DPPH自由基清除法
清除DPPH自由基能力检测方法
清除DPPH自由基能力检测方法清除DPPH自由基能力是用来评价化合物在体外是否具有抗氧化活性的一种常用方法。
DPPH自由基是一种常用的自由基模型，其具有紫色，可通过其吸收峰的变化来反映清除能力。
以下是常用的几种用于检测清除DPPH自由基能力的方法：1.分光光度法分光光度法是一种常用的检测方法，基本原理是通过测量化合物与DPPH反应后的溶液吸光度的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）准备1mM的DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物按一定浓度体系添加到相应的试管中。
3）将相同体积的DPPH溶液加入到每个试管中，混匀。
4）放置在室温下，静置反应30分钟。
5）使用紫外可见分光光度计测量反应体系的吸光度，计算清除率。
2.电子顺磁共振法（EPR）电子顺磁共振法是另一种常用的方法，通过测量化合物对DPPH自由基的清除能力，进而评估其抗氧化活性。
实验过程如下：1）准备含有DPPH和待测化合物的溶液。
2）使用电子顺磁共振仪测量样品的EPR信号，同时测量含有DPPH和不含DPPH的样品作为参比。
3）通过比较样品与参比的EPR信号来计算清除率。
3.原子力显微镜方法（AFM）原子力显微镜方法是一种非常灵敏的方法，可以用于直接观察化合物对DPPH自由基的清除作用。
实验过程如下：1）制备DPPH自由基薄膜。
2）将待测化合物沉积到DPPH自由基薄膜上。
3）使用原子力显微镜观察样品的表面形态变化。
4）通过观察DPPH颜色的变化和表面形态的变化来评估清除率。
4.荧光法荧光法是一种快速、灵敏且简便的检测方法，利用化合物与DPPH反应后荧光上转换的变化来评估清除DPPH自由基能力。
实验过程如下：1）制备DPPH乙醇溶液。
2）将待测化合物与DPPH溶液混合。
3）使用荧光光谱仪测量样品的荧光强度的变化。
4）通过荧光强度的变化来计算清除率。
总结：以上所述是几种常用于检测清除DPPH自由基能力的方法，分别基于吸光度、EPR、AFM和荧光等原理。
DPPH自由基清除与普用自由基清除实验（水溶液）-实验流程图-操作..
DPPH·自由基清除法(修改版)李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.6）【原理】1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, 简称为DPPH·自由基。
由于分子中存在大π键，所以，该自由基能稳定存在。
且在519nm处，有最大吸收波长。
当DPPH·自由基被清除时，其在519nm处的吸光度（A519nm），会相应地减少。
因此，通过检测A519nm值，可以判断DPPH·是否被清除。
如果某个样品能清除DPPH·，就具有一定的自由基清除活性（或称“抗氧化活性”）。
【操作图解】【计算公式】【说明】1. 样品溶液的浓度，也是可以调整的。
不过，为了方便实验，宜配高浓度（如3mg/mL）。
2. 操作图解中的用量，都是可以调整的，需要自行摸索。
3. 当样品溶液的加入量为0 μL 时，所测得的A值即为A0。
4. 实验最好做三个平行样，以减少误差。
【实例】二氢杨梅素的DPPH清除实验的结果二氢杨梅素样品：浓度：0.1mg/ml 溶剂：95%乙醇数据整理：二氢杨梅素原始数据：水溶液中“普用”自由基清除的实验操作图2019.6 【参考文献】Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PT IO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.【简介】“普用”自由基，原名是PTIO自由基。
它是一种能溶于水的自由基，所以，可以在水溶液中进行自由基的清除实验。
这比DPPH自由基清除实验更合理；因为DPPH自由基清除只能是有机溶剂（如乙醇、甲醇）中进行。
2024DPPH清除自由基方法
2024DPPH清除自由基方法2024年，一种新的清除自由基的方法被引入，该方法使用DPPH试剂。
DPPH（1,1-二苯基-2-三甲基-苦基-2-脒基），是一种广泛应用于生物医学研究中的人工氧化剂。
DPPH试剂呈紫色，并且可与捕获自由基反应后转变成无色。
因此，通过测量DPPH试剂的颜色变化，可以评估抗氧化物质对自由基的清除能力。
DPPH清除自由基方法是一种简单、快速且经济的方法。
它适用于各种类型的样品，包括天然产物、食品、药物和化妆品。
使用DPPH试剂测定抗氧化能力的方法主要有两种：溶液试剂法和固相试剂法。
溶液试剂法是最常用的DPPH清除自由基方法之一、在这种方法中，首先将DPPH试剂以适当浓度溶解在溶剂中，通常使用甲醇或乙醇。
然后，将样品与DPPH溶液混合，反应一定时间。
在反应过程中，DPPH试剂将与样品中的抗氧化物质反应，使DPPH试剂转变为无色。
通过测量反应溶液的吸收光谱或测定其吸光度的变化，可以计算出样品的清除自由基能力。
固相试剂法是一种近年来发展起来的新方法。
在这种方法中，固定DPPH试剂在固相载体上，通常使用硅胶或其他吸附剂。
样品溶液被滴加到载体上，自由基会与固相DPPH试剂发生反应，并转变成无色。
然后，通过测量吸附剂的颜色变化或对比吸附剂的吸光度，可以确定样品的清除自由基能力。
DPPH清除自由基方法的优点之一是它不需要复杂的仪器设备，因此可以应用于各种实验室条件。
此外，DPPH试剂的制备相对简单，价格也相对较低。
这使得DPPH清除自由基方法成为研究抗氧化剂的吸引人选择。
然而，DPPH清除自由基方法也存在一些限制。
首先，DPPH试剂只能评估清除自由基的能力，而不能提供有关抗氧化物质的详细信息。
此外，该方法不能区分不同类型的自由基，因此不能用于研究具体自由基类型的清除能力。
最后，溶液试剂法和固相试剂法都需要一定时间的反应才能得到准确的结果，这可能会造成实验中的误差。
总的来说，DPPH清除自由基方法是一种简单有效的方法，用于评估样品的抗氧化能力。
抗氧化活性测定方法
抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。
抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。
本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。
通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。
实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。
实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。
2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。
3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。
4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。
三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。
该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。
实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。
不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。
同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。
4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
2、ABTS 自由基清除实验20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。
加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。
ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3、超氧阴离子清除实验采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
dpph自由基清除原理
dpph自由基清除原理：
本研究以枇杷酵素为研究对象，mp127～129度(分解)，例如维生素E 和β胡萝卜素可以保护细胞膜；维生素C可以排出细胞内的自由基等等，a、b两个同类量相除又可叫做，用无水乙醇配制成004mg/mL 的DPPH溶液。
分别取2mL不同浓度（2，DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基其醇溶液呈紫色且需低温避。
ABTs经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABT，DPPH自由基清除原理[12>抗氧化剂与DPPH反应DPPH是一种稳定的自由基并将其转化为11二苯基2(246三硝基苯基)肼。
自由基与清除1什么叫自由基清除剂：所谓的自由基清除剂即抗氧化剂，在517nm处有一强吸收。
作为一种稳定的自由基DPPH可以捕获(“清除”)其他的自由基。
的后项除数b。
除号相当于号。
DPPH自由基清除原理[12>抗氧化剂与DPPH反应DPPH是一种稳定的自由基并将其转化为11二苯基2(246三硝基苯基)肼，DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，被除数a前项的后项除数b，发现缓冲液选择醋酸钠/醋酸（PH=36）时是检测不出结果的，常见的自由基有DPPH·、OH·、ABTS+·、O2，原理:DPPH自由基有单电子在517nm处有一强吸收其醇溶液呈紫色的特性，结论，DPPH法名称:1，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，中文名：22联氮二(3乙基苯并噻唑6磺酸)二铵盐别名：22’连氮基双(3乙基苯并二氢噻唑啉6磺酸)分子式：C18H24N6O6S4分子量：54868ABTS法是
使用最广泛的间接检测方法，当有自由基清除剂存在时由于与其单电子配道对而使其吸收逐渐消失其褪色程与其接受的。
抗氧化活性研究方法
抗氧化活性研究方法引言：氧化反应是指分子或原子失去电子，而还原反应是指分子或原子获得电子。
由于氧化反应产生的自由基具有高度活性，能够对细胞结构和功能造成损害，导致多种疾病的发生。
因此，研究抗氧化活性及其机制对于预防和治疗这些疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的抗氧化活性研究方法。
一、DPPH自由基清除能力测定法DPPH自由基清除能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色自由基，其颜色随着氧化程度的增加而减弱。
在该方法中，将待测样品与DPPH溶液混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够清除DPPH自由基，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。
二、还原能力测定法还原能力测定法是通过测定待测样品对还原剂的还原能力来评估其抗氧化活性。
常用的还原剂包括铁离子、铜离子等。
在该方法中，将待测样品与还原剂混合，通过测定混合液的吸光度变化或还原剂浓度的变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够还原还原剂，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降或还原剂浓度的降低。
三、氧化脂质抑制能力测定法氧化脂质抑制能力测定法是通过测定待测样品对氧化脂质的抑制能力来评估其抗氧化活性。
常用的氧化脂质包括脂肪酸、脂肪油等。
在该方法中，将待测样品与氧化脂质混合，通过测定混合液中脂质的氧化程度来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够有效抑制氧化脂质的形成。
四、超氧阴离子清除能力测定法超氧阴离子是一种常见的自由基，具有较高的活性。
超氧阴离子清除能力测定法是通过测定待测样品对超氧阴离子的清除能力来评估其抗氧化活性。
常用的超氧阴离子产生体系包括NBT（硝基蓝盐）-NADH（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸）体系、XTT（二苯基四唑盐）体系等。
在该方法中，将待测样品与超氧阴离子产生体系混合，通过测定混合液的吸光度变化来评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性强的样品能够有效清除超氧阴离子，使其浓度降低，从而导致吸光度的下降。
新版dpph自由基清除实验-实验流程图-操作图解-李熙灿-Xican Li
1 DPPH 自由基清除/PTIO 自由基清除实验：实验流程图2018.4【前言】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS ，Reactive oxygen species ）和活性氮（RNS ，Reactive nitrogen species ）。
ROS 主要有羟基自由基·OH ，过氧自由基(·O 2-)，脂质过氧自由基(LOO ·)等；RNS 主要有一氧化氮（·NO ）等。
这些ROS 和RNS 如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。
许多植物（特别是中药），对ROS 和RNS 都有较强的清除作用，这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。
为了评价抗氧化活性的强弱，生物化学家建立了一系列的评价方法。
最常见的是DPPH 自由基清除法。
DPPH 自由基结构如下： NH N O 2N O 2NNO 2.其全称有数个：（1）1,1-二苯基-2-三硝基苯肼基自由基；（2）1,1-二苯基-2-苦肼基自由基；（3）2,2-二苯基-1-苦肼基自由基；（4）2,2-二苯基-1-三硝基苯肼基自由基；（5）α,α-二苯基-β-苦肼基自由基。
尽管如此，其简称都是“DPPH 自由基”。
RNS 和ROS 都是不稳定的（如·OH ，·O 2-， LOO ·，·NO ），很难直接评价。
不过，DPPH 自由基较稳定，因为N 原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。
稳定的DPPH 自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在519 nm 范围有最大吸收峰。
当向DPPH 自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，深紫色的DPPH 自由基被还原成黄色DPPH-H 分子，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。
当DPPH 自由基与抗氧化剂反应后，519nm 波长处的吸收值降低，其降低的程度与接收的电子（抗氧化剂清除自由基活性）呈定量关系，可以用分光光度计测定。
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100
DPPH Inhibition %
Trolox BHT Maቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnolol
80 60 40 20 0 0.000 0.004 0.008 0.012 0.016 Concentration mg/mL 0.020
A
NO2
方法大致与 1.4 相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行 数据后，都要重测一次 A0. [实验结果] 清除率（抑制率）的计算公式：
A A Inhibition % = 0 A0
100%
[实例]厚朴酚magnolol的DPPH清除率曲线：(图中Trolox和BHT为阳性对照组)
O2N N N O2N
当 DPPH 自由基被清除，其最大吸收波长 519nm 处的吸光度 A 值随之减小。DPPH 这种稳定的自由基 为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH 测试液的配制 取 DPPH 1mg 溶于约 20mL 溶剂（乙醇、95 乙醇或甲醇）中，超声 5min，充分振摇，务使上下各部分 均匀。取 1mL 该 DPPH 溶液，在 519nm 处测 A 值，使 A＝1.2-1.3 之间最佳。该 DPPH 溶液最好避光保存， 3.5 小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成 1mg/mL 浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选 95 乙醇或无水乙醇，如不溶可用 DMSO。 1.3 预试 取 DPPH 溶液 2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色 情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置 5 个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到 200μL 时，DPPH 溶液颜色基本褪去，则 100μL 为该样品液的最 大用量。其用量梯度宜设为 40、80、 120 、160、200μL。 1.4 测量 A0 值的测量：取 DPPH 溶液 2 mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加 95 乙醇（或无水乙醇）1mL，充 分混合，测 A 值（519nm），此 A 值为 A0（A0 多在 0.7-0.9 之间）。 A 值的测量：取 DPPH 溶液 2mL 加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液 xμL （x 是根据 1.3 预试 结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95 乙醇（或无水乙醇），混合，静置 30 分钟后，测 A 值 （519nm）。如：某样品的用量梯度为 40、80、 120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 样品液 40μL 80μL 1200μL 160μL 200μL 1.5 正式测量 95乙醇（或无水乙醇） 960μL 920μL 880μL 840μL 800μL 加样表 DPPH测试液 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 总体积 3mL 3mL 3mL 3mL 3mL
DPPH 自由基清除法
李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即 1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在 多个吸电子的-NO2 和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。