动物细胞工程制药的研究进展

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工 业 技 术
１ １ ３ １ ；２ ０ ０ ５ 年中国农业大学和北京济普霖 生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白 和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表 达，含量分别达到 ３．４ 克 ／ 升和 １．５ 克 ／ 升， 标志了我国首次获得可商业化生产的动物 乳腺生物反应器重组人类蛋白［ １ ５ － １ ６ ］ 。目前科 学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床 前试验和临床试验等研究，力争早日实现 我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。 ２．３ 细胞核移植技术
目前用于动物细胞体外培养的生物反 应器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、 回转生物反应器等。国外占主流优势的是 搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞 的产率，可采用流加或灌注培养及微载体 培养等相关技术［２０－２１］。美国 Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ 公 司使用 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞以 １ ２ ， ０ ０ ０ Ｌ 搅拌式生物反 应器培养槽生产 ｔ － Ｐ Ａ 重组蛋白以及治疗 癌症的生物药物。美国 Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ 公司建立的 流加悬浮培养 ｒＣＨＯ 表达 ｒ β Ｇａｌ 系统，采 用化学修饰的无蛋白 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞培养基并增 加 Ｔ Ｃ Ａ 循环，生物反应器中活细胞密度最 高可达 １０７ｃｅｌｌ／ｍｌ。国内第四军医大学采用 ５Ｌ ＣｅｌｌｉＧｅｎ 反应器连续灌注培养杂交瘤细 胞，培养第 ９ 天细胞密度达到 ８ × １０６ ｃｅｌｌｓ ／ ｍ ｌ 以上［２２］。目前国内未见有万升级的生 物反应器用于生产的报道，同时我国有关 商品化大规模动物细胞反应器产品还处于
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空白，有待于进一步改进现有生物反应器 设计或设计新型的生物反应器。
３ 发展前景
根据我国动物细胞工程制药的现状， 今后应该将重点放在以下方面：
（ １ ） 建立动物细胞大规模培养的技术平 台。该技术是转基因工程药物、单克隆抗 体及疫苗等产品的关键技术，主要由以下 几个要素构成：
前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已 经进入产业化的生产阶段。
此外利用细胞融合技术可以生产各种 免疫疫苗，肿瘤细胞 ／ 树突状细胞融合疫 苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究 的热点， 在各种动物模型及病人身上观察 到肿瘤的消退［９－１１］。Ａ ｖ ｉ ｇ ａ ｎ 等将乳腺癌或 肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含 有人粒 － 巨噬细胞集落刺激因子、白介 素 － ４ 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使 两种细胞产生融合， 融合细胞疫苗能使肿 瘤消退［ １ ０ ］ ，显示其在肿瘤治疗方面具有良 好的应用前景。 ２．２ 转基因动物
据美国遗传学会预测，到 ２ ０ １ ０ 年，所 有基因工程药物中利用动物乳房生物反应 器生产的份额将高达 ９ ５ ％。国外现已有数 十家以动物乳腺反应器为核心技术的公 司，可生产α １ －抗胰蛋白酶、人红细胞 生成素、乳铁蛋白、人血清白蛋白、人血 红蛋白及人凝血因子Ⅸ、Ⅷ和抗凝血酶 Ⅲ、血纤维蛋白原、ｔ Ｐ Ａ 等十余种稀有药 品，但只有为数极少的几种药用蛋白上 市。２ ０ ０ ６ 年 ６ 月，由美国 Ｇ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍ ｅ 转基因 公司研制成功的世界上第一个利用转基因 动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白 药物棗重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名： Ａ Ｔ ｒ ｙ ｎ 牋）已经获准上市［１２］。
１ 生产用动物细胞
目前用于生物制药的动物细胞有 ４ 类， 即原代细胞、二倍体细胞系、融合的或重 组的工程细胞系和转化细胞系。 １．１ 原代细胞
原代细胞是直接取自动物组织器官， 经过粉碎消化而获得的细胞悬液。动物细 胞生产生物药品的早期，一般用原代培养 的细胞来生产疫苗，如鸡胚细胞、原代兔 肾细胞、鼠肾细胞、淋巴细胞等，Ｅｎｄｅｒ 最 先用原代培养的猴肾组织细胞来生产脊髓 灰质炎灭活疫苗。原代细胞增殖能力有 限，需要大量动物才能增加产量，费钱费 力，限制了它的应用。 １．２ 传代细胞系（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ＣＣＬ）
工程细胞系是指采用基因工程技术或 细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行
修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独 特性状的细胞系。用于构建工程细胞的动 物细胞有 ＢＨＫ－２１ 、ＣＨＯ－ｄｈｆｒ、Ｎａｍａｌｗａ 、 Ｖｅｒｏ、Ｓ Ｐ ２ ／ ０ 、Ｓ ｆ － ９ 等细胞系［１－２］。Ｓ Ｐ ２ ／ ０ － Ａ ｇ １ ４ 工程细胞系是通过融合的方法， 从抗羊红细胞活性的 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ 的小鼠脾细 胞和骨髓瘤细胞系 Ｐ ３ Ｘ ６ ３ Ａ ｇ ８ 融合杂交瘤 Ｓ Ｐ ２ ／ Ｎ Ｌ － Ａ ｇ 亚克隆中分离获得，可用于 生产单克隆抗体［２］。目前用重组 Ｄ Ｎ Ａ 技术 改造的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞生产干扰素、白介素、 Ｅ Ｐ Ｏ 、单克隆抗体、诊断试剂以及其它各 种蛋白质类药品已成为国际医药市场上的 热销产品，但这些产品的生产规模普遍较 小（ 大多为 ５～５ ０ 升的小型培养罐） ［５］。 １．４ 转化细胞系
动物细胞的大规模高效培养技术是生 物制药的关键技术，通过动物细胞培养生 产生物产品已成为全球生物工业的主要支 柱。目前动物细胞培养生产较多的生物制 剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵 巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的 基因片段与仓鼠卵巢细胞的 Ｄ Ｎ Ａ 融合．再 在培养液中大量培养它们、最后得到所需 药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对 较低。但设备费用节省得多，如属于小品 种、小产品类生物工程产品，可采用此法。
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工 业 技 术
马瑞丽 （西北农林科技大学生命科学学院 陕西杨凌 ７ １ ２ １ ０ ０ ）
摘 要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其
通过某个转化过程形成的，常由于染 色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特 点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具 有长期培养，倍增时间短，对培养条件和 生长因子等要求较低的特点，适于大规模 工业化生产。在生物制药中，可通过改造 宿主细胞特性，如延长细胞周期．提高工 程细胞原始表达水平等来提高药物的产 量。李红艳等研究空间环境对 ＣＨＯ（ｄｈｆｒ ） 细胞生长特性的影响，结果表明空间诱变 致生长减慢的细胞株有利于提高目的蛋白 的产量，为筛选优化的生物工程制药细胞 提供可能［３］。目前 ｃ Ｈ ｏ （ ｄ ｈ ｆ ｒ ）作为重要的 基因表达受体细胞，已成功应用于表达促 红细胞生成素（ Ｅ Ｐ Ｏ ） 、重组乙型肝炎疫苗 等生物制药领域［４－５］。
２ 动物细胞工程制药技术
２．１ 细胞融合 细胞融பைடு நூலகம்指在诱导剂或促融剂作用
下，两个或两个以上的异源细胞或原生质 体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞 的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核 心基础技术之一，不仅在农业、工业的应 用领域不断扩大，而且在医药领域也取得 了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫 苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合 技术的基础上 Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ 和 Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ 将能 产生特异性抗体的原代 Ｂ 淋巴细胞与肿瘤 细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的 方法［ ５ ］ 。国内外已培育出了许多具有很高 实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌 用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲 肝病毒、抗人 Ｉ ｇ Ｍ 、抗人肝癌和肺癌、抗 Ｍ－ＣＳＦＲ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｃｏｌｏｎｙ－Ｓｔｉｍｕｌａｔ－ ｉ ｎ ｇ Ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ Ｒ ｅ ｃ ｅ ｐ ｔ ｏ ｒ ，巨噬细胞集落刺激 因子受体）胞外区的单克隆抗体等 ［７－９］。目
我国自 １ ９ ９ ８ 年在国家“８ ６ ３ ”计划中 将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重 大研究项目以来，也取得了一些较好的成 绩。１ ９ ９ ６ 年研制成功的能在乳腺中表达人 凝血因子、Ｅ Ｐ Ｏ 的转基因羊；１ ９ ９ ８ 年曾 溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基 因奶牛； ２ ０ ０ ０ 年中国农业大学与北京兴绿 原生物技术中心合作，成功获得了我国首 例转有人 ａ ｌ 一抗胰蛋白酶基因的转基因羊
原代细胞经过传代筛选克隆，从多种 细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特 征的细胞株称为 Ｃ Ｃ Ｌ 。许多 Ｃ Ｃ Ｌ 建立于 ５ ０ 年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实 验动物的量，并且因为所用的细胞性质均 一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗 可以保证质量，避免了动物个体差异产生 的疫苗质量不稳定问题。但 Ｃ Ｃ Ｌ 在生物学 特性上与肿瘤细胞有许多相似之处， 有时 是从肿瘤细胞衍生而来， 由于缺乏有效的 科学手段来排除其潜在的致瘤性， 因而数 十年间未允许 Ｃ Ｃ Ｌ 用于生产。７ ０ 年代以 后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安 全性， Ｗ Ｉ － ３ ８ 是第一个生产脊髓灰质炎灭 活疫苗的二倍体细胞系。二倍体细胞系一 般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁 和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一 般可传代培养 ５ ０ 代，且无致瘤性，现在 Ｃ Ｃ Ｌ 已被广泛用于人用治疗性药物的生 产，但仍不是理想的生产细胞系。表 １ 列 出了一些常用的生产用动物细胞系。 １．３ 工程细胞系
利用转基因动物乳腺反应器生产药用 或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的 热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官， 乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因 动物本身的生理反应，从转基因动物的乳 汁中获取的目的基因产物，不但产量高、 易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修 饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被 称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表 达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的 动物就相当于一座药物工厂。２ ０ 世纪 ８ ０ 年 代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳 腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基 因，开创了研制动物乳房生物反应器的先 河［１３－１４］。
细胞核移植技术，是指将一个动物细 胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产 生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物 的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、 牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移 植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、 小鼠等物种上均获得了成功。