N-phenylmaleimide as a New Ploymerizable Additive for Overcharge Protection of Lithium-ion Batte
微塑料／纳米塑料对维管植物的影响
１ ０００ ｎｍ。微塑料的外形多为圆柱形、圆形和圆盘状，颜色通
常为透明、白色和灰色，而且微塑料种类繁多，根据材质划分，主
要有聚乙烯（ＰＥ）、聚丙烯（ＰＰ）、聚苯乙烯（ＰＳ）、聚氯乙烯
每使用 ５ ｍＬ 的化妆品就会导致 ４ ５９４ ～ ９４ ５００ 个球类微塑料
对智利 ３１ 个接受不同年限污泥施用的农用土壤的调查研
究。 结果显示，随着污泥施用量的增加，土壤中微塑料的含
量也逐渐增加。 在施用了 ５ 次污泥后（总量为２００ ｔ ／ ｈｍ２ ），土
壤中微塑料的平均丰度达到了 ３ ５００ 个 ／ ｋｇ。
植物摄入并影响其生长发育［１８－２０］ 。 此外，ＭＰｓ ／ ＮＰｓ 由于比
子表面，以致减少了种子对水分和养分的吸收，进而影响种
子发芽［３３－３４］ 。 当蕨类植物（ Ｃｅｒａｔｏｐｔｅｒｉｓ ｐｔｅｒｉｄｏｉｄｅｓ） 暴露于聚
苯乙烯纳米塑料（ＰＳ－ＮＰｓ） 后，会破坏孢子从吸胀到萌发到
配子体的整个发育阶段，从而影响其繁殖过程［３４］ 。 吴佳妮
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安徽农业科学，Ｊ．Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ． ２０２３，５１（２０） ：１５－１８
微塑料 ／ 纳米塑料对维管植物的影响
杨满香
（ 重庆师范大学生命科学学院，重庆 ４０１３３１）
摘要 微塑料 ／ 纳米塑料（ｍｉｃｐｌａｓｔｉｃｓ ／ ｎａｎｏｐｌａｓｔｉｃｓ，ＭＰｓ ／ ＮＰｓ）广泛存在于环境中，被认为是一类对环境构成巨大威胁的新兴污染物。 通
境构成巨大威胁的新兴污染物［２９］ 。 基于微塑料来源广泛、
作者简介 杨满香（１９９７—） ，女，贵州遵义人，硕士研究生，研究方向：
新型植物生长调节剂——苯肽胺酸.pdf
2、苯肽胺酸研究项目四年总结 Four-year summary of the phthalanilic acid research project
本研究以辣椒、豇豆为供试植物，测定苯肽胺酸不同浓度处理对辣椒植株生长生
理、逆境生理及产量与品质的影响，明确其对作物的生物学效用，以初步揭示其作用
机理。主要研究结果总结如下：
（5）提高辣椒、豇豆产量。在20、30 mL/亩下，苯肽胺酸具有明显增产效应。 辣椒（37%），豇豆（17%）。
Increase the yield of pepper and cowpea. At 20 and 30 mL/mu, phthalanilic acid has a significant yield-increasing effect. Pepper (37%), cowpea (17%).
国外: International 苯肽胺酸可提高柱头活力，有利于作物授粉，不是生长素，但在生物学效应上与生长 素具有协同效应。 phthalanilic acid can improve stigma activity, facilitate crop pollination, not auxin, but has a synergistic effect with auxin in biological effects. 在苹果、酸樱桃、甜樱桃、李子等果树上使用苯肽胺酸，能够促进开花、提高果实品 质和产量，也有少量在玉米、苜蓿、油菜及向日葵上应用的相关研究报道：经研究表明 苯肽胺酸必须应用于水肥条件充足的作物 The use of phthalanilic acid in apples, sour cherries, sweet cherries, plums and other fruit trees can promote flowering, improve fruit quality and yield, and also have a small number of research reports on corn, alfalfa, rapeseed and sunflower: studies have shown that phthalanilic acid must be applied to crops with sufficient water and fertilizer conditions
苯环喹溴铵药理毒理研究进展
苯环喹溴铵药理毒理研究进展刘红1王宝辉1王宇1张俊毅1王祥艳1孙艾楠1程颜彬1赵李宏2（1白求恩医科大学制药厂，吉林长春130012；2吉林省成大方圆医药连锁有限公司，吉林长春130041）【摘要】变应性鼻炎和慢性阻塞性肺病是当前两种发病率高、发病人群广泛、病程缠绵且危害显著的呼吸系统疾病。
作为有针对性的新一代治疗药物，苯环喹溴铵是我国自主研发的具有自主知识产权的国家一类新药，具有广阔的应用前景。
【关键词】苯环喹溴铵；药理；毒理；研究进展Research progress of pharmacological effects and toxicological informationof bencycloquidium bromideLIU Hong1 WANG Bao-hui1WANG Y u1 ZHANG Jun-yi1 W ANG Xiang-yan1 SUN Ai-nan1CHENG Y an-bin1 ZHAO Li-hong2(1 Pharmaceutical Factory Norman Bethune University of Medical Science，Jilin Changchun 130012；2 Cheng DaFang Y uan Pharmaceutical Co,Ltd of Jilin Province，Jilin Changchun 130041)【Abtract】At present, allergic rhinitis and chronic obstructive pulmonary disease are the two kinds of respiratory diseases, with the features of high incidence、widespread population incidence、long course and remarkable harm. As a new generation of targeted therapeutic drug, bencycloquidium bromide is an independent intellectual property rights and national class of drug that would get broad application prospect. 【KeyWords】bencycloquidium bromide；pharmacological effects；toxicological information；research progress变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称为过敏性鼻炎，是特应性个体接触致敏源后导致的，包含IgE介导的炎症介质释放和多种免疫活性细胞因子、细胞因子参与的鼻黏膜慢性反应性疾病。
地黄叶斑病病原鉴定及室内药效检测
河南农业科学，2024，53（4）：92⁃101Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.04.010地黄叶斑病病原鉴定及室内药效检测李海骋1，王繁珍2，姜永成3，宋欣3，陈招荣1（1.天津农学院园艺园林学院，天津300384；2.天津农学院计算机与工程技术学院，天津300384；3.天津农学院工程技术学院，天津300384）摘要：为明确天津市蓟州区地黄叶斑病病原种类及生物学特性，筛选防治地黄叶斑病病原菌的有效农药，通过采集病叶、菌株分离、显微观察、离体回接以及ITS 、EF 1-α、Tub 多基因序列比对和进化树分析的方法，对地黄叶斑病致病菌进行分离纯化、形态学鉴定、致病性鉴定以及分子生物学鉴定，并对分离菌在3种培养基、4种碳氮源条件下的生物学特性进行研究，同时选取4种杀菌剂对其进行毒力测定。
结果表明，从天津市蓟州区地黄叶斑病发病叶片部位分离出的病原菌A1为木贼镰孢菌（Fusarium equiseti ）。
生物学特性研究表明，该菌最适培养基、氮源、碳源分别为Czapek 培养基、甘氨酸、蔗糖。
室内药效检测结果表明，45%咪鲜胺水乳剂对该病原菌的抑制效果最好，半效应质量浓度（EC 50）为63.69mg/L ，对病原菌菌丝生长的抑制率最高可达83.64%；75%百菌清可湿性粉剂的抑制效果最差，EC 50为355.06mg/L ，对病原菌菌丝生长的抑制率最高为64.63%。
综上，天津市蓟州区地黄叶斑病病原菌为木贼镰孢菌（F.equiseti ），45%咪鲜胺水乳剂对地黄叶斑病病原菌的防治效果最好。
关键词：地黄；叶斑病；木贼镰孢菌；生物学特性；药剂筛选中图分类号：S435.672文献标志码：A文章编号：1004-3268（2024）04-0092-10收稿日期：2023-07-17基金项目：河北省重点研发计划项目（22347402D ）作者简介：李海骋（2000-），男，河南西平人，在读本科生，研究方向：植物病害检测鉴定。
儿童急性髓系白血病的遗传基因异常及其意义
中国小儿血液与肿瘤杂志 ２０２１年 ６月第 ２６卷第 ３期 ＪＣｈｉｎａＰｅｄｉａｔｒＢｌｏｏｄＣａｎｃｅｒ，Ｊｕｎｅ２０２１，Ｖｏｌ２６，Ｎｏ．３
·１３１·
２ 异常基因在 ＭＲＤ监测中的作用 ２１ 融 合 基 因 ＲＵＮＸ１ＲＵＮＸ１Ｔ１／ｔ（８；２１）和 ＣＢＦＢＭＹＨ１１／ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）均可用 于 治 疗 后 的 ＭＲＤ监测 。 ［１，８１１］ 诱导或巩固结束后，ＲＴｑＰＣＲ 检测其转录产物 ｍＲＮＡ拷贝数（ＡＢＬ做内参），较初 诊时降低 ＞３个 ｌｏｇ者预后良好。究竟在诱导后还 是巩固后降低 ＞３个 ｌｏｇ较有预后意义，视不同方案 而定。如果诱导结束后降低不足 ３个 ｌｏｇ，在巩固期 间继续降低，直到治疗完全结束后 ＜初诊时的 ４个 ｌｏｇ者预后仍好，提示连续监测的重要性。但如果将 ＲＵＮＸ１ＲＵＮＸ１Ｔ１和 ＣＢＦＢＭＹＨ１１分开统计，可 能 有不同 的 结 果，因 此 需 后 续 更 多 的 研 究［１０］。关 于 ＫＭＴ２Ａ（ＭＬＬ）基 因 重 排，在 ＡＭＬ 只 有 ＭＬＬＴ３ ＫＭＴ２Ａ／ｔ（９；１１）有详细研究［４］，结果显示诱导缓解 后 ＲＴｑＰＣＲ ＜１０－３和后续监测仍 ＜１０－３复发率低。 ＢＣＲＡＢＬ融合基因在 ＡＭＬ发生率低，用于 ＭＲＤ监 测的意义尚未有足够的临床验证 。 ［１１］ 以上研究结 果提示在用融合基因检测 ＭＲＤ方面，连续监测的 重要性，治疗结束后仍低度阳性不影响预后。 ２２ 突变基因 不是所有与 ＡＭＬ相关的突变基因 都适用于 ＭＲＤ监 测 。 ［１，４５，１０１１］ 造 血 干 细 胞 基 因 突 变后，获得竞争优势导致克隆造血，但仍有多系分化 和成熟的造血功能不属于白血病细胞，只有在继发 其他突变后才出现分化阻滞和无限增殖，发展为白 血病。随年龄增长干细胞的突变率增加，因此克隆 造血主要见于老年人，儿童少见。较常见的克隆造 血突变基因是编码表观遗传修饰因子的基因 ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２、ＩＤＨ、ＡＳＸＬ１，以 及 ＲＮＡ 剪 接 子 和 Ｃｏｈｅｓｉｎｓ蛋 白 的 基 因 等。胚 系 突 变 基 因 ＲＵＮＸ１、 ＧＡＴＡ２、ＣＥＢＰＡ、ＤＤＸ４１和 ＡＮＫＲＤ２６也 不 适 用 于 ＭＲＤ检测。与治疗前比较，缓解后突变基因的表达 水平仍没有明显下降，需考虑是克隆造血突变或胚 系突变基因。胚系突变基因可通过检测胚系组织 ／ 细胞（例如口腔黏膜等）ＤＮＡ发现。
黑色素形成机理、生物学功能和应用开发的研究进展
生物资源2020,42(6 ):652〜659Biotic Resources综述DOI ： 10. 14188/j. ajsh. 2020. 06. 006黑色素形成机理、生物学功能和应用开发的研究进展陈海雁，陈向东，俞黎挪(武汉大学生命科学学院学院，湖北武汉430000)摘要：黑色素（melanin)是一类化学结构极其复杂、非均质的酚类或吲哚类物质聚合体，是自然界中M为丰富的天然色素，广泛存在于各种动物、植物和微生物中根据合成途径和中间代谢产物的不同，黑色素主要可分为为真黑索（eumelanin)、棕黑 素（pheomelanin)、异黑色素（allomelanin)三大类。
其中异黑色素又包括脓黑素（pyomelanin)、1, 8 _二轻基萘(dihydroxyna丨Aalene,DHM)黑色素等基于黑色素的生化功能，它们在1:业、医药、农业中都有广泛用途，是重要的生物资源.木文主要介绍天然黑色素在动植物和微生物中的合成途径、生物学功能以及有潜力的获取方法和应用前景关键词：黑色素；合成途径；酪氨酸酶；提取；应用中图分类号：Q939.97 文献标识码：A 文章编号：2096-3491(2020)06-0652-08B iosynthesis, function and applications of m elaninCHEN Haiyan , CHEN Xiangdong" , YU Lishan(College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China)Abstract ：M elanin is a kind of phenol or indole polymers which is heterogeneous with extremely complex chemical structure . It is the most abundant natural pigment and widely exists in various anim als, plants and microorganisms. The main types of melanin are eum elanin, pheom elanin and allomelanin. A m ong them, allomelanin includes pyomelanin and 1,8-dihydroxynaphthalene (D H N) melanin. Based on the biochemical function, melanin is widely used in industry, medi cine and agriculture as im portant biological resources. This paper focuses on the biosynthesivS and biological function of ncitural melanin in anim als, plants and m icroorganism s as well as the potential acquisition m ethods and applications.Key w ord s：m elanin；biosynthesis；tyrosinase；extraction；application〇引言黑色素（m elanin)是一类化学结构极其复杂、非 均质的酚类或吲哚类物质聚合体，是自然界中最为丰富的天然色素，广泛存在于各种动物、植物和微生物中。
N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素
第54卷 第9期 2021年9月天津大学学报(自然科学与工程技术版)Journal of Tianjin University (Science and Technology )V ol. 54 No. 9Sep. 2021收稿日期：2020-06-20；修回日期：2020-08-03. 作者简介：赵广荣（1966— ），男，博士，教授. 通信作者：赵广荣，**************.cn.基金项目：国家自然科学基金资助项目(31870077).Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31870077).DOI:10.11784/tdxbz202006056N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素赵广荣1, 2，侯亚男1, 2(1. 天津大学化工学院，天津 300350；2. 教育部合成生物学前沿科学中心和系统生物工程重点实验室，天津 300350)摘 要：甜菜黄素是安全的植物源水溶性天然色素，主要应用于食品行业．甜菜黄素还具有抗氧化活性和光学特性，在医疗保健、荧光成像等领域具有潜在应用价值．目前，甜菜黄素的主要来源是植物提取分离，但存在甜菜黄素含量低、种类少等问题．本文改造植物P450氧化酶，研发大肠杆菌异源合成甜菜黄素的新方法．首先，对甜菜的P450氧化酶CYP76AD1LL 和P450还原酶(cytochrome P 450 reductase ，CPR )进行N-端截短和改造，研究不同改造序列和表达策略对合成L-多巴的影响．结果表明，截去N-端跨膜序列，利用3种不同N-端序列修饰P450氧化酶，MA 序列修饰CPR (MA-tCPR )，工程大肠杆菌中均能以L-酪氨酸为底物合成L-多巴．其中亲水性2B1序列(MAKKTSS )修饰P450氧化酶，采用双顺反子表达策略优于单顺反子，工程大肠杆菌BDP10合成L-多巴的产量最高，为40.42mg/L ．进一步表达紫茉莉的4，5-多巴双加氧酶基因，构建了工程大肠杆菌BTA11，利用L-酪氨酸为前体，合成了甜菜醛氨酸．最后，在培养基添加3种氨基酸(对氨基苯甲酸、L-组氨酸、L-亮氨酸)和3种胺类化合物(酪胺、吡咯烷、吲哚啉)，工程大肠杆BTA11合成了6种对应的甜菜黄素．研究结果表明，采用N-端改造策略赋予植物P450氧化酶在大肠杆菌中具有催化功能，能合成天然和非天然的颜色多样、结构丰富的多种甜菜素． 关键词：细胞色素P450酶；甜菜黄素；大肠杆菌；合成生物学；酶的改造中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：0493-2137(2021)09-0934-08Betaxanthins Bioproduction by Escherichia coli UsingN -Terminal -Modified Plant P450 EnzymeZhao Guangrong 1, 2，Hou Yanan 1, 2(1. School of Chemical Engineering and Technology ，Tianjin University ，Tianjin 300350，China ； 2. Frontier Science Center for Synthetic Biology and Key Laboratory of System Bioengineering(Ministry of Education )，Tianjin 300350，China )Abstract ：Betaxanthins are water-soluble and safe pigments mainly used in the food industry. With rich antioxidantand optical properties ，betaxanthins have potential applications in the fields of health care and fluorescence imaging. Presently ，the main source of betaxanthins is plant extraction and separation ，but the obtained betaxanthin content is low and the betaxanthin varieties are few. In this study ，a new method for the heterologous synthesis of betaxanthins by Escherichia coli was developed by the expression of modified plant P450 oxidase. First ，to study the effects of modified sequences and expression methods on the conversion of L-tyrosine into L-dopa ，beet-derived P450 enzyme CYP76AD1LL and cytochrome P450 reductase (CPR )were truncated and modified at the N-terminal. The results showed that after the truncation of the transmembrane sequences ，all three different N-terminal sequence-modified P450 oxidase co-expressing with the MA sequence-modified CPR (MA-tCPR )successfully catalyzed the conversion of L-tyrosine to L-dopa in E. coli . The engineered E. coli strain BDP10 expressing N-terminal hydrophilic sequence 2B1-2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·935·modified P450 oxidase used in combination with the bicistronic strateg y resulted in the hig hest L-dopa produc-tion(40.42mg/L)，which was higher than that obtained with the monocistronic strategy. Furthermore，a betalamic acid-producing strain was constructed through the co-expression of a 4，5-dopa dioxygenase extradiol gene from Mir-abilis jalapa，which enabled the conversion of L-tyrosine to betalamic acid. Finally，three amino acids(para-aminobenzoic acid，L-histidine，and L-leucine)and three amines(tyramine，pyrrolidine，and indoline)were fed into the fermentation medium with the engineered E. coli strain，and six betaxanthins could be produced. The results show that N-terminal modification can endow plant P450 oxidase with catalytic function，and the resulting strain can synthesize natural and unnatural betaxanthins with various colors and rich structures.Keywords：cytochrome P450 enzyme；betaxanthin；Escherichia coli；synthetic biology；modification of enzymes甜菜黄素是优质天然色素，广泛应用于食品加工中．甜菜黄素还具有抗氧化活性和光学活性，使其在医疗保健、荧光成像等领域具有潜在的应用价值[1].甜菜醛氨酸是甜菜黄素的生色基团，它与不同氨基 酸或胺类之间自发席夫碱缩合反应，生成不同的甜菜黄素[2]．甜菜黄素主要存在于甜菜(Beta vulgaris)等石竹目植物中，由于多种组分并存使得单组分甜菜黄素的提取分离工艺复杂、成本高[3]．随着合成生物学发展，构建工程微生物为甜菜黄素的发酵生产提供了可能．在酿酒酵母中共表达大花马齿苋的多巴双加氧酶(PgDODA)分别与CYP76AD5、CYP76AD6或CYP76AD15，在培养基中添加酪氨酸前体，工程酵母合成了甜菜黄素[4].．大肠杆菌是异源合成天然产物的重要底盘细胞，具有生长快、培养简单、成本低廉等优势．最近在大肠杆菌中表达醋杆菌多巴双加氧酶基因，外源添加6种胺类物质，合成了相应的甜菜 黄素[5]．本文利用合成生物学与代谢工程手段，对CYP76AD1和P450还原酶(cytochrome P450 reduc-tase，CPR)进行N-端改造(见图1)，与紫茉莉的多巴双加氧酶(DOD)基因共表达，重构和优化了甜菜醛氨酸的生物合成途径，构建了生产甜菜醛氨酸的工程大肠杆菌．补加氨基酸或胺类物质进行发酵，实现半合成多种甜菜黄素．图1工程大肠杆菌合成甜菜黄素代谢途径优化Fig.1Optimization of betaxanthin metabiotic pathway in engineered E. coli·936·天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷 第9期1 材料与方法1.1 菌株及质粒对甜菜来源的细胞色素P450氧化酶CYP76AD1 (GenBank HQ656024.1)的突变体CYP76AD1W13L F309L 基因和P450还原酶CPR(GenBank XP_010692385)基因，紫茉莉来源的多巴双加氧酶DOD(GenBank B6F0W8.1)基因进行密码子优化，由苏州金唯智生物科技有限公司合成．大肠杆菌DH5α用于基因克隆和质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)用于甜菜黄素的半合成．本文构建的载体与菌株如表1所示．表1菌株与质粒Tab.1Strains and plasmids used in this study菌株 描述 质粒描述E. coli DH5αΔLac U169(Φ80 LacZ ΔM15) pACYCduet-1 pACYCori-P T7；CmRE. coli BL21(DE3) F-ompThsdS(rB-mB-)gal dcm(DE3)pHYN5 pACYC-P T7-CYP76AD1LL-P T7-CPR BDP1 BL21(DE3)，pHYN5 pHYN9 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP2 BL21(DE3)，pHYN9 pHYN10 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP3 BL21(DE3)，pHYN10 pHYN11 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-P T7-MA-tCPR BDP4 BL21(DE3)，pHYN11 pHYN12 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP5 BL21(DE3)，pHYN12 pHYN13 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP6 BL21(DE3)，pHYN13 pHYN14 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR BDP7 BL21(DE3)，pHYN14 pHYN15 pACYC-P T7-MA-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP8 BL21(DE3)，pHYN15 pHYN16 pACYC-P T7-17A-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP9 BL21(DE3)，pHYN16 pHYN17 pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R2-MA-tCPR BDP10 BL21(DE3)，pHYN17 pHYN24 pACYC-P T7-DOD BTA10 BL21(DE3)，pHYN24 pHYN25pACYC-P T7-2B1-tCYP76AD1L-R1-MA-tCPR-P T7-DOD BTA11 BL21(DE3)，pHYN251.2 主要试剂L-氨基酸、L-多巴、酪胺和抗坏血酸购自鼎国生物科技公司；吲哚啉及吡咯烷购自阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇购自康科德科技有限公司；质粒提取试剂盒、限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔；DNA聚合酶购自诺唯赞生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公司；表2所示的PCR引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成．表2PCR引物Tab.2PCR primers引物引物序列 5’→3’ 用途CYP Nc-F CATGCCATGGACCACGCGACCCTGCYP Bm-R CGCGGATCCTTAGTAGCGTGGGATAGGGATTAAT扩增CYP76AD1LL CP R-Nd-F GGGAATTCCATATGGCTTCCTCGACTTCTGACP R-Kp-R CGGGGTACCTTACCAAACATCGCGGAGGT扩增CPRMAC P R-Nd-F GGGAATTCCATATGGCGCGTCGTAGCAATG 扩增MA-tCPR的上游引物MA-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCGCTTTTCTCCCAACAGACCACT 扩增MA-tCYP76AD1L的上游引物17A-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTTTT-CTCCCAACAGACCACT扩增17A-tCYP76AD1L的上游引物2B1-JY-F GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGCGAAGAAAACCTCTTCTCTTTTCT-CCCAACAGACCACT扩增2B1-tCYP76AD1L的上游引物CYPR1-R GGTATATCTCCTT TTAGTAGCGTGGGATAGGGATT 扩增tCYP76AD1L-R1的上游引物CYPR2-R CATTGCTATCTCC TTAGTAGCGTGGGATAGGGATTAAT 扩增tCYP76AD1L-R2的上游引物R1MACPR-F TCCCTATCCCACGCTACTAA AAGGAGATATACC ATGGCGCGTCGTAGCAAT-GACAACAG扩增R1-MA-tCPR的上游引物R2MACPR-F TCCCTATCCCACGCTACTAA GGAGATAGCA ATGGCGCGTCGTAGCAATGACAA-CAG扩增R2-MA-tCPR的上游引物CP R-R CGCCGAGCTCGAATTCGGATCCTTACCAAACATCGCGGAGGT 扩增tCPR的下游引物VBamHI-F TAAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTVNcoI-R CGCCATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAAC线性化载体DONd-F GGGAATTCCATATGAAAGGGACATACTATDOKp-R CGGGGTACCTTAGTCCGTTTTTTGAGTAGT扩增DOD 注：N-端修饰序列用下划线表示，RBS序列用红色表示．2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·937·1.3 表达载体构建本文主要采用PCR扩增、酶切和连接方法，构建的基因表达载体如表1所示．利用开源网站TMHMM Server v. 2.0(http：// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，对CYP76 AD1LL 和CPR进行跨膜区预测，截去膜结合序列，将N-端改造序列设计在引物中．PCR扩增截短改造的两个基因片段，分别克隆到pACYCDuet-1的两个启动子之后，得到单顺反子表达载pHYN9、pHYN10、pHYN11．将RBS序列设计在引物中，采用重叠延伸PCR，将MA-CYP76AD1L、R1和MA-tCPR串联起来．利用同源重组试剂盒，将MA-CYP76AD1L-R1-MA-tCPR与线性化的载体pACYCDuet-1进行组装，得到双顺反子质粒pHYN12．相似地，构建其他双顺反子表达载体pHYN13～17．PCR扩增DOD基因，用酶切连接的方式构建到pACYCDuet-1或pHYN14的第2个T T7启动子后，得到表达载体pHYN24、pHYN25．1.4 培养基与发酵方法LB培养基：NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨 10g/L，pH＝7.0，121℃灭菌20min．M9培养基：Na2PO4·12H2O 17.1g/L，KH2PO4 3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH4Cl 1.0g/L，调节pH值至7.2，121℃灭菌20min．发酵培养基配制：向25mL的M9培养基加入灭菌的1mol/L MgSO4 125µL，1 mol/L CaCl2 2.5µL，抗生素20mg/L，2.5mmol/L抗坏血酸，5g/L葡萄糖.发酵：取过夜活化的菌液接种到含有25mL 发酵培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、220r/min下培养3～4h至OD600值为0.8～1.0．加入0.5mmol/L IPTG诱导，同时加入500mg/L L-酪氨酸，30℃、220r/min培养24h．发酵结果取3次重复的平均值(标准偏差)．1.5 检测与分析使用Primaide高效液相色谱(HPLC)测定L-多巴、L-酪氨酸、甜菜醛氨酸和甜菜黄素等代谢物．质谱检测使用带有ACQ UITY UPLC system的Synapt G2-Si Q-TOF质谱仪(Waters)．在500μL样品中加入等体积的1mol/L盐酸进行溶解，离心后上清液用孔径0.22µm水系滤膜过滤，用于HPLC分析检测L-多巴、L-酪氨酸．使用4.6mm×250mm C18色谱柱，流动相组成为95%甲醇-5%水-1.5%磷酸，流速1mL/min；紫外检测波长230nm，进样量10µL．标准曲线至少利用4、5个点标定，相关系数R2大于0.99．发酵液样品直接离心后上清液用孔径0.22µm 水系滤膜过滤，用于HPLC检测甜菜醛氨酸及甜菜黄素．使用4.6mm×250mm C18色谱柱；流动相组成是A液为0.1%甲酸水，B液为0.1%甲酸甲醇；等梯度洗脱，0～30min，(95%A∶5%B)～(45%A∶55%B)；流速1mL/min，进样量10µL；甜菜醛氨酸检测波长405nm，甜菜黄素检测波长470nm．甜菜醛氨酸的质谱检测使用BEH C18(2.1mm×100mm)1.7µm粒径色谱柱；流动相组成是A液为0.1%甲酸水，B液为0.1%甲酸乙腈；梯度洗脱，0～3min，(95%A∶5%B)～(5%A∶95%B)；3～4min，5%A∶95%B；4～5min，95%A∶5%B；流速0.25mL/min，进样量2µL，柱温45℃．2 结果与讨论2.1 N-端改造对L-多巴合成的影响来源于甜菜的CYP76AD1的双突变体CYP76AD1W13L F309L(标记为CYP76AD1LL)更有利于甜菜黄素合成[6]．首先对CYP76AD1LL和CPR共表达的大肠杆菌BDP1进行发酵，但没有检测到L-多巴(图2(a))．这与在酵母中表达的结果相反[6]，表明未改造的CYP76AD1LL在大肠杆菌中表达不适合.推测可能的原因是大肠杆菌细胞缺乏P450酶锚定的膜系统，使其没有功能．截除P450酶的膜结合序列，使其表达在细胞质中，有利于实现催化功能，该策略已经应用合成大豆苷元[7]、氧化紫杉烷等[8]产物．通过生物信息学分析，发现CYP76AD1LL的第7～29位氨基酸为跨膜区域，从第31～37是一段脯氨酸残基聚集区域，对蛋白质的正确折叠起着关键作用，其后是蛋白的C-端催化功能域[9]．于是，将处于膜外的N-端1～22位氨基酸进行截除，由于第13位的亮氨酸被截去，标记为tCYP76AD1L．CPR的N-端第26～48氨基酸残基为跨膜区，处于膜外，与C-端催化功能域较远，因此对N-端1～48位氨基酸进行截除，标记为tCPR．在对目标蛋白截短的同时，N-端起始序列的合理设计有助于在大肠杆菌内实现酶的催化功能[10].蛋白质序列第2位氨基酸为丙氨酸(Ala)时，更有利于P450酶在大肠杆菌内的翻译[11]．人工设计的疏水性N-端序列MALLLA VF(标记为17A)和亲水性N-端序列MAKKTSS(标记为2B1)分别实现了牛的CYP17A[12]和CYP2B亚家族酶[13]的大肠杆菌表达．用这两段序列修饰的植物源P450酶在大肠杆菌·938·天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷 第9期中实现催化功能[8,14]．由于CPR起辅助作用，只设计了一种N-端改造方式，对tCYP76AD1L设计了3种N-端改造方式(图2(a))．利用低拷贝pACYCDuet-1 构建单顺反子表达载体，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得工程大肠杆菌BDP2-4(图2(b))．（a）CYP76AD1和CPR的N-端改造设计（b）单顺反子表达载体示意图2N-端改造P450酶和CPR的单顺反子表达载体Fig.2Monocistronic expression vector of N-terminal-modified P450 and CPR 对菌株BDP1-4添加前体L-酪氨酸，发酵24h后，HPLC检测结果如图3所示．3种N-端改造P450酶均产生了正效应，在菌株BDP2-4的发酵液中检测到了L-多巴．使用2B1序列(MAKKTSS)的菌株（a）菌株BDP1和BDP4发酵液及标准品的高效液相色谱（b）tCYP76AD1L N-端改造蛋白单顺反子菌株发酵合成L-多巴图3N-端改造P450酶和CPR的单顺反子表达对L-多巴合成的影响Fig.3Effect of monocistronic expression of N-terminal-modified P450 and CPR on L-dopa productionBDP4合成L-多巴最多，产量为28.56mg/L．其次是使用MA序列，菌株BDP2的L-多巴产量为9.33mg/L，而17A序列(MALLA VF)的菌株BDP3合成L-多巴最少，为1.05mg/L．本研究中，亲水性2B1序列及MA的改造效果比17A序列要好，这与文献[8]报道的相反．在大肠杆菌合成氧化紫杉烷时，使用17A序列改造CYP725A4的效果优于序列MA和2B1．这可能是不同P450酶需要进行不同N-端改造，以获得最佳效果．2.2 双顺反子调控L-多巴合成在植物中P450酶与CPR比例约为15∶1，即1个CPR可以对应多个P450酶[15]．在工程酿酒酵母异源表达P450酶时，降低CPR的表达强度，提高了青蒿酸的产量[16]．为了弱化tCPR的表达，在MA-tCPR基因之前设计核糖体识别序列R1 (AAGGA-GATATACC)或R2(GGAGATAGCA)[17]，使tCPR和tCYP76AD1L共用一个启动子，构建了多个双顺反子表达载体pHYN12～17，导入大肠杆菌BL21(DE3)，获得工程大肠杆菌BDP5-10(图4(a))．菌株BDP5-10的发酵结果如图4(b)所示，双顺反子表达策略的L-多巴产量均高于单顺反子．在tCYP76AD1L蛋白改造方式相同的条件下，核糖体识别序列R1和R2的影响差异不明显．tCYP76AD1L蛋白N-端改造为2B1时，菌株BDP7和BDP10的L-多巴产量最高，菌株BDP10达到40.42mg/L，比单2021年9月赵广荣等：N-端改造植物P450酶实现工程大肠杆菌合成甜菜黄素 ·939·顺反子表达菌株BDP4产量提高41.53%. tCYP76AD1L蛋白N-端改造为MA时，菌株BDP5和BDP8的产量分别为23.96mg/L和26.80mg/L，是单顺反子表达菌株BDP2的2.57～2.87倍．双顺反子表达模式有利于合成更多的L-多巴，且P450的N-端改造与CPR的表达模式有组合效应．最佳组合模式的菌株BDP7和BDP10，合成L-多巴的产量是在酵母中产量的10倍[6]．（a）双顺反子表达载体的设计（b）双顺反子表达菌株合成L-多巴的产量图4双顺反子表达对L-多巴合成的影响Fig.4Effects of bicistronic expression of N-terminal-modified P450 and CPR on L-dopa production 2.3 甜菜醛氨酸的合成在酵母细胞中共表达紫茉莉来源的多巴双加氧酶DOD与CYP76AD1时，合成甜菜醛氨酸[18]．为了验证在大肠杆菌中是否有功能，将DOD的表达载体pHYN24导入BL21(DE3)中，得到菌株BTA10，添加L-多巴，进行发酵．结果如图5(a)和(b)所示，培养液变成显著的黄色．取上清液进行HPLC液相色谱检测，18.9min出现特征新峰．进行质谱分析，质核比为212.06，确认为甜菜醛氨酸．这表明DOD在大肠杆菌细胞中能催化L-多巴合成甜菜醛氨酸．利用酶切连接的方式将DOD基因克隆建到质粒pHYN14的第2套T T7启动子后，得到表达载体pHYN25，并导入BL21(DE3)细胞，获得菌株BTA11，添加L-酪氨酸，进行发酵．如图5(c)所示，菌株BTA11发酵上清液呈现出黄色．进行HPLC分析，有甜菜醛氨酸生成，表明BTA11能以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸．（a）菌株BTA10以L-多巴为底物合成甜菜醛氨酸的液相色谱（b）菌株BTA10以L-多巴为底物合成甜菜醛氨酸的质谱（c）菌株BTA11以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸图5工程大肠杆菌合成甜菜醛氨酸Fig.5Bioproduction of betalamic acid using engineeredE. coli2.4 甜菜黄素的合成甜菜醛氨酸能与氨基酸或胺类自发席夫碱缩合反应，生成甜菜黄素．为此，在工程大肠杆菌BTA11的培养基中，添加前体L-酪氨酸的同时，添加不同氨基酸或胺类化合物，进行发酵．如图6(a)所示，添加吲哚啉和对氨基苯甲酸(PABA)，发酵液呈红色，而添加L-组氨酸、L-亮氨酸和酪胺、吡咯烷的发酵液为黄色．对上清液进行HPLC分析，均出现新的特征·940· 天津大学学报(自然科学与工程技术版)第54卷 第9期峰，生成了对应的甜菜黄素(图6(b ))，表明菌株BTA11具有合成多种甜菜黄素的能力．对氨基苯甲酸和吲哚啉的芳香环结构产生了附加的电子共振系统，促进了吸收光谱中的深色偏移[19]，使生成的甜菜黄素呈现红色，而不是天然的黄色．（a ）菌株BTA11添加6种氨基酸和胺类物质发酵液上清的颜色甜菜黄素的特征峰用“*”标注图6 工程大肠杆菌BTA11合成多种甜菜黄素Fig.6 Bioproduction of betaxanthins using engineered E.coli BTA113 结 语微生物发酵是取代天然产物植物提取的新兴方法，本研究在大肠杆菌中构建立了一个甜菜素生物合成平台．优化了植物P450酶CYP76AD1LL 和CPR 在大肠杆菌中的表达，合成了L-多巴，并与多巴双加氧酶DOD 共表达，合成了甜菜黄素的生色骨架甜菜醛氨酸．利用该生物合成平台，外源添加氨基酸和胺类，实现了天然和非天然甜菜黄素的异源微生物合成.N-端截短和改造，有利于植物P450酶和还原酶在大肠杆菌中实现功能．对CPR 截去跨膜序列后，改造为MA-tCPR ；对CYP76AD1LL 截短后，使用 N-端亲水性序列(MAKKTSS )优于疏水性序列(MALLLA VF )和MA 序列，改造为2B1-tCYP76AD1L ，合成L-多巴的效果最好．首次实现了在大肠杆菌中P450酶CYP76AD1催化L-酪氨酸合成L-多巴，最高产量达28.56mg/L ．CPR 的表达方式对P450酶的功能有显著影响．使用双顺反子表达策略，弱化CPR 的表达，有利于强化P450酶催化功能．两种核糖体识别位点序列AAGGAGATATACC (R1)和GGAGATAGCA (R2)均可用于双顺反子下游基因的表达，L-多巴产量最高可达40.42mg/L ，比单顺反子表达提高了41.53%．共表达多巴双加氧酶DOD ，构建甜菜醛氨酸工程大肠杆菌BTA11，实现了以L-酪氨酸为前体合成甜菜醛氨酸．通过在发酵培养基中添加6种氨基酸和胺类物质，合成了6种颜色不同的甜菜黄素．参考文献：［1］ Contreras-Llano L E ，Guerrero-Rubio M A ，Lozada-Ramirez J D ，et al. 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A r ticle ID:042727104(2007)0520843201
R 282B y W B ,W Y ,2y @f N 2phenylm aleimide a s a N e w Ploymer izable Additive f or
Over char ge Pr otection of Lithium 2ion B atter ies
B.Wang ,Q.X ia ,Y .P.Wu
(Depa r ment of Ch emistry ,Fuda n U niversity ,S hanghai 200433,China)
K eyw o r ds :lithium ion battery ;overcharge protection ;electropolymerization;additiv e
CLC number :O 646.21
1 Results
In persuit of bet ter sa fety cont rols of lit hium bat teries ,much effort s has been focused on t he development of t he internal and self 2act uating overcharge protection additives.We report a novel elect ropolymerizable elec 2t rolyte additive for overcharge protection of lit hium bat teries.Elect rochemical properties and overcharge be 2havior of NPM as a new polymerizable elect r olyte additi ve for overcharge protect ion of lit hium ion bat teries are st udied by cyclic voltam met ry ,charge 2discharge measurement s ,electrochemical impedance spect roscopy and SEM characterization of t he elect rode of the overcharged batt eries [122].The results show t hat N PM can elec 2t rochemically polymerize at t he overcharge potential of 3.8-4.2V (vs.Li/Li +)to form a t hi n layer of poly 2mer film on t he surface of the cat hode ,resulting in an internal short 2circuit to prevent f rom t he battery volt age runaway.On t he ot her hand ,it is also found t hat t he use of NPM as an overcharge prot ection elect rolyte addi 2tive does not significant ly influence t he normal per formances of li thi um ion bat teries.
Acknowledgement :Financial support from National Basic Research Program of China (973Program No :2007C B209700)is great ly appreciated.
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tion of lithium ion batteries[J ].Electr o chim Acta ,2004,49:418924196.
第46卷 第5期
2007年10月复旦学报(自然科学版)Journal of Fudan U niversity (Natural Science )Vol.46No.5Oct.2007eceived da te :2007014
iogra ph :ang .Corres pendence a uthor u .P.E mail :wu p uda .。