes for diluting standards.Note: This assay has been calibrated against the International Standard preparation (87/650) for Hu TNF-a (NIBSC, Hertforshire, UK, EN6 3QG). One microgram equals 40,000 International Units.1.Reconstitute Hu TNF-a Standard to 2000 pg/mL with Standard Dilution Buffer. Refer to the standard vial label for instructions. Swirl or mixgently and allow the contents to sit for 10 minutes to ensure complete reconstitution. Label as 2000 pg/mL human TNF-a. Use the standard within 1 hour of reconstitution.2.Add 300 µL Reconstituted Standard to one tube containing 300 µL Standard Diluent Buffer and mix. Label as 1000 pg/mL human TNF-a.3.Add 300 µL Standard Diluent Buffer to each of 7 tubes labeled as follows: 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, and 0 pg/mL human TNF-a.4.Make serial dilutions of the standard as shown in the following dilution diagram. Mix thoroughly between steps.5.Discard all remaining reconstituted and diluted standards after completing assay. Return the Standard Diluent Buffer to the refrigerator.DiluentVolumeStd5Std4Std3Std2Std1Std6Std7Std0300 μL250 pg/mL1000 pg/mL500 pg/mL15.6 pg/mL31.2 pg/mL62.5 pg/mL125 pg/mL2000 pg/mL300 μL300 μL300 μL300 μL300 μL300 μL300 μL300 μL0 pg/mLPrepare 1X Streptavidin‑HRP solutionNote: Prepare 1X Streptavidin-HRP within 15 minutes of usage.The Streptavidin-HRP (100X) is in 50% glycerol, which is viscous. To ensure accurate dilution:1.For each 8-well strip used in the assay, pipet 10 µL Streptavidin-HRP (100X) solution, wipe the pipette tip with clean absorbent paper toremove any excess solution, and dispense the solution into a tube containing 1 mL of Streptavidin-HRP Diluent. Mix thoroughly.2.Return the unused Streptavidin-HRP (100X) solution to the refrigerator.Perform ELISA (Total assay time: 4 hours)IMPORTANT! Perform a standard curve with each assay.•Allow all components to reach room temperature before use. Mix all liquid reagents prior to use.•Determine the number of 8-well strips required for the assay. Insert the strips in the frames for use. Re-bag any unused strips and frames, andstore at 2°C to 8°C for future use.a.Add 50 µL of Incubation Buffer to wells for serum or plasma samples, standards, or controls; or 50 µLof Standard Diluent Buffer to the wells for cell culture samples. Leave the wells for chromogen blanksempty.b.Add 100 µL of standards, controls, or samples (see “Pre-dilute samples” on page 2) to the appropriatewells. Leave the wells for chromogen blanks empty.c.Tap the side of the plate to mix. Cover the plate with a plate cover and incubate for 2 hours at roomtemperature.d.Thoroughly aspirate the solution and wash wells 4 times with 1X Wash Buffer.1Bind antigenCulture media +Standard DiluentBufferStandards/Serum/Plasma/Controls +Incubation Buffera.Add 100 µL Hu TNF-a Biotin Conjugate solution into each well except the chromogen blanks.2Add Biotin ConjugateAdd Streptavidin‑HRPAdd Stabilized ChromogenAdd Stop Solution1.Read the absorbance at 450 nm. Read the plate within 2 hours after adding the Stop Solution.e curve-fitting software to generate the standard curve. A four parameter algorithm provides the best standard curve fit. Optimally, thebackground absorbance may be subtracted from all data points, including standards, unknowns and controls, prior to plotting.3.Read the concentrations for unknown samples and controls from the standard curve. Multiply value(s) obtained for sample(s) by theappropriate factor to correct for the sample dilution.Note: Dilute samples producing signals greater than the upper limit of the standard curve in Standard Diluent Buffer (serum/plasma) or with the corresponding cell culture medium (cell culture supernatant) and reanalyze. Multiply the concentration by the appropriate dilution factor. Performance characteristicsStandard curve exampleThe following data were obtained for the various standards over therange of 0−1000 pg/mL human TNF-a.Inter-assay precisionSamples were assayed 18 times in multiple assays to determineprecision between assays.Intra-assay precisionSamples of known human TNF-a concentration were assayed inreplicates of 16 to determine precision within an assay.Expected valuesHuman PBMCs or whole blood were stimulated from 4 to 72 hours with lipopolysaccharide (LPS), phytohaemagglutinin (PHA), or ionomycin and phorbol myristate acetate (PMA) then evaluated for the presence of human TNF-a in this assay. Whole blood samples were pre-diluted 10-fold for the assay.Linearity of dilutionHuman serum containing 806 pg/mL of measured human TNF-a was serially diluted in Standard Diluent Buffer over the range of the assay. Linear regression analysis of samples versus the expected concentration yielded a correlation coefficient of 0.99.RecoveryThe average recovery of Human TNF-a ELISA Kit added to a variety of samples is listed in the following table.SensitivityThe analytical sensitivity of ths assay is 1.7 pg/mL human TNF-a. This was determined by adding two standard deviations to the mean O.D. obtained when the zero standard was assayed 20 times. SpecificityBuffered solutions of The following panel of substances were assayed at 50 ng/mL and were found to have no cross-reactivity: human IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IFN-a, IFN-b, IFN-g, GM-CSF, OSM,MIP-1a, MIP-1b, LIF, MCP-1, G-CSF, TGF-b, RANTES; swine TNF-a; rat TNF-a; mouse TNF-a.Limited product warrantyLife Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant their products as set forth in the Life Technologies' General Terms and Conditions of Sale at /us/en/home/global/terms-and-conditions.html. If you have any questions, please contact Life Technologies at /support.Product label explanation of symbols and warningsManufacturer's address: Bender MedSystems GmbH | Campus Vienna Biocenter 2 | 1030 Vienna, AustriaThe information in this guide is subject to change without notice.DISCLAIMERTO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. AND/OR ITS AFFILIATE(S) WILL NOT BE LIABLE FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE, OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING YOUR USE OF IT.Important Licensing Information: These products may be covered by one or more Limited Use Label Licenses. By use of these products, you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.©2019 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified./support | /askaquestion。
TNF-a说明书
人(human)肿瘤坏死因子a(TNF-a)说明书本试剂盒仅供研究使用标本：血清或者血浆一、试剂组成精密度微孔板96孔 (Microtitration Strips) 1块 2～8℃干燥保存酶标偶合液 (Conjugate ) 1瓶 12.0毫升 2～8℃冷藏保存标准品 (Standard) 5瓶各1.0毫升 2～8℃冷藏保存呈色剂A (Substrate A) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存呈色剂B (Substrate B) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存终止液 (Stopping Solution) 1瓶 6.0毫升室温保存20倍浓缩洗涤液 (Rinsing Buffer x 20) 1瓶 60.0毫升 2～8℃冷藏保存5倍浓缩样品稀释液 (Diluent x 5) 1瓶 15.0ml 2～8℃冷藏保存英文说明书，中文说明书各一份室温保存二、注意事项1. 此试剂为体外检测试剂，效期内使用，试剂应视为传染物，不同总批号的试剂不能混用。
2．使用前应将盒内各试剂取出。
室温放置至少30分钟，3．浓缩洗涤液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟。
4．浓缩样品稀释液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟5．若24小时内进行实验，标本可存放于2～8℃。
不需及时实验，标本-20℃保存，避免反复冻融。
6．在反复清洗微孔板，并扣干微孔中的残余液体，否则将降低精确度，造成吸光度偏离的假像。
7．加样完毕后，应注意轻微摇动微孔反应条，以便使孔中的液体充分混匀。
8．试剂盒保存于2～8℃，请勿冷冻，有效期请见盒内标示。
三、实验前准备1．使用前应将盒内各试剂取出，室温放置至少30分钟。
2．准备各种实验仪器及材料，如微量移液器，吸头，医用蒸馏水等3．浓缩洗液与医用蒸馏水1︰19倍稀释后成为应用洗涤液4．浓缩样品稀释液与医用蒸馏水1︰4倍稀释成应用样品稀释液5．用应用样品稀释液来稀释样品，按照1：100的体积比来稀释样品如10μl的样品加入到1ml的应用样品稀释液中，充分混匀待用。
TNF-——精选推荐
TNF-T N F 根据来源和结构不同分为T N F- a 、T N F -?，其中T N F-a 与⾻质疏松关系密切。
T N F 主要由单核巨噬细胞产⽣，另外，活化的T 细胞、⾃然杀伤细胞、肥⼤细胞、软⾻细胞也能分泌这种因⼦。
单核巨噬细胞合成的TN F 是⼀个25 ku 左右的⾮糖化跨膜蛋⽩，有两种不同的受体(P55 ，P75 ) ，其分⼦量分别为55 ku 和75 ku 。
T NF 与受体结合后，信号传⼈细胞内，通过N F -xB 或活化蛋⽩(A P )．1 转录因⼦来实现其功能。
⼈的TN F ．a 基因位于第 6 对染⾊体上。
1975年E.A. Carswell等⼈发现接种卡介苗的⼩⿏注射细菌脂多糖后，⾎清中出现⼀种能使多种肿瘤发⽣出⾎性坏死的物质，将其命名为肿瘤坏死因⼦（tumor necrosis factor，TNF)。
⼋⼗年代⼈们发现其在消耗症中起了重要作⽤，⼜称恶液质素。
TNF主要由活化的巨噬细胞，NK细胞及T淋巴细胞产⽣。
1985年Shalaby把巨噬细胞产⽣的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产⽣的淋巴毒素（lymphotoxin，LT)命名为TNF-β。
虽然TNF-α与TNF-β仅有约30%的同源性，但它们却拥有共同的受体。
TNFα的⽣物学活性占TNF总活性的70 %～95 %，因此⽬前常说的TNF多指TNF-α。
1984年TNF基因的克隆开辟了临床试验的时代，是第⼀个⽤于肿瘤⽣物疗法的细胞因⼦，但因其缺少靶向性且有严重的副作⽤，⽬前仅⽤于局部治疗。
⼈类TNF-α基因于1985年成功克隆，定位于6p21.4，长约3.6 kbp，有4个外显⼦和3个内含⼦，与主要组织相容性复合体（MHC）基因紧密连锁位于HLA-B 和 HLA-C2 位点之间的 MHC3 类基因区内，由TNFA和TNFB组成，分别编码TNFα和TNFβ。
位于启动⼦区238位和308位存在单核苷酸多态性，被认为可调节TNF 的转录⽔平，与慢性⼄肝、⾃⾝免疫性疾病、胰岛素抵抗、肿瘤等多种疾病的易感性相关。
肿瘤坏死因子TNFα
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
人巨噬细胞炎性蛋白2(MIP-2)ELISA分析检测试剂盒使用说明书
人巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）ELISA分析检测试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中转化生长因子（MIP-2）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）水平。
用纯化的转化生长因子（MIP-2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入转化生长因子（MIP-2），再与HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的转化生长因子（MIP-2）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人巨噬细胞炎性蛋白2（MIP-2）浓度。
试剂盒内容及其配制：试剂盒成份96孔配置48孔配置96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）塑料膜板盖1块半块标准品：100ng/ml 1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）标准品稀释缓冲液1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）生物素标记的抗OT抗体1瓶（8.0ml）1瓶（4.0ml）亲和链酶素-HRP 1瓶（12ml）1瓶（5ml）洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：45μmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存自备材料：1. 蒸馏水。
人肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析(ELISA)
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的羊抗人抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
四正柏生物 人类TNF-α ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ......................................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................................. - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................................. - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................................. - 5 -其他实验材料 ......................................................................................................................................................... - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................................. - 5 -样本收集处理及保存方法 ..................................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................................. - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................................. - 7 -操作流程图 ............................................................................................................................................................. - 8 -操作要点提示 ......................................................................................................................................................... - 8 -结果判断 ................................................................................................................................................................. - 9 -结果重复性 ........................................................................................................................................................... - 10 -灵敏度 ................................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ................................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ............................................................................................................................................................... - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
注射用重组人白介素-2
剂开始，逐渐增大剂量或遵从医嘱。使用本品低剂量、长疗程可降低毒性，并且可维持抗肿瘤活性。 【孕妇及哺乳期妇女用药】
孕妇慎用。 【儿童用药】
尚不明确。 【老年用药】
尚不明确。
【药物相互作用】 尚不明确。
（二）抗结核治疗： 辅助用于治疗由耐药结核菌株引起的难治性肺结核：在结核病治疗的强化期，与抗结核药联合使
用，其用法用量为：每次 20 万国际单位（IU），皮下注射，每日 1 次，第 1、3 月分别连续使用 30 日。 【不良反应】
各种不良反应中最常见的是发热、畏寒、疲劳，且与用药剂量有关。一般是一过性发热（38℃左 右），亦可有寒战高热，停药后 3~4 小时可自行恢复正常。个别患者可出现恶心、呕吐、类感冒症状。 皮下注射者局部可出现轻度红肿、硬结、疼痛，所有副反应停药后均可自行恢复。使用较大剂量时， 本品可能会引起毛细血管渗漏综合症，表现为低血压、末梢水肿、暂时性肾功能不全等。使用本品应 严格掌握安全剂量，出现上述反应可对症治疗。 【禁忌】
1. 对白介素-2 或本制剂其它成分有过敏史者。 2. 高热、严重心脏病、低血压者，严重心肾功能不全者，肺功能异常或进行过器官移植者。 3. 重组人白介素-2 既往用药史中出现过与之相关的毒性反应：
(1) 持续性室性心动过速； (2) 未控制的心率失常； (3) 胸痛并伴有心电图改变、心绞痛或心肌梗塞； (4) 心压塞； (5) 肾功能衰竭需透析＞72 小时； (6) 昏迷或中毒性精神病＞48 小时； (7) 顽固性或难治性癫痫； (8) 肠局部缺血或穿孔； (9) 消化道出血需外科手术。
核准日期：××××年××月××日 修改日期：××××年××月××日
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[实验内容]
免疫标记技术
免疫标记技术
原理
免疫标记技术：即用酶、同位素荧光、发
光物质等标记技术代替传统的肉眼可见反应， 其特异性、敏感性均增加，且可以定性、定 量甚至定位；缺点是需特殊精密检测仪。
免疫酶标技术：用酶标记的已知抗原（或
抗体）来检测未知的抗体（或抗原）的一种 免疫学标记技术。它同时利用了酶的高效催 化效能及Ag-Ab反应的高度特异性；据底物 被酶分解后显色的深浅可反映待测样品中Ag、 Ab的含量；故可以定性、定量甚定位。
操作步骤
1.使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生 大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生 加样上的误差。 2.根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的 板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个 样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做 复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于 反应孔内。
3. 加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加 入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的 生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混 匀，37℃温育1小时。 4 . 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操 作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一 次。
5. 每孔加入60ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀， 37℃温育30分钟。 6. 甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去 洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。 7. 每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温 育10分钟。避免光照。 8. 取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后 应立即测定结果。
TMB（四甲基联苯胺）
检测仪器：酶标仪
ELISA双抗体夹心法测定原理
酶标板显色结果
酶标板显色结果
微 量 加 样 器 、 板
实 验 材 料 ——
酶标仪
原理与方法
间接法 间接法
双抗体夹心法 双抗体夹心法 Ab Ab 多价大分子抗原
抗原竞争法 抗原竞争法 Ab Ag 抗原、半抗原、抗体
包被物 酶标物 待测物
Ag Ab2(抗抗体) Ab1(一抗)
间接法测定示意图
间接法测定抗体示意图
双抗体夹心法测抗原示意图
竞争法测抗原示意图
双抗体夹心法测定人TNF实验
流程
抗体包被（4℃过夜） 洗涤3次 加待测血清及对照液，生物素标记抗体（ 37℃孵育 600min） 洗涤3次 加亲和链霉素-HRP（37℃孵育30min） 洗涤3次 加底物显色（37℃孵育15min）, 终止酶反应， 肉眼观察实验结果
9. 在450nm波长处测-α试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附 实验（ELISA）.已知TNF-α浓度的标准品、未 知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。 先将TNF-α和生物素标记的抗体同时温育。洗 涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育 和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入 底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。 颜色的深浅和样品中TNF-α的浓度呈比例关系。
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)
定义：
是固相吸附技术与免疫酶技术的结合，具有特 异性高、敏感性强、稳定好、操作简便等优点，是 当时应用最广的一类酶免疫测定法。其中固相免疫 技术即将抗原或抗体用物理方法连接在顾相上形成 免疫吸附剂。 常用的固相吸附剂：聚苯乙烯、NC膜 酶： HRP（辣根过氧化物酶）、AKP（碱性磷酸酶） 底物：OPD（邻苯二胺）、 DAB（二胺基联苯胺）、
试剂盒内容
96/48人份酶标板 塑料膜板盖 标准品：1600pg/ml 空白对照 标准品稀释缓冲液 生物素标记的抗TNF-α抗体 亲和链酶素-HRP 洗涤缓冲液 底物A底物B 终止液 标本稀释液
建议使用的实验方案
标准品浓度（pg/ml） A16001600 B800 800 C400 400 D200 200 E100 100 F50 50 G0 0 H样品样品
实验报告
双抗体夹心法测定人肿瘤坏死 因子-α(TNF-α) 实验原理、结果、 结果分析
试剂盒性能
1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标
准品。稀释度的线性。样品线性回归与 预期浓度相关系数R值为0.990。 2. 特异性：不与其它细胞因子反应。 3. 重复性：板内、板间变异系数均小于 10%。
结果判断与分析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各 孔的OD值 2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的 TNF-α标准品浓度为横坐标（X），做得相应 的曲线，样品的TNF-α含量可根据其OD值由 标准曲线换算出相应的浓度。 3、检测值范围：0-1600pg/ml 4、敏感度： 1.0 pg/ml