小鼠S1PR3慢病毒表达载体的构建及表达
小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建
小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建智深深;朱静;田杰;刘官信;鲁荣;林建萍;刘建平【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2011(36)2【摘要】目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体.方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA) 寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体.经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度.感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率.结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%; 3个靶点(抑制效率分别为76.8%、55.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P＜0.05).结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体.%Objective To construct and select RNAi lentiviral vectors that can silence mouse Islet-1 gene effectively. Methods Three groups of RNAi-target of mouse Islet-1 gene were designed, and corresponding shRNA oligo (sh1, sh2 and sh3) were synthesized, and then they were respectively inserted to the PLVTHM vector that had been digested by endonuclease. Agarose gel eleetrophoresis and sequencing were used to select and indentify the positive clones. The positive clones were extracted and then mixed with E. coli to amplify positive clones. The amplified clones werethen infected into 293T along with the other 3 helper plasmids to produce lentiviral vector. After the construction of the lentiviral vector, plaque formation test was performed to determine the titer of lentiviral vector. The lentiviral vectors were then infected into C3 H10 T1/2 cells. The transfect efficiency of the lentiviral vectors was determined with flow cytometry with detection of green fluorescent protein (GFP). Q-PCR was employed to detect the RNAi efficiency of the lentiviral vectors. Results Agarose gel electrophoresis analysis showed that the clones with right gene at the target size were successfully established; gene sequencing showed that the right DNA fragments had been inserted; plaque formation test showed that the titer of the virus solution was 3. 87 × 108 TU/rnl; the transfect efficiency of the lentiviral vector infected into Cs H10 T1/2 cells was 90. 36％. All the 3 groups of shRNA targets (sh1, sh2 and sh3) showed an inhibitory effect on Islet-1 gene, and the shl showed the highest inhibitory effect (76. 8 ％ ), as compared with that of normal cells (P＜0. 05). Conclusion The RNAi lentiviral vector that can effectively silence the mouse Islet-1 gene has been constructed successfully, which may lay a foundation for further investigation of Islet-1 gen.【总页数】4页(P170-173)【作者】智深深;朱静;田杰;刘官信;鲁荣;林建萍;刘建平【作者单位】400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部心血管内科;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室;400014,重庆,重庆医科大学儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R349.83【相关文献】1.小鼠B7-1基因RNAi慢病毒载体的构建及其沉默效应研究 [J], 孔永;沈立军;王婧;朱莹;蔡磊;邱玉华;黄莉2.小鼠CDK4基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究 [J], 降风;王雪贞;卜碧涛;张苏明;张旻3.小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 包杰;王前;郑磊;曾方银;刘杰;熊石龙;裘宇容;李娟4.小鼠Smad6基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 刘铮;代继宏;符州;冯琳琳5.小鼠IL-35基因shRNA慢病毒载体构建与RNAi效率的鉴定 [J], 刘义帅;王洪伟;邸大琳;付晓燕;吴国庆;王丽娜;鞠吉雨因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定
小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定阎秀林;陈钰文;金婕;朱玉;王健;张扬;卢利【摘要】目的：构建小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体。
方法通过体外合成小鼠全长Sema3A cDNA，采用Gateway技术将其基因插入到pDown⁃mSema3A⁃IRES/EGFP质粒中，再交换重组获得重组质粒pLV/EXPNZ⁃puro⁃mSema3A⁃IRES/EGFP，经过测序鉴定后，包装与浓缩慢病毒载体pLV（Exp）⁃Puro⁃CMV⁃mSema3A⁃IRES/EGFP，最后重组慢病毒载体转染293T细胞获得病毒液。
结果重组慢病毒载体11538 bp，测序结果证实Sema3A 基因共2319 bp正确插入带有EGFP的载体中，成功构建小鼠Sema3A基因过表达载体。
结论成功构建小鼠慢病毒载体pLV（Exp）⁃Puro⁃CMV⁃mSema3A⁃IRES/EGFP，为该基因在特定细胞内过表达株的筛选奠定基础。
%Objective To construct and identify over⁃expressing lentiviral vector of mSema3A. Methods Sema3A gene of mice was amplified by PCR,then the gene was inserted into plasmidspDown⁃mSema3A⁃IRES/EGFPby Gateway technology. The plasmidspLV/EXPNZ⁃puro⁃mSema3A⁃IRES/EGFP were produced by recombination. After sequencing identification,the vectorpLV(Exp)⁃Puro⁃CMV⁃mSema3A⁃IRES/EGFP was packed and condensed. Finally the recombinant vectors were used to transfect 293T cells to obtain virus pools. Results The recombinant lentiviral vectors were 11 538 bp with EGFP marker,and Sema3Agenes were inserted into the lentiviral vector correctly,indicating the over⁃expressing vector of Sema3A gene in mice was successfully constructed. Conclusion The over⁃expressing lentiviralvector of mSema3A was constructed correctly, which lay a foundation of screening of over⁃expressing strains of such gene in specific cells.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P226-229,233)【关键词】Sema3A;慢病毒载体【作者】阎秀林;陈钰文;金婕;朱玉;王健;张扬;卢利【作者单位】辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳 110002;辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳110002;辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳 110002;辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳 110002;辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳 110002;辽宁省口腔医学研究所口腔正畸学研究室，中国医科大学附属口腔医院正畸科，沈阳110002;辽宁省口腔医学研究所口腔颌面外科学研究室，中国医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，沈阳 110002【正文语种】中文【中图分类】R783.5正畸牙移动离不开张力侧牙槽骨增生为主和压力侧牙槽骨吸收为主的骨改建过程，而这一过程中如何维持成骨过程与破骨过程的动态平衡的骨稳态十分重要。
慢病毒载体的构建
重组慢病毒的产生：瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染法如
293T 高表达细胞系而产生重组慢病毒。此法非常成功，大多实验室采用此法。包膜 质粒、包装质粒与载体质粒共转(多用磷酸钙共沉淀法)染293T细胞直接产生生产细胞。 最后重组慢病毒分泌到培养基中进行培养而得到大量载体慢病毒。 例如用以下三质粒来包装产生重组慢病毒：
The Development of LV Vectors The 3rd Generation
Self-inactivating (SIN) vectors Further improvement in biosafety Tat was deleted Rev was put into a separate plasmid U3 of the 5’ LTR was replaced by the CMV IE promoter/enhancer The possibility of generating RCL is further reduced
Mitrophanous K, Gene Ther 5(11):1481–1487(1999)
Lentiviral Vector Systems Under Development
• Primate – Human immunodeficiency virus (HIV) – Simian immunodeficiency virus (SIV)
七 The Development of LV Vectors The 1st Generation
CMV (cytomegalovirus) immediate-early enhancer/promoter VSV-G (Vesicular stomatitis virus glycoprotein envelope) A cellular polyA was used to replace the 3’ LTR vpu from HIV was deleted
小鼠 Tox3 基因重组慢病毒载体的构建及其在卵巢颗粒细胞中的表达
结果 ： 经酶切及测序结果证实 ， 构建了重组慢病毒载体 Ｌ Ｖ — Ｔ ｏ ｘ ３ ； Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 及Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 结果显示慢病毒感
ｔ ｏ ｃ ｈ ｅ ｃ ｋ ｉ ｔ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｐ ｒ ｉ ｍａ ｒ ｙ ｇ ｒ ａ ｎ ｕ ｌ ｏ ｓ ａ ｃ ｅ ｉ ｌ ｓ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ： Ｔ ｈ ｅ ｆ ｕ １ １ ｌ ｅ ｎ ｇ ｔ ｈ ｏ ｆ Ｔ ｏ ｘ ３ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｗ ａ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ ＣＲ． ａ ｎ ｄ ｓ ｕ ｂ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ｐ ＣＤＨ— ＭＣＳ － Ｔ ２ Ａ— ｃ ｏ ｐ ＧＦ Ｐ— ＭＳ ＣＶ． Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｈ ａ ｎ ｔ ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｎｓ ｒ ｗｅ ｒ ｅ
国际生殖健康 ／ 计划生育杂志 ２ ０ １ ４ 年３ 月第 ３ ３ 卷第 ２ 期 Ｊ Ｉ ｎ ｔ Ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ Ｈ ｅ ａ ｈ ｈ ／ Ｆ ａ ｍ Ｐ ｌ ａ ｎ ， Ｍ ａ ｒ ｃ ｈ ２ ０ １ ４ ， Ｖ ｏ １ ． ３ ３ ， Ｎ ｏ ． ２
・
９５ ・
论 著・ 小鼠 ３ 基 因重组慢病 毒载体 的构 建及其在 卵巢颗 粒细胞 中的表达
ｃ ｏ ｎ ｆ ｉ ｒ ｍｅ ｄ ｂ ｙ Ｐ Ｃ Ｒ． ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｉ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｄ ｉ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ＤＮ Ａ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ ． Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ（ Ｌ Ｖ— Ｔ ｏ ｘ ３ 一
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。
我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。
接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。
在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。
同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。
我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。
本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。
3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。
4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。
小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定
小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定孙钦儒;贾宁【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)005【摘要】To construct lentiviral vector expressing mouse Sirt3 gene the expression of Sirt3 in cultured SK-N-SH cells after infection was observed. The cDNA fragment of Sirt3 gene was synthesized and was cloned into lentivi-ral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP to generate lentiviral vector plasmid pCDH-Sirt3. After digestion and se-quencing,the correct pCDH-Sirt3 and helper plasmids were transfected into the packed 293T cells, where the lentivirus was packed. The virus particles were concentrated from the supernatant and the titer of virus was deter-mined. The expression level of Sirt3 mRNA in lentivirus treated SK-N-SH cells was detected by using Real time PCR. The expression level of Sirt3 protein in lentivirus treated SK-N-SH cells was detected by using Western blot-ting. pCDH-Sirt3 recombinant vector was successfully constructed. The titer of lentivirus was 1×109TU/mL. The expression level of Sirt3 mRNA and Sirt3 protein in the overexpression group was significantly higher than that in the GFP group and the CON group (P<0.01), respectively. The recombinant lentivirus carrying Sirt3 gene was constructed successfully and the expression of Sirt3 was significantly increased in the infected SK-N-SH cells, which would be a powerful tool for exploring the function of Sirt3 inneuronal cells in vivo in the future.%构建小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体,检测人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)感染Sirt3基因过表达慢病毒后Sirt3 mRNA和蛋白的表达,为在细胞和动物水平研究Sirt3的作用提供新的途径和工具.利用Genebank检索的小鼠Sirt3基因序列,人工合成法合成小鼠Sirt3基因的cDNA片段,将其克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建慢病毒表达质粒.进行酶切及测序验证后,将慢病毒表达质粒连同辅助包装原件载体质粒共同转染入293T细胞,收集上清,测定病毒滴度.用Sirt3基因过表达慢病毒感染SK-N-SH细胞,即为Sirt3过表达组(Sirt3);用空载体慢病毒感染的SK-N-SH细胞为空载体组(GFP);未感染病毒的SK-N-SH细胞为对照组(CON).收集细胞后,用Real-time PCR法检测各组细胞Sirt3 mRNA的水平;用Western blotting法检测各组细胞Sirt3蛋白的表达.Sirt3基因过表达慢病毒载体构建成功,病毒滴度为1.0 ×109 TU/mL.Sirt3组SK-N-SH细胞的Sirt3 mRNA和Sirt3蛋白水平均显著高于GFP组和CON组(P<0.01).成功构建的Sirt3基因过表达慢病毒载体具备高效感染力,能在SK-N-SH细胞高效过表达Sirt3,本研究结果为今后进一步在神经细胞和模型动物中研究Sirt3的作用提供了新的途径和工具.【总页数】4页(P169-172)【作者】孙钦儒;贾宁【作者单位】西安交通大学医学部法医学院,西安710061;西安交通大学基础医学院,西安710061【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定 [J], 侯卫平;黄钢;翟志芳;袁发焕2.小鼠ERα基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其表达鉴定 [J], 李远远;卢芸;刘月华3.小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定 [J], 阎秀林;陈钰文;金婕;朱玉;王健;张扬;卢利4.重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定 [J], 刘伟;余英豪5.表达小鼠CD1_D基因的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定 [J], 王昆华;龚昆梅;张勇学;钟鸣;欧阳一鸣;刘为军;赵喜荣因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
STAT3ER慢病毒表达载体的构建及体外对神经元再生作用的研究
STAT3ER慢病毒表达载体的构建及体外对神经元再生作用的研究许晓光;于胜波;刘用楫【期刊名称】《解剖科学进展》【年(卷),期】2010()1【摘要】目的构建携带信号转导和转录激活蛋白STAT3和基因突变的雌激素受体ER的慢病毒载体,并转染受损的大鼠背根神经节神经元,研究其对神经元突起再生的作用。
方法运用基因重组技术,将STAT3、ER和核糖体介导的绿色荧光蛋白(IRES-GFP)片段插入慢病毒载体pRRL-MCS+的PmeI位点构建慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,经RT-PCR、Western blotting和测序分析加以鉴定其正确性。
将慢病毒载体3质粒细胞包装系统(主体质粒pRRL-STAT3ER-IRES-GFP、包装质粒pCMVdeltaR8.74和包膜质粒VSV-G)共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。
切断大鼠左L5近神经节的神经根,摘取L5背根神经节做分离神经元培养,将pRRL-STAT3ER-IRES-GFP感染神经元细胞并观察神经元细胞核转运和突起的长度。
结果构建的慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP经RT-PCR和Western blotting鉴定正确,测序分析与Genbank报道的STAT3基因序列完全一致。
3质粒共转染293T细胞后,测定慢病毒滴度为1010-11TU/ml。
转染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神经元经4-羟基三苯氧胺(4HT)激活,STAT3ER有明显的核转运,并增强突起的生长,经χ2检验与对照组有显著性差异。
结论成功构建了表达小鼠STAT3ER基因的慢病毒载体并证实STAT3信号转导有利于轴突生长。
【总页数】6页(P27-32)【关键词】STAT3;慢病毒;轴突生长【作者】许晓光;于胜波;刘用楫【作者单位】大连医科大学附属二院神经外科;大连医科大学解剖教研室【正文语种】中文【中图分类】R338.11【相关文献】1.干细胞因子逆转录病毒表达载体的构建及体外性质研究 [J], 刘淑艳;王大刚;胡林萍;卫佳;王金宏;种靖慧;马翠花;许琳琳;郑国光2.表达大鼠脑源性神经营养因子腺相关病毒(rAAV-BDNF)对体外培养海马神经元保护作用的研究 [J], 张惊宇;赵节绪3.丙肝病毒siRNA表达载体构建及抗病毒作用研究 [J], 陈佳玉4.mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究 [J], 冯艳;蒋忠华;王月玲;李明远;江滟;李婉宜;杨远;王保宁;冯伟;张强5.腺病毒介导的BDNF及NT3基因对体外培养听神经元的营养作用研究 [J], 陈谦;汪家政;刘红;吴燕;刘淑红;范明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
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Ｈａ ｉ ｎ ａ ｎ Ｍｅ ｄ Ｊ ，Ｓ ｅ ｐ ．２ ０ １ ５ ，Ｖｏ １ ．２ ６ ，Ｎｏ ．１ ８
海南医学 ２ ０ １ ５ 年９月第 ２ ６卷第 １ ８ 期
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ３ — ６ ３ ５ ０ ． ２ ０ １ ５ ． １ ８ ． ０ ９ ６ ７
【 摘 要】 目的 构建小鼠 卜磷 酸鞘氨醇受 体 ３（ Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ ） 慢病毒表达载体 ， 并检测其表达情况 。方法 小 鼠心 肌 组 织 ｍＲ ＮＡ并 逆转 录得 到 ｅ ＤＮ Ａ， 设计 并 合 成 引物 ， 采 用亚 克 隆方 式 将 目的基 因克 隆 至慢 病 毒表 达 载体
小鼠Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 慢 病 毒 表 达载 体 的构 建 及 表 达
王 航 ， 蔡克 银 ， 黄 浩
（ １ ． 广 州军 区武汉 总 医院 干部病 房二 科 ， 湖北 武 汉
４ ３ ０ ０ ７ ０ ；
２ ． 深圳 市合 一康 生物科 技 有 限公 司临床 医学 中心 ， 广东 深圳 ５ １ ３ ０ ０ ０ ）
ＨＵ Ａ Ｎ Ｇ Ｈ ａ ｏ ２ ． １ ． Ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｆＧ ｏ ｅ ｒ ａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｗｕ ｈ ａ ｎ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＧ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃ ｏ ｍｍ ａ ｎ ｄ ， Ｗ ｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ｏ Ｏ ７ ｏ ．
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ｐ Ｌ ｅ ｎ ｔ － Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ． Ｅ ＧＦ Ｐ 中， 将表达载体与包装质粒共转 ２ ９ ３ Ｔ 细胞 ， 进行 目的基 因的过表达慢病毒包装 ， 随后收集培养成 功病毒 ， 使用病毒感染小 鼠Ｌ ９ ２ ９ 细胞 ， 检测感染后 Ｌ ９ ２ ９ 细胞表达 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 情况 。结果 从小 鼠心机组织 ｃ Ｄ ＮＡ中扩 增 出大小约 １ １ ０ ０ ｂ ｐ 的 目的片段 ； 双酶切后成功将 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 克隆到慢病 毒表达载体 ｐ Ｌ ｅ ｎ ｔ ． Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ． Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ ， 表达质粒与包 装质粒供转染 ２ ９ ３ 细胞后 ４ ８ ｈ 就可以看到细胞 中成功表达绿色荧光。收集培养成功病毒感染小 鼠Ｌ ９ ２ ９ 细胞 ， 成功
Ｈ ｕ ｂ ｅ ｉ ， Ｃ Ｈ Ｉ Ｎ Ａ ； ２ ． Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ Ｚ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ Ｈ ｏ ｒ ｎ ｅ ｔ ｃ ｏ ｒ ｎ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｃ ｏ ． Ｌ ｔ ｄ ． Ｓ ｈ ｅ ｎ ｚ ｈ ｅ ｎ ５ １ ３ ０ ０ ￣Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ，
表达 出 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 。结论 本研究 成功构 建了可 以高表 达 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３的ｐ Ｌ ｅ ｎ ｔ ｉ ６ ． ３ 一 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 一 Ｉ Ｅ Ｓ Ｒ ． Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 慢 病毒表达 载体 ，
为进一步 调控 Ｓ １ Ｐ Ｒ ３ 相关的细胞功能奠定 了基础 。
【 关键词】 慢病毒； 卜磷酸鞘氨醇受体 ３ ； 血管损伤； 再内皮化 【 中图分类号】 Ｒ － ３ ３ ２ 【 文献标识码】 Ａ 【 文章编号ｌ １ ０ ０ ３ －６ ３ ５ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ｌ ８ —２ ６ ５ ３ —Ｏ ４