5. 质粒的提取和电泳
质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物
质粒DNA的提取与电泳鉴定质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。
大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
质粒dna提取及电泳检测实验报告
质粒dna提取及电泳检测实验报告质粒DNA提取及电泳检测实验报告引言质粒DNA提取及电泳检测是生物学实验中常用的技术手段，用于分离和检测质粒DNA样本中的目标序列。
本实验旨在通过提取质粒DNA并进行电泳检测，验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
材料与方法1. 材料：- 质粒DNA样本- 细菌培养液- 细菌裂解液- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- TAE缓冲液- DNA分子量标记物2. 方法：1. 质粒DNA提取：a. 将细菌培养液中含有质粒DNA的细菌进行离心，收集细菌沉淀。
b. 加入适量的细菌裂解液，裂解细菌细胞，释放质粒DNA。
c. 加入氯仿，离心分离上清液和有机相。
d. 收集上清液，加入异丙醇，使DNA沉淀。
e. 用TE缓冲液溶解DNA，得到质粒DNA提取物。
2. 质粒DNA电泳检测：a. 准备琼脂糖凝胶，加入TAE缓冲液，制备电泳槽。
b. 加载质粒DNA提取物和DNA分子量标记物于琼脂糖凝胶孔中。
c. 连接电源，进行电泳分离。
d. 观察电泳结果，记录质粒DNA的迁移情况和分子量。
结果与讨论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并进行了电泳分离和检测。
在电泳结果中，我们观察到质粒DNA 片段在凝胶中呈现出带状分布，且迁移距离与分子量呈正相关关系。
根据电泳结果，我们可以初步判断质粒DNA的纯度和完整性。
如果质粒DNA在电泳过程中呈现单一的清晰带状分布，且没有明显的附加杂带，说明质粒DNA的纯度较高，没有明显的污染物。
而如果质粒DNA呈现模糊或多条不清晰的带状分布，可能存在其他DNA片段或杂质的污染。
通过电泳结果中质粒DNA片段的迁移距离，我们可以估算出质粒DNA的大致分子量。
通过与DNA分子量标记物的比对，我们可以初步判断质粒DNA的大小和可能的构造。
这对于进一步的研究和应用具有重要意义。
结论通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)
质粒dna提取及电泳检测实验报告(一)质粒DNA提取及电泳检测实验报告实验目的•提取质粒DNA并检测其纯度和浓度•进行电泳检测，分析质粒DNA的大小和完整性实验材料•培养基含有质粒DNA的细菌培养物•高纯度DNA提取试剂盒•离心管、移液器、显微镜等常规实验仪器设备实验步骤1.收取 mL培养基含有细菌的培养物样品，放入离心管中。
2.将离心管置于高速离心机中，以12000 rpm离心5分钟，使细菌沉淀于离心管底部。
3.弃掉上清液，轻轻地加入合适的缓冲溶液悬浮沉淀的细菌细胞。
4.加入适量的裂解液使细菌细胞裂解，使质粒DNA释放到溶液中。
5.加入蛋白酶K进行蛋白质降解，使DNA更易提取。
6.加入冷乙醇混合液，沉淀DNA。
7.使用离心机离心，将沉淀的DNA分离出来。
8.用缓冲液洗涤提取的DNA，去除杂质。
9.使用专门的仪器或试剂盒检测提取的质粒DNA的浓度和纯度。
10.备取质粒DNA样品，进行电泳检测。
结果与分析•通过电泳检测，可以观察到质粒DNA的带状图案。
•根据带状图案的迁移距离，可以初步判断质粒DNA的大小。
•如果带状图案清晰且没有模糊的杂带，说明质粒DNA的完整性良好。
•通过测量提取的质粒DNA的浓度和纯度，可以进一步评估实验结果的可靠性。
结论•本实验成功提取并检测了质粒DNA，并通过电泳检测初步分析了其大小和完整性。
•经测量，质粒DNA的浓度和纯度符合实验要求。
•本实验结果可应用于后续实验或研究中，为进一步分析质粒DNA 的功能提供了基础。
实验注意事项•操作过程需严格遵守实验室安全规范，避免接触有毒或有害物质。
•仪器设备使用前需检查并确保正常工作。
•实验室内要保持清洁，避免污染样品。
•测量和记录数据时，要仔细操作，确保准确性和可重复性。
参考文献（如果有的话，请列出相关参考资料）。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
质粒dna的提取及电泳检测实验报告
质粒dna的提取及电泳检测实验报告一、实验目的本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。
二、实验原理质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。
电泳检测是通过将DNA 样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。
三、实验步骤1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。
2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。
3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。
4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。
5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。
四、实验结果经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。
五、实验结论本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。
质粒提取
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂 SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂 解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后， 解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后， 会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组 会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组 DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱 DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱 性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中 性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中 和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基 和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基 因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒 因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒 DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀 DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀 到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌 到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌 中提取出来。
实验原理
碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色体在 拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH DNA变性 PH， 变性， 拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中 性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀， DNA不能准确复性 性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀， 而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 DNA却可以准确复性 而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。
质粒电泳步骤： 质粒电泳步骤：
琼脂糖， 缓冲液， （1）称取 ）称取0.4g琼脂糖，加入 琼脂糖 加入40ml的TAE缓冲液，在微波 的 缓冲液 炉上加热至完全溶解，稍微冷却之后倒入制胶槽， 炉上加热至完全溶解，稍微冷却之后倒入制胶槽，冷却至 胶完全凝固（ ），将凝固好的胶放入电泳槽中 胶完全凝固（30min），将凝固好的胶放入电泳槽中。 ），将凝固好的胶放入电泳槽中。 质粒+1µl 6倍上样缓冲液，混匀点样。 倍上样缓冲液， （2）5µl质粒 ） 质粒 倍上样缓冲液 混匀点样。 左右。 （3）电压 ）电压100 v，电泳 30 min 左右。 ， （4）放入 溶液中染色 10 min，在凝胶成像中观察电泳 ）放入EB溶液中染色 ， 结果。 结果。
质粒提取、纯化、电泳检测
质粒DNA的提取、纯化和电泳检测【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用；2、掌握碱变性法提取质粒DNA的方法；3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA分离纯化的实验原理；4、学习并掌握凝胶的制备方法；5、学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法；6、验证E.coli DH5α与E.coli DH5α（pUC19）在含有氨苄培养基上的生长情况并了解其原理。
【实验原理】1、携带外源基因并将外源基因导入宿主细胞，使之进行扩增和表达的媒介称为载体。
在基因工程操作中载体具有以下性质：A.具有自主复制的起点；B.具有多个限制性核酸内切酶的单一识别位点（多克隆位点）；C.具有可供选择的遗传标记；D.具有高拷贝数。
2、质粒 DNA 是原核生物除类核中的染色体 DNA以外 ,细胞质中含有的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小环状双链 DNA 分子。
除酵母的杀伤质粒为RNA 外 , 迄今发现的所有质粒均为双链环状DNA 。
多数质粒只有几千个 bp但也有一些质粒达105bp 以上 ,一般分子量在 ( 4～100) × 106道尔顿范围内。
不同的质粒在细胞内的拷贝数不同。
细胞内含有1-3个拷贝的质粒为低拷贝质粒（严紧型复制），当质粒数在10个拷贝以上，为高拷贝质粒（松弛型复制），用于载体构建质粒多为松弛型。
3、pUC19质粒大小约为2.69kb，含有以下构件：来自于E.coli质粒ColE1的松弛型复制起点；氨苄青霉素抗性基因（Amp r）；E.coliβ-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及编码β-半乳糖苷酶的DNA序列；多克隆位点（MCS）区段。
图1.pUC18/pUC19质粒图谱4、质粒在细胞内以共价闭合环状DNA的形式存在，呈超螺旋状态（cccDNA）。
在抽提质粒DNA的过程中，由于各种因素影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA(ocDNA)，若两条链发生断裂则转变为线状DNA（L DNA）。
实验九 质粒提取与电泳
实验要求 每组同学看到质粒条带 估算出质粒条带的分子量大小
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析
实验报告
下次实验
• 病毒的鸡胚接种、血凝和血凝抑制试验
将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在57mm之间。 凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将胶移至装 有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且 使缓冲液没过胶面。
取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液混合后，用 微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。
盖上电泳槽盖并通电，使DNA向阳极移动。
二、宿主的基本要求与性质
①能够高效吸收外源DNA ②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统 ③不具有限制修饰系统
④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-） ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖 ⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害 或无致病性等
三、碱裂解法制备质粒DNA
注意点：使用酚－氯仿时注意安全
（11）小心吸去上清液，将离心管倒置灭菌水，用枪头吹打沉淀，使其 彻底溶解，取9μl的DNA样品进行琼脂糖电泳， 其余-20℃保存备用。
实验操作- -质粒DNA电泳
透明胶封固样品槽两头，在一端放置样品梳。
用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至琼 脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量溴化乙锭 至微红，混匀。
（8）加等体积的溶液Ⅵ，振荡、颠倒离心管几次以沉 淀DNA，于室温放置２分钟，小心吸取上层水相至另一 洁净的离心管中。
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大肠杆菌遗传物质
质粒分子量较小，大小只有普 通细菌染色体DNA的百分之一。 基因组DNA分子量较大，细菌基 因组约含3000个基因，5106 bp。 基因组DNA容易断裂线性化
提取的质粒的方法：
1. 小量碱裂解法
特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提）
（2）RNA的提取、电泳
1) RT-PCR的第一步，也是目的 基因获得的第一步； 2) Northern blot的第一步；
28S 18S
注意：RNA提取过程中 主要避免RNA酶的污染。
（3） PCR及电泳分析
1)获得目的基因的最常用方法；
2)可以进行探针标记；
3)可以进行基因的定点突变
4)PCR酶切片段长度分析（PCRRFLP）； 5)可以定量分析基因含量（real time PCR）.
（沉淀DNA）
（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积 的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。
上午实验结束
（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。 （去除RNA） （8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min
注意：引物设计是非常重要的。
（4）T-A连接、转化
1）PCR产物的T/A克隆 2）感受态细胞的制备；
3）重组质粒的转化
4）抗生素筛选
平板筛选单克隆细胞 注意：目的基因与载体的连接比例是本步骤的关键
分析自己小组的实验结果， 有时失败的经历更重要！
Good bye
祝同学们下午考试中取得好成绩！！！
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
重组质粒的鉴定
平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有 或未含有质粒的细胞，却无法区分含 有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒 质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
质粒的电泳
质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂， 因此可以自由旋转从而消除张 力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成.
3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS
琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果
取10 ul 酶切后的质粒
加2 ~ 3 ul电泳上样液，混匀。 加入点样孔
电泳： 100伏，40分钟。
注：可将 5ul 未切的质粒作为对照。
质粒电泳
空质粒 重组质粒
质粒酶切电泳
a:酶切前 b:酶切后
插入片段
重组质粒分子量变大而在 电泳中滞后
注： 观察质粒的电泳带型 分析质粒切不开的原因。
如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？
平板筛选： 大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未 含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或 重组质粒的细胞
提取的质粒 质粒电泳筛选重组质粒 重组质粒的进一步酶切鉴定
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
2. 质粒提取试剂盒 纯化原理：离子交换柱层析等 小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit 质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验， 本次试验不进行实验操作，只讲解结果分 析。
碱裂解法提取质粒的原理
原理：
1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱 性条件下发生变性。 2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形 成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；
质粒载体
筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点
质粒提取原理：
质粒提取有多种方法，但都包含 有3个基本步骤：
1)培养细菌使质粒扩增；
2)收集裂解细菌；
3)分离纯化质粒DNA。
√去除蛋白质
*酚-氯仿抽提法
√去除RNA
*RNase消化
√去除基因组DNA
？？？
质粒DNA与基因组DNA的区别
1、部位不同： 2、大小不同：
观察昨天实验课的结果
1、观察自己组的实验结果： 转化平板
*培养板在37C 培养12-16h
卫星菌：培养时间过长
2、实验中的难点
*制备效率高的感受态细胞
重组质粒的鉴定
平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含 有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重 组质粒的细胞
提取的质粒 质粒电泳筛选重组质粒 重组质粒的进一步酶切鉴定
实验课总结 ------基因克隆总结
1. 基因组DNA提取、酶切、电泳
2.提取RNA、 电泳
3. RT-PCR 4.ＰCR产物与T载体连接 5. 转化
（1）基因组DNA提取、酶切、电人类基因组测序的第一步
3) Southern blot的第一步
注： 粘稠 ：开盖后出现丝现象，证明DNA已经游出。
（去除蛋白质）
（4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色 沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25： 24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。 （5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的 氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/ 分 离心 5min 。
开环 线性 超螺旋
质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环
一、重组质粒的酶切
在一微量离心管中加入：
1. 重组质粒DNA 2. 10 X Buffer M 3. EcoRI 4. Hind Ⅲ 5. 去离子水 总体积
置37 ℃， 45 min。
10 ul 2 ul 0.5 ul 0.5 ul 6 ul 20 ul
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH 60 ml 5mol/L 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml 水 4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
质粒DNA的制备
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：） 取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。 （2）（细菌的裂解：） 加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细 菌 加入200l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 （3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置 冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。