高级食品检验工技能考试——奶粉中亚硝酸盐的测定
分光光度法测定生鲜乳及乳粉中亚硝酸盐方法优化
分光光度法测定生鲜乳及乳粉中亚硝酸盐方法优化摘要：亚硝酸盐是致癌物质，检测食品中的亚硝酸盐，对食品安全的意义尤为重要。
其中乳及其乳制品的检测方法，目前主要以GB 5009.33的检测方法为主，其中第二法分光光度法术以使用广泛，但国标法中分光光度法测定亚硝酸盐存在取样量大，批量操作过程复杂情况。
本课题主要针对以上问题，用分光光度法对生鲜乳及乳粉中的亚硝酸盐含量测定过程进行优化。
优化后，样品取样量生鲜乳为18mL,奶粉为2g，加标回收实验回收率达到88%以上；RSD值为1.06%~1.93%，与国标法回收率90%；RSD值为0.66%~1.44%。
从回收率及RSD可以得出，优化后的方法数据准确度与国标法相当。
操作过程中使用高速离心机，能更好分离提取溶液，能很好的提升工作效率并保证实验的准确性，具有较好的操作性。
关键词：亚硝酸盐；分光光度法；乳制品1.引言亚硝酸盐是自然界环境中最普遍存在的含氮化合物之一[1]，是自然界常见的有害化学成分。
因其具有作为发色剂、防腐剂以及增强产品的风味的作用而被添加到食品中来。
牛奶及其制品因其中含有丰富而全面的营养物质，中国居民膳食指南推荐每日摄入300g及以上牛奶或其制品，是人们日常生活中重要的日常食品。
事实上天然牛奶中一般不含或含极有少量的亚硝酸盐，一般不会危害人体健康。
牛奶中出现较高的亚硝酸盐可能的来源主要有：来源一是草料在喂养奶牛后，在其消化系统消化过程中产生，来源二是在饲喂过程产生，来源三是生产用水中存在，来源四是为了延长牛奶的保质期人为添加[2] 。
由于亚硝酸盐对人体健康有如此严重的危害，而牛奶及其奶制品与我们生活息息相关，因此，检测其在乳及乳制品中的含量和可能被人体摄入量应引起高度重视。
目前国内外测定食品中亚硝酸盐含量的方法主要有荧光法、分光光度计法、离子色谱法及催化光度法等。
分光光度法由于实用性强，设备常用，因此为国内外测定食品中亚硝酸盐时常见选择的方法[3]。
高级食品检验工技能考试——奶粉中亚硝酸盐的测定
高级食品检验工技能考试——奶粉中亚硝酸盐的测定一、仪器与试剂仪器：电子天平（精确值0.01g）、722分光光度计、水浴锅、电炉、温度计、烧杯、玻璃棒、100容量瓶（3个/人）、移液管、刻度吸管、漏斗、量筒、锥形瓶、具塞比色管、比色管架、刻度吸管架试剂：亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液、对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液、亚硝酸钠标准溶液、蒸馏水、奶粉二、操作步骤1．亚硝酸钠标准使用液的配制：吸取亚硝酸钠标准溶液（每毫升相当于200ug亚硝酸钠）5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug 亚硝酸钠。
2．样品处理：称取0.5g的奶粉（平行做2个样品，并做一个空白），置于100mL烧杯中，以70℃左右的蒸馏水约50mL将样品全部洗入100mL容量瓶中，然后加入1mL 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入1mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，冷却至室温后加水至刻度，混匀。
于沸水浴加热5 min，取出后放置0.5h，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤。
弃去初滤液约15mL，收集滤液备用。
3．标准曲线的绘制：吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于6个50mL比色管中。
各加入2.5mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3-5min后，各加入1.0ml2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度（50mL），混匀，静置15min，用比色皿以零管调零，于分光光度计538nm波长测定吸光度，绘制标准曲线。
4．样品测定：吸取上述样品处理滤液20.00mL于50mL比色管中，（加入0.10mL亚硝酸钠标准使用液），各加入2.5mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3-5min后，各加入1.0ml2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度（50mL），混匀，静置15min，用比色皿以零管调零，于分光光度计538nm波长测定吸光度。
从标准曲线上查出样品液含亚硝酸盐的量。
乳粉中亚硝酸盐含量测定(精)
学习目标
知识目标： 1. 能解释测定亚硝酸含量原理，写出测定亚硝酸 盐含量的流程和注意事项。 技能目标： 1.会正确使用分光光度计； 2.能正确绘制标准曲线； 3. 能准确报告检测结果，评价亚硝酸盐含量是否 符合标准。 素质目标： 1.培养学生严谨、务实的学习精神； 2.培养学生开拓创新、团结协作的职业素质。
（5）吸光度的测定 将选择开关置于“A”，盖上 试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度 调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测 溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖 上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液 进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸 光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。重 复上述测定操作1～2次，读取相应的吸光度值， 取平均值。 （6）关机 实验完毕，切断电源，将比色皿取出 洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。
检测依据
GB 5009.33-2010
1 2
离子色谱法 分光光度法 乳及乳制品中亚硝酸盐与硝 酸盐的测定
3
乳及乳制品中亚硝-第三法
测定原理
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后， 在滤液中，加入磺胺和N-1-萘基-乙二胺 二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光 光度计在538 nm波长下测其吸光度。
亚硝酸盐含量计算
式中： X——样品中亚硝酸根含量，mg/kg； c——根据滤液的吸光度，从标准曲线上读取的NO2的浓度， μg/100mL； m——样品的质量，g； V——所取滤液的体积，mL。 样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐含量，按式计算： W（NaNO2）＝1.5×W（NO2） W（NO2）——样品中亚硝酸根的含量，mg/kg； W（NaNO2）——样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐的含 量，mg/kg。
奶粉化验员关于硝酸盐亚硝酸盐工作的解释
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奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质的应用
， Ｉ ｈｅ Ａｐ ｐｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｍａ ｔ ｒ ｉ ｘ Ｒｅ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎｃ ｅ Ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｌ ｏ ｆ Ｎｉ ｔ ｒ ｉ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ Ｎｉ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｉ ｎ Ｍｉ ｌ ｋ Ｐｏ ｗｄ ｅ ｒ
２ ０ １ ６年 １ １ 月
— ＝ ＝ ＝１ ２８
第３ ７卷第 ２ １ 期
Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａ ｎ ｄ Ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ
食品研究与并发
检测 分析
ＤＯ Ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ５ － ６ ５ ２ １ ． ２ ０ １ ６ ． ２ １ ． ０ ２ ９
ｓ ｈ ｉ ｐ ｓ ｏ ｖ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｒ ａ ｎ ｇ ｅ ｏ ｆ ０ ． ０ １ ０ Ｉ ｘ ｇ ／ ｍＬ 一 ０ ． ５ ０ ０￣ ｇ ／ ｍＬ（ ＮＯ ２ － ） ａ ｎ ｄ ０ ． １ ０ ０ ｔ ｘ ｇ ／ ｍＬ － ５ ． ０ ０ Ｉ ． ￣ ｇ ／ ｍＬ（ Ｎ Ｏ３ 一 ） ， ｗｉ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｒ ｅ ｌ ａ —
亚硝酸盐（ 以Ｎ Ｏ ２ － 计） 和硝酸盐（ 以Ｎ Ｏ ３ － 计） 分别在 ０ ． ０ １ ０￣ ｇ ／ ｍ Ｌ － Ｏ ． ５ ０ ０ 咖 Ｌ和 ０ ． １ ０ ０ 咖 Ｌ－ ５ ． Ｏ ０ ｐ ． ｇ ／ ｍＬ的范围 内线性 良好 ， 相关 系数（ ｒ ） 均大于 ０ ． ９ ９ ， 在奶粉 中的最低定量限分别为 ０ ． ４ ０ ０ ／ ４ ． ０ ０ ｍｇ Ｃ ｋ ｇ （ Ｎ Ｏ ＪＮ Ｏ ｆ ） ； 亚硝 酸盐和硝 酸盐测定方法
Ｎ ０ ｊ ＿ ） 。 奶粉 中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控 品 ， 可 以用于分析 测试 方法的评价、 实验室结果的比
乳粉中亚硝酸盐含量测定方法评析
乳粉中亚硝酸盐含量测定方法评析乳粉中亚硝酸盐含量测定方法评析乳粉中亚硝酸盐是一种有害物质，其存在会对人体健康造成危害。
为此，国家对于乳粉中亚硝酸盐的含量有着严格的要求，使得有必要对乳粉中的亚硝酸盐进行含量的测定。
本文将从测定方法的选用、取样、分析、数据处理等几个方面，对乳粉中亚硝酸盐含量测定方法进行评析。
1. 测定方法的选用乳粉中亚硝酸盐含量测定有多种方法，常见的有高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)法、氯化物离子电极法、膜电位法、胆碱脱氧酶-电化学生物传感器法等。
其中，HPLC-MS/MS法在精确度、灵敏度以及准确性方面优于其他方法，可以准确测定出乳粉中亚硝酸盐的含量并较好的反映出乳粉的品质。
因此，HPLC-MS/MS法成为乳粉中亚硝酸盐含量测定的首选方法。
2. 取样取样是乳粉中亚硝酸盐含量测定的关键步骤，也是决定测定结果准确性的重要因素。
在取样时，应充分考虑乳粉的种类、批次、包装状态等因素，以确保取样均匀、准确，避免取样误差的发生。
此外，在取样前，也应注意乳粉的存储条件，并采用必要的样品保存措施，以确保测定结果的准确性和可靠性。
3. 分析在分析过程中，应选用最优的实验参数，以确保测定的准确性、灵敏度和精确度。
首先，将乳粉样品经过研磨、筛分等步骤，将样品的粒径尽可能的降低，以便后续的分析。
然后，应根据不同的样品，选择最佳的色谱条件，以获得最佳的分集效果。
最后，利用标准曲线法，结合HPLC-MS/MS系统，从不同的亚硝酸盐来源提取出乳粉样品中的亚硝酸盐，并根据其含量，进行乳粉中亚硝酸盐的测定。
4. 数据处理在测定完乳粉中亚硝酸盐的含量之后，还需要对测定结果进行数据处理，以便更准确地反映出乳粉真实的品质。
首先，可以根据标准曲线法，从测定结果中计算出乳粉样品中亚硝酸盐的标准值，以反映出乳粉的实际含量。
其次，还可以根据不同样品的测定结果，计算出其准确性、精确度及灵敏度，以便更加准确地评价乳粉的品质。
紫外检测—离子色谱法测定婴儿奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐
紫外检测—离子色谱法测定婴儿奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐作者：李柚来源：《中国化工贸易·下旬刊》2018年第03期摘要：建立了紫外检测-离子色谱法测定婴儿奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐的分析方法。
样品经溶剂沉淀除蛋白和固相萃取净化后，采用优化后的色谱条件测定。
结果表明，硝酸盐和亚硝酸盐浓度分别在0.5-10mg/L内具有良好的线性关系（0.9999），方法回收率94.0-102.0%。
该方法检测这两种离子测定快速，灵敏度高，满足婴幼儿奶粉中硝酸盐和亚硝酸盐含量的同时测定。
关键词：离子色谱；紫外检测；亚硝酸盐；硝酸盐；婴儿奶粉亚硝酸盐和硝酸盐在适宜条件下均可在人体内合成具有强致癌作用的亚硝胺类化合物。
植物、霉菌、人的口腔和肠道细菌有将硝酸盐转化为亚硝酸盐的能力，因此，硝酸盐往往表现为亚硝酸盐的毒性。
亚硝酸盐属于易滥用的食品添加剂，能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。
婴儿食用亚硝酸盐或硝酸盐浓度高的食品会引起“高铁血红蛋白症”，甚至死亡，因此欧盟建议亚硝酸盐严禁用于婴儿食品，硝酸盐应予限制使用。
因此亚硝酸盐作为亚硝胺的前身物质已被人们广泛重视，各国对其在食品加工中的使用量都制定了严格的指标。
我国已对部分食品、生活饮用水中的亚硝酸盐和硝酸盐制定了国家卫生标准。
1999年我国对乳粉卫生标准进行了修订，对乳粉中硝酸盐、亚硝酸盐的含量提出了严格的限制：其硝酸盐的含量不得超过100mg/kg，亚硝酸盐的含量不得超过2mg/kg。
目前，亚硝酸盐和硝酸盐的主要检测方法有离子色谱法和分光光度法等。
本文使用瑞士万通离子色谱仪和自动进样器以及紫外检测器对某进口品牌的奶粉中的亚硝酸盐和硝酸盐的含量进行了检测，使用电导检测器时干扰离子峰较多，完成检测时间较长，使用紫外检测器干扰峰少，检测速度快，因此本次实验使用紫外检测器完成检测。
1 实验部分1.1 主要仪器与试剂仪器：Metrohm IC 930型离子色谱仪（瑞士万通公司），自动进样器（858 Professional Sample Processor），紫外检测器（UV/VIS Detector），MagIC Net 3.0离子色谱工作站。
奶粉中亚硝酸盐的测定
食品检验工理化分析技能操作内容及评分细则——奶粉中亚硝酸盐的测定一、试剂和仪器（需提前准备）1、分光光度计1台；2、（1㎝）比色管1套；3、（1、5、10mL）移液管；4、50mL容量瓶10个、100mL容量瓶1个、250mL容量瓶3，1000mL容量瓶5个；5、1mL移液枪一把，1mL移液枪头；6、100mL烧杯3个；500mL烧杯1个；7、洗瓶1个；8、胶头滴管1个；9、移液管架1个；10、吸耳球1个；11、Φ15㎝滤纸一盒、小方片吸水纸1盒（约长3㎝宽2㎝）；12、玻棒1根；13、铁架台+铁圈1套；14、亚铁氰化钾、乙酸锌、硼砂、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、奶粉。
二、实验过程A、准备工作（由工作人员提前完成）1、亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O溶液：称取106g亚铁氰化钾溶于水，并定容至1000ml。
2、乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O溶液：称取220g乙酸锌，加30ml冰醋酸，溶于水并定容至1000ml。
3、硼砂饱和溶液：称取50g硼砂溶于1000 ml热水中，冷却后备用。
（由工作人员提前配制）4、0.4%对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶于100 ml 20%的盐酸中，避光保存。
5、0.2%盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2g盐酸萘乙二胺,溶于100 ml水中，避光保存。
6、亚硝酸钠标准溶液：精密称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠，加水溶解移入500 ml容量瓶中，并稀释至刻度（200μg/mL）。
亚硝酸钠标准使用溶液：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液2.5 ml, 置于100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度（5μg/mL）。
B、样品制备：1、于100mL烧杯称取奶粉2.500g；注：做三个平行样品，称量后由工作人员统一在每个样品中加入1mL亚硝酸溶液。
2、加入饱和硼砂溶液6.25mL，搅拌均匀；3、用150mL左右的约70℃热水将样品转移到250mL的容量瓶中；4、将样品放入到沸水浴中加热15min ；注：第一个样品加好热水后就可以开始计时，第三个样品开始计时后可做先做其他工作，如C1。
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高级食品检验工技能考试
——奶粉中亚硝酸盐的测定
一、仪器与试剂
仪器：电子天平、722分光光度计、水浴锅、电炉、温度计、烧杯、玻璃棒、容量瓶、移液管、刻度吸管、漏斗、量筒、锥形瓶、具塞比色管、比色管架、刻度吸管架。
试剂：亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液、对氨基苯磺酸溶液、盐酸萘乙二胺溶液、亚硝酸钠标准溶液、蒸馏水、奶粉。
二、操作步骤
1．亚硝酸钠标准使用液的配制：吸取亚硝酸钠标准溶液（每毫升相当于200ug亚硝酸钠）5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug 亚硝酸钠。
2．样品处理：称取0.5g的奶粉，置于100mL烧杯中，以70℃左右的水约50mL将样品全部洗入100mL容量瓶中，然后加入1mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入1mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质，加水至刻度，混匀，于沸水浴加热5 min，取出后放置0.5h，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液15mL，滤液备用。
3．标准曲线的绘制：吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于6个50mL比色管中。
各加入2.5mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3-5min后，各加入1.0ml2g/L盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用比色皿以零管调零，于分光光度计538nm波长测定吸光度，绘制标准曲线。
4．样品测定：吸取上述样品处理滤液20.00mL于50mL比色管中，（加入0.40mL亚硝酸钠标准使用液），按标准曲线的绘制同样操作，于538nm波长处测定吸光度，从标准曲线上查出样品液含亚硝酸盐的量。
同时做试剂空白。
三、计算
x×1000
亚硝酸盐的含量（mg/kg）= —————————
20
m×———×1000
100
x———比色用样品液中含亚硝酸盐的量，µg
m ———样品质量，g
计算结果保留两位有效数字
四、精密度
在重复性条件下获得的两次测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 。
五、相对误差
实验结果相对误差小于10%。
盐酸萘乙二胺法（测定亚硝酸盐）
原理
样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色的染料，其颜色深浅与亚硝酸根含量成正比，可以比色测定（538nm）。