小鼠骨骼肌细胞核DNA降解与死亡时间的关系
DNA降解与腐败尸体死亡时间的相关性
DNA降解与腐败尸体死亡时间的相关性罗光华;陈玉川;成建定;王江峰;高翠莲【摘要】目的探讨骨髓细胞核DNA含量变化与腐败尸体死亡时间的关系.方法应用DNA高度特异性染色方法Feulgen改良法结合计算机图像分析技术对死后不同时间(0～14d)胸骨骨髓细胞核DNA含量变化进行分析.结果胸骨骨髓细胞核DNA含量随死亡时间延长呈缓慢而规律下降,直至死后两周仍未完全降解.结论死后DNA降解速率与死亡时间呈线性关系,测定死后骨髓细胞核DNA含量可望成为腐败尸体死亡时间推断的新方法.【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2006(022)001【总页数】3页(P7-9)【关键词】死亡时间推断;DNA含量;腐败尸体;胸骨骨髓【作者】罗光华;陈玉川;成建定;王江峰;高翠莲【作者单位】广东司法警官职业学院司法鉴定系,广东,广州,510520;广东警官学院,广东,广州,510232;中山大学中山医学院法医病理教研室,广东,广州,510089;中山大学中山医学院法医病理教研室,广东,广州,510089;广东警官学院,广东,广州,510232【正文语种】中文【中图分类】DF795.4推断死亡时间(estimation of the time since death)可为刑事案件的侦察工作提供线索，缩小侦察范围，对确定凶犯和排除嫌疑人等有着非常重要的意义。
因而一直是法医病理学研究的重点和难点，受到国内外学者的广泛关注。
目前国内外有关死亡时间的研究多集中于早期死亡时间推断[1-3]，对于腐败尸体死亡时间推断还缺乏一种既简单、精确而又行之有效地方法，有关的研究也见之甚少。
本试验着眼于腐败尸体死亡时间推断这一难题，选择法医学检案中最容易获得的检材—胸骨标本作为研究对象，应用DNA高度特异性染色方法—改良的Feulgen法[4]，结合计算机图像分析技术，对人死后胸骨骨髓细胞核DNA含量变化与死亡时间的关系进行研究，以探求腐败尸体死亡时间推断的新方法。
单细胞凝胶电泳分析死后小鼠骨骼肌细胞核DNA降解
单细胞凝胶电泳分析死后小鼠骨骼肌细胞核DNA降解郑吉龙;张晓东;牛青山;李晓娜;章学保【期刊名称】《中国法医学杂志》【年(卷),期】2006(021)003【摘要】目的研究小鼠死后骨骼肌细胞核DNA降解与死亡时间的关系.方法应用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术结合荧光显微镜和专业的计算机图像分析技术,测定111只小鼠在死后72h内不同时间点骨骼肌细胞核DNA电泳形状的8项参数值,所得数据进行统计学分析.结果在个体死亡72h内,"彗星"的尾DNA含量比例、尾长、尾矩、Olive矩、尾面积数值随时间的延长而增大;而"彗星"的头半径,头DNA 含量比例和头面积数值则随时间的延长而减小.经对每个参数的测量值进行多项式运算,获得DNA降解趋势的二项式回归方程(P＜0.001)和多元回归方程(P＜0.0001),且均具有极显著性意义.结论在死后一定时间内,小鼠骨骼肌组织核DNA 降解随死后经过时间的变化而呈一定规律性变化,DNA降解与死亡时间之间呈线性相关.【总页数】4页(P138-141)【作者】郑吉龙;张晓东;牛青山;李晓娜;章学保【作者单位】中国刑警学院法医学系,辽宁,沈阳,110035;中国刑警学院法医学系,辽宁,沈阳,110035;中国刑警学院法医学系,辽宁,沈阳,110035;周口市公安局,河南,周口,466000;中国医科大学基础医学院,辽宁,沈阳,110001【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.小鼠死后骨骼肌、心、肝、肾、脑细胞核中DNA的变化规律 [J], 郑吉龙;李晓娜;张晓东;牛青山2.大鼠死后骨骼肌细胞核DNA降解的彗星电泳检测 [J], 高翠莲;陈玉川;韦拔雄;靳俊峰;肖俊辉3.单细胞凝胶电泳检测大鼠死后肝细胞核DNA降解 [J], 何远;闫平;胡家伟;孟晓萍4.单细胞凝胶电泳技术研究兔牙髓细胞核DNA降解的时间效应 [J], 李晓娜;郑吉龙5.应用单细胞凝胶电泳检测大鼠死后脾细胞核DNA降解与死亡时间的关系 [J], 何远;闫平;孟晓萍;包容因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠和鸡骨骼肌冷冻组织中的dna的提取实验
小鼠和鸡骨骼肌冷冻组织中的dna的提取实验一、实验目的掌握从动物组织中分离DNA的基本原理和方法。
二、基本原理1、DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白，能溶解在纯水或1mol/L的NaC1溶液中，而不溶于有机溶剂。
2、在0.1mol/LNaC1溶液中，DNA核蛋白的溶解度最小，仅为在纯水中的1%左右，而RNA核蛋白的溶解度最大；但在1mol/LNaC1溶液中，DNA核蛋白的溶解度却增大，至少是在纯水中的两倍，而RNA核蛋白的溶解度却明显下降。
3、分离得到DNA核蛋白后，应进一步十二烷基硫酸钠使蛋白质变性，用含有异戊醇的氯仿除去变性的蛋白质，以得到游离的DNA。
4、DNA分子大而长，其水溶液呈粘稠状，可用玻璃棒搅缠起来。
为了获得大的DNA分子，在试验中应尽量避免剧烈震荡、用力过猛。
三.实验器材与试剂1、0.15mo1/LNaC1-0.015mo1/L柠檬酸钠溶液（PH7.0）：称取8.77g 氯化钠、4.41g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解，调节pH值至7.0稀释至100ml。
2、0.15mo1/LNaC1-0.1mol/LEDTA-Na2溶液（PH8.0）：称取8.77g 氯化钠、37.2g EDTA-Na2溶于800ml蒸馏水中，以0.1mol/L氢氧化钠调至PH8.0，最后定容至1000ml。
3、5mol/L氯化钠：称取292.2gNaC1溶于800ml蒸馏水中，最后定容至1000ml。
4、5%SDS溶液：称取5gSDS，溶至100ml的45%乙醇中。
5、氯仿一异戊醇溶液：按氯仿异戊醇=241（V/V）配制。
6、95%乙醇，75%乙醇。
7、组织捣碎机（或玻璃匀浆器），移液管，离心机，锥形瓶，天平，容量瓶，剪刀。
四、实验步骤1、本实验以小鼠和鸡骨骼肌为材料。
实验前动物应饥饿12h以上。
2、称取肝脏4g，放在培养皿中，用剪刀剪碎，放入匀浆器研磨，加入6m1，氯化钠一柠檬酸钠缓冲液，装在10ml离心管中。
将匀浆物在4000r/min下离心10min。
大鼠脑、骨髓细胞核DNA降解推断死后间隔时间的研究
大鼠脑、骨髓细胞核DNA降解推断死后间隔时间的研究胡俊;赵小红;易少华;张益鹄【期刊名称】《中国法医学杂志》【年(卷),期】2008(023)005【摘要】目的检测大鼠死后不同温度下脑、骨髓细胞核DNA降解规律,寻找推断早期死亡间隔时间(PMI)的新参数.方法10℃和20℃下,大鼠死后0-40h内,每隔4h取材脑组织和骨髓,单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA降解程度,线性回归分析比较彗星参数HeadDNA%、尾长(TL)、Olive尾矩(TM)与PMI的关系.结果大鼠死后早期脑细胞、骨髓细胞核HeadDNA%随着PMI逐渐下降的程度不同,20℃脑细胞核HeadDNA%降解速率较快.与骨髓细胞相比,脑细胞核HeadDNA%与PMI线性关系较好.与TL、TM相比,HeadDNA%与PMI的线性关系较好.结论脑组织是利用SCGE检测DNA降解推断PMI的合适检材.HeadDNA%较TL、TM推断PMI的价值更高.【总页数】4页(P309-312)【作者】胡俊;赵小红;易少华;张益鹄【作者单位】华中科技大学同济医学院法医学系,湖北,武汉,430030;华中科技大学同济医学院法医学系,湖北,武汉,430030;华中科技大学同济医学院法医学系,湖北,武汉,430030;华中科技大学同济医学院法医学系,湖北,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】D9【相关文献】1.离体人胸骨骨髓DNA降解与腐败尸体死亡时间推断的初步研究 [J], 陈玉川;成建定2.死后小鼠脑组织细胞核DNA变化规律的研究 [J], 郑吉龙3.彗星试验检测死后DNA降解推断PMI的参数选择研究 [J], 易少华;赵小红;刘良4.大鼠死后肌肉组织电阻抗幅值和相位角变化推断死后间隔时间的研究 [J], 赵小红;张益鹄;杨玉星5.单细胞凝胶电泳分析死后小鼠骨骼肌细胞核DNA降解 [J], 郑吉龙;张晓东;牛青山;李晓娜;章学保因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠骨骼肌细胞DNA含量变化与死亡时间关系的研究
ｍｏ ｔｎ ｓｐ ｒｏ ｍｅ Ｍｅｈ ｔＢｙ ｔ ｅｈｓｏ ｂ ｍｉａ ｎ ｍａ ｅａｍ１ｓｓ ＲｅｕｔＴｈ ｏｏ ｎ ｈ ｒａ ｒｅ ａｗａ ｅｆｒ ｄ ｔ ｍ ｈ ｉｔｃ ｅ ｃ １ ｄ ｉ ｇ ｒ ｙ ｉ ａ ｓｌ ｅｏ ｌｒａ ｄ ｔ ｅａ ｅ ｓ ｏ ｈ ｕ ｌｉｓａｎ ｄ ｗｉ ｈ ｅ ｌｅ ｔｉｉｇ ｍｅｈ ｄ ｂ ｃｍｅ ｆｉｔｒａ ｄ ｓ １Ｕ ｒｇ ａ ｕ ｌ ｔ１ ｐ ｆｔ ｅｎ ｃｅ ｔｉｅ ｔ ｔ ｅ Ｆ ｕｇ ｎ ｓａｎ ｎ ｔ ｏ ｅａ ａｎ ｅ ｎ Ⅱａ ｅ ｒ ｄ ａ ｙ ａ ２ ｈ ｍ． ｈ ｌ Ｔｈ ｒ ｓ ｉｅ ｒｒｌｔ ｎ ｈｐ ｂ ｔ ｅ ｈ ｅ ｒｄ ｔ ｎ ｒ ｔ ｈ ｕ ｌ ｒ ＤＮＡ ｎ ｈ ｅ ｇ ｈ ｏ ｈ ｅｅｗａ ａ １ ａ ｅａｉ ｓ ｉ ｅｗｅ ｎ ｔｅ ｄ ｇ ａ ｉ ａｅ ｏ ｔ ｅ ｎ ｃ ａ ｎ ｏ ａ ｏ ｆ ｅ ａ ｄ ｔ ｅ ｌｎ ｔ ｆｔ ｅ
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中国法医学杂志 ２ ０ ０２年第 ｌ 卷第 １ ７ 期
【 文章编号】１０ ５２ ２０ ）０ ００ ０ ４ ０１ ７８（０２ ｌ ０１ ０
大 鼠 骨骼 肌 细胞 ＤＮ 含 量 变 化 与 死 亡 时 间关 系的研 究 Ａ
王慧君 郑清平 饶 广勋。 黄光照
死 亡 时 问 的 推 断 （ｓｉ ｔ ｎ ｏ ｈ ｉ ｉｃ ｅｔ ｉ ｆｔｅ ｔ ｓ ｅ ｍａ ｏ ｍｅ ｎ
小鼠骨骼肌挫伤愈合过程中神经肌肉接头降解及再生与损伤时间的关系
小鼠骨骼肌挫伤愈合过程中神经肌肉接头降解及再生与损伤时间的关系孙英富;张孟周;王帅;董雯雯;陈京伟;郭相伸;温书恒;赵锐;官大威【摘要】目的研究小鼠骨骼肌挫伤愈合过程中神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)降解及再生的形态学变化,探讨NMJ降解及再生与损伤时间的相关性.方法将50只健康成年雄性小鼠随机分为10组,其中9组为实验组,1组为对照组.应用免疫荧光染色技术,以高分子量神经丝蛋白(neurofilament protein-H,NF-H)标记神经丝,突触囊泡蛋白(synaptophysin,Syn)标记突触前膜,乙酰胆碱受体(acetylcholine re-ceptor,AChR)标记突触后膜,检测小鼠骨骼肌挫伤后不同时间点NMJ再生的形态学变化.结果骨骼肌挫伤后挫伤交界区NMJ突触前膜及神经丝开始降解,3 d左右降解完全,之后逐渐再生,至21 d左右再生大致完成,基本达到对照组水平.突触前膜和后膜数量之比呈现先下降后上升、最终与对照组水平相当的趋势.结论小鼠骨骼肌挫伤修复过程中,挫伤交界区NMJ的形态学变化与损伤时间具有相关性,有望成为法医学骨骼肌损伤时间推断的生物学指标之一.【期刊名称】《法医学杂志》【年(卷),期】2019(035)003【总页数】5页(P280-284)【关键词】法医病理学;骨骼肌;挫伤;神经肌肉接头;损伤时间推断;小鼠【作者】孙英富;张孟周;王帅;董雯雯;陈京伟;郭相伸;温书恒;赵锐;官大威【作者单位】中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122;中国医科大学法医学院法医司法鉴定中心,辽宁沈阳 110122;智慧检务创新研究院智慧司法鉴定联合实验室,辽宁沈阳 110122【正文语种】中文【中图分类】DF795.1损伤时间推断一直是法医学实践中的重点和难点之一。
组织细胞DNA含量与死亡时间相关性研究进展
组织细胞ＤＮＡ含量与死亡时间相关性研究进展摘要：国内外许多学者的研究已充分表明，机体死亡后，各器官组织细胞核DNA含量随死亡时间延长而下降，测定DNA含量将是精确、客观推断死亡时间的新方法。
综述了组织细胞DNA含量与死亡时间相关性研究的进展。
关键词：组织细胞；DNA含量；死亡时间推测死亡时间一直是法医学研究的重点内容。
目前对于早期死亡时间(PMI)，可以根据尸体现象和简单仪器进行大体判断，但这种判断存在着较大的误差。
如果能找到一个灵敏的指标用以判断死亡时间，得出的结论会更准确而且具有说服力。
许多学者为此分别对血液、玻璃体液内电解质成分变化、死后DNA含量改变等做了大量研究，并且找到了上述物质随死后时间延长而发生变化的规律性，为死亡时间的推断积累了丰富的资料。
其中，组织细胞DNA含量与死亡时间相关性的研究越来越引起了人们的重视。
机体死亡后，由于DNA内切酶的不断激活，DNA含量会随死亡时间的延长而不断下降，而且在一定时间范围内其下降速度会呈现特有的规律性，掌握了这个规律性，无疑会对准确判断死亡时间带来莫大的方便。
随着单细胞凝胶电泳(SCGE)、显微分光光度计定量测定、共聚焦显微镜慧星图像摄取、计算机图像分析、流式细胞仪(FCM)等技术的日趋成熟和广泛应用，为准确测定死后不同时间DNA的不同含量值提供了条件，也使通过测定DNA含量来推断死亡时间成为可能。
近十余年来，国内外学者对此进行了广泛而深入的研究，并取得了一定的成果。
1998年，Henssge等[1]对小鼠死后白细胞DNA含量的变化进行了组织化学定量研究，他们用显微分光光度计定量测定小鼠死后不同时间白细胞DNA含量的变化情况，发现小鼠死后白细胞DNA含量随死亡时间的延长而不断下降，而且其下降的幅度呈现出一定的规律性，于是他们断定，测定DNA含量变化可以用来作为判断机体死亡时间的一个可靠指标。
随后，Johnson等[2]用SCGE检测小鼠死后心肌细胞核DNA的降解，得出了同样的结论。
法医学死者死亡时间的推断方法
死者死亡时间的方法法医学上死亡时间又叫死亡经历时间，是指从死者死亡发生到法医进行尸体检验时所经过的时间，又称死后经过时间，通常描述为死后多少天或多少小时。
推断死者的死亡时间，是法医尸体检验和命案现场勘查的任务之一，对于判明罪犯作案时间、确定侦查范围、甄别重点嫌疑人等都有重要作用。
推断死亡时间可以从多个方面进行推断，如尸体本身现象推断死亡时间、尸体胃肠道食物推断死亡时间、从死后化学变化推断死亡时间等。
一、从尸体本身现象判断死亡时间当人死亡之后，尸体本身会呈现出一定的现象，医学上将这些现象划分为早期尸体现象和晚期尸体现象。
不同时期尸体现象可以用来推定死者死亡时间，最近又增加了一个判断死亡时间的新方法，叫做眼球化学法，是由美国的内科医师约翰·科发现的，他视察到人在死亡之后，尸体内红细胞会不断有规律的破裂，红细胞内的钾离子会不断的有规律的进入眼玻璃体液，据此人们完全可以准确判断出死亡时间。
因为这种方法不受外界温度的影响，所以测得的死亡时间比较精确。
（一）根据早期尸体现象判断1.根据尸冷推断死亡时间一般来说，春秋季成年尸体，尸体温度在室内每小时下降0.83摄氏度。
水中尸体每小时可下降3--4摄氏度。
夏季烈日下的尸体、死前发生肌肉痉挛或者激烈搏斗的尸体，死后一段时间内，试问还能上升，即环境因素、衣着多少、尸体本身情况、死因都会影响判断。
以春秋季节为准，尸体颜面、手足等裸露部分有冷却感，为死后1～2小时或以上，着衣部分皮肤有冷却感，为死后4～5小时；死后最初10小时，尸体直肠温度每小时平均下降1℃；10小时后，每小时平均下降0.5～1℃；肥胖尸体在死亡后最初10小时，尸温每小时平均下降0.75℃，消瘦尸体每小时平均下降1℃。
夏季尸冷速率是春秋季的0.7倍，冬季是春秋季的1.4倍；暴露在冰雪天气的尸体，尸温在死后数小时即降至环境温度。
2.根据尸斑推定死亡时间3.根据尸僵判断死亡时间尸僵出现和缓解的时间、强度，与死者肌肉发育、年龄、死亡原因及其环境因素有关。
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【文章编号】1001-5728(2003)05-0273-03小鼠骨骼肌细胞核D NA降解与死亡时间的关系邓立彬 余纯应 杨庆恩(华中科技大学同济医学院法医物证教研室,湖北武汉430030)【摘要】目的 监测小鼠死后骨骼肌核内DNA降解的情况,探讨死后细胞核DNA降解的一般规律。
方法 建立小鼠死亡模型,在死后72h内,以12h的间隔取骨骼肌样本进行单细胞凝胶电泳,在荧光显微镜下测量彗星图像,并作统计学分析。
结果 机体死后,骨骼肌细胞在电泳图像上出现了明显的彗星形拖尾,L/W比值随死亡时间而逐渐增大,二者呈一定的线性关系。
结论 单细胞凝胶电泳技术可以应用于早期死亡时间推断。
【关键词】法医病理学;死亡时间;单细胞凝胶电泳;DNA降解A study of the relationship bet w een the postmortem interval and nuclear D NA degradation of muscle cellsin mice/DEN G Libin,YU Chunying,YAN G Qingen./Depart ment of Forensic B iology,Tongji Medi2 cal College,Huaz hong U niversity of Science and Technology,W uhan430030【Abstract】Objective To evaluate the regular degradation of nuclear DNA of muscle cells in mice after death.Method A mouse death model was established.Skeletal muscle was sampled at122hour2interval within72hours after death.After single2cell gel electrophoresis,the comet2length and comet2width were scaled under fluorescent microscope.R esults An evident comet tailing was observed in DNA of muscle cells after electrophoresis.The ratio of L/W increased with the extension of postmortem interval,which was correlated linearly with PM I from0to48h postmortem.Conclusion DNA degradation by single2cell gel electrophoresis may be used as a predictor of PM I.【K ey Words】Forensic pathology;Postmortem interval;Single2cell gel electrophoresis;DNA degra2 dation死亡时间推断一直是法医学界的难题。
各国学者应用紫外、荧光染色及Feulgen染色等方法研究死后细胞DNA的降解过程,发现细胞DNA含量随死亡时间而有规律地下降,直至消失,并认为掌握一定时段内DNA降解规律,对死亡时间推断有一定的价值[1～3]。
但上述实验均是通过测量死后细胞内DNA 含量变化,间接推测细胞核DNA降解过程,并不能完全反映死后DNA降解的规律。
本文作者应用单细胞凝胶电泳技术(single2cell gel electrophoresis,),直接监测死后DNA的降解成分变化,发现该技术可应用于早期死亡时间的推断,并对探讨死后细胞核DNA的降解机理有一定的作用。
1 材料和方法111 实验动物取健康的小鼠16只,雌雄不限,体重20g左右。
【作者简介】邓立彬(1977-),男,福建沙县人,在读硕士研究生,主要从事法医分子生物学研究。
适应性饲养3d,颈椎错位处死,立即取骨骼肌样本,作0h自身对照。
将尸体保存在18℃下,在72h内按12h的间隔取骨骼肌,进行单细胞凝胶电泳检测。
112 SCGE11211 单细胞悬液的制备 提取115g骨骼肌组织样品置于含有2ml1×PBS的5ml试管中,置于冰上,剪碎,加入终浓度0125%的胰蛋白酶;室温下30min,用孔径为160μm和100μm的两种筛子双重过滤,滤液即为单细胞悬液。
11212 制片(“三明治”法)[4] 在磨砂载玻片上,第一层铺100μl5%琼脂糖,第二层为25μl细胞悬液与75μl1%低熔点琼脂糖的混合液,第三层为100μl 015%低熔点琼脂糖;4℃下固化5min。
11213 细胞裂解 凝胶固化后,浸入含去污剂十二烷基肌氨酸的高盐溶液(0103mol/L氢氧化钠, 112mol/L氯化钠,011mol/L十二烷基肌氨酸), p H10～12,4℃下,至少1h。
11214 解旋、电泳 电泳前,将玻片浸没于电泳缓冲液中(0103mol/L倾氧化钠,2mmol/L乙二胺四乙372中国法医学杂志2003年第18卷第5期酸),p H10,20min ;采用潜水式电泳,条件为30V ,300mA ,25min 。
11215 中和、染色 用p H715缓冲液中和凝胶,用510μg/ml 的吖啶橙染色,在2d 内观察。
11216 镜检 在荧光显微镜下观察。
随机选取15个高倍视野,观察细胞及细胞正极侧的荧光(图1),图1.彗星图象模式Fig 1.The diagram of comet 2im age用目镜测微尺测量彗星的总长度(L )及最大宽度(W ),并计算长宽比值L/W 。
11217 统计分析 计算各时间组的L/W 比值的算术均数及标准差,应用SAS 软件对数据进行初步分析;死亡时间与彗星图像的关系应用相关分析,并建立的回归模型。
2 结 果211 死后D NA 的降解在死亡早期(死后6h ),骨骼肌细胞核DNA 就已发生了降解;并在电泳图像上出现了明显的彗星形拖尾(照片1)。
本次实验中,死后0h 、12h 及24h 骨骼肌检材中分别有6614%,9418%,9810%的细胞出现彗尾,死亡1d 后所有细胞均出现彗尾(表1)。
212 死亡时间与彗星图像死后0～72h ,骨骼肌细胞彗星图像长宽比(L/照片1.彗星图像(×400) A 为阴性对照;B 为死后6h ;C 为死后24hPhoto et 2im age (×400) A is negative control ;B is comet 2image of PMI 6h postm ortem ;C is comet 2image of PMI 24hpostm ortem表1.死后不同时间小鼠骨骼肌细胞彗星图像变化T able 1.Changes of the comet 2im age of muscle cells at mice at different postmortem intervalsPMI 细胞计数L/W 值分组细胞计数11～115～2～215～3～315～4～415～5～彗尾出现率%χs 0h 12843463072000006614%115270148312h 774835254100009418%32113030147624h 15034854582120009810%2177030153036h 89002332455110100%3130930143648h 85000509462230100%4102430151160h 1240002412673360100%410770145172h123310654032100%4114201464 3数据与前一组数据之间有显著性差异,P <0105W )的均数逐渐增大(表1,图1)。
各组间均数经方差分析,P <0105;差异有显著性;死后0～48h ,组间均数经t 检验分析,P 值均小于0101,各组间差异有显著性;死后48h 后,组间差异无统计学意义。
经相关分析,死后0～48h 的时间与彗星图像的相关系数为019993。
3 讨 论多方面的研究均证实:细胞死亡伴随着DNA 的图1.小鼠骨骼肌细胞不同死亡时间的L/W 比值Fig 1.L/W of muscle cells at mice at different postmortem interv als472降解,且降解的程度随死亡时间的延长呈增强趋势,推测该过程中有生物酶参与。
脱氧核糖核酸酶(De2 oxyribonucleases,DNase)在体内广泛分布,能够水解DNA链中磷酸二酯键,被认为是DNA降解时的限速酶。
实验证实内源性DNase在凋亡细胞的染色质DNA降解过程中起到了主要的作用。
Kataoka[5]等1995年发现细胞核DNA降解也可出现于非凋亡细胞。
一些学者推测在机体死后自溶过程中,细胞核DNA的降解也与内源性DNase有关,且随死亡时间的延长酶解产物逐渐增多,片段逐渐减小;而死后细胞DNA含量的减少仅是这一过程的间接反映,并不能完全代表死后DNA降解的实际情况。
SCGE是Ostling和Johanson于1984年建立的一种评估核DNA损伤的方法[6]。
该法通过观察凝胶中单个细胞核DNA电泳特征直接分析核DNA的降解程度,是目前遗传毒理学中检测DNA损伤的经典方法。
实验中将悬浮的单个细胞散布在固相低熔点琼脂糖中,在碱性条件下,用细胞裂解液破坏细胞的膜结构,并使DNA解螺旋,降解片段释放;在电场作用下,降解DNA片段向正极移动,染色后细胞核DNA 形成彗星样图像。
彗星尾部的总荧光强度代表了降解DNA的量;而彗星尾长度则与降解产生片段的大小有关。
通过测定DNA迁移部分的光密度和迁移距离可以推定DNA的损伤程度。
本文结果显示:在死后一定时段内,细胞核DNA降解是一个进行性过程,随死亡时间的延长彗尾逐渐加长。
说明酶解片段逐渐变小,彗头部光密度逐渐变小,证实酶解产物逐渐增多。
本研究的预实验结果提示该方法可以检测到死亡较早期(死后6h)的DNA损伤,出现明显的彗尾(照片1)。
但为了符合传统的长度指标对DNA降解作精确统计学评估的要求,采用12h的时间间隔对死后DNA降解趋势进行探讨。
分析肌肉细胞模型可见,在死后0～48h,细胞核DNA发生了明显的降解,降解程度与死亡时间紧密相关(相关系数为019993);而死后48～72h 该变化不显著,推测此时脱氧核糖核酸酶活性已经丧失。