(完整版)抗氧化试验方法
(完整版)抗氧化试验方法
一、试验方法1、DPPH自由基清除率的测定本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
体外抗氧化实验操作步骤,包括配制试剂(完整资料).doc
【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。
（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。
取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。
以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。
注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。
2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。
3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。
4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。
（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。
抗氧化实验方法
2.2.3 香青兰挥发油抗氧化活性的检测2.2.3.1 有机自由基DPPH ·清除能力的测定（1）实验试剂的配制DPPH ·无水乙醇溶液：称取19.72mg DPPH ，用无水乙醇定容至500ml ，得到浓度为0.1mmol/L 的DPPH 溶液。
样品：吸取30μl 的挥发油，加入3.56ml 无水乙醇溶解挥发油；再将此溶液按照2倍梯度稀释至28倍。
（2）有机自由基DPPH ·清除能力的测定向100μl DPPH ·乙醇溶液中加入不同浓度的香青兰挥发油及无水乙醇使总体积达到200μl 。
振荡器混匀后，室温，避光放置30min 后，在518nm 处测定吸光度，平行测定3次，计算清除率。
%100)(0210⨯--=A A A A 清除率 式中：A 0--DPPH ·溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度A 1--DPPH ·溶液100μl +样品溶液100μl 的吸光度A 2--样品溶液100μl +无水乙醇100μl 的吸光度公式中引入A 2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.2.3.2 超氧阴离子O 2-·清除能力测定（1）实验试剂的配制Tris-HCl 缓冲液：量取2.1ml 浓HCl ，加蒸馏水定容到250ml ，得到0.1mol/LHCl 溶液；称取三羟甲基氨基甲烷3.0285g ，加蒸馏水溶解，再加入114.5ml 0.1mol/LHCl 溶液，用蒸馏水定容至500ml 得pH=8.2浓度为50mmol/L 的Tris-HCl 缓冲液液。
邻苯三酚溶液：称取37.833mg 邻苯三酚，用0.01mol/LHCl 溶液溶解定容至500ml ，得浓度为0.3mmol/L 的邻苯三酚溶液。
样品：吸取挥发油100μl ，加3.0ml 无水乙醇稀释，再将此溶液按2倍梯度稀释25倍。
（2）清除超氧阴离子O 2-·能力测定邻苯三酚自氧化速率V 0的测定：在试管中加入5ml pH 值为8.2的Tris-HCl 缓冲液，加入2ml 蒸馏水，于25℃恒温水浴中放置20分钟，再加入0.5ml 邻苯三酚溶液，立即混匀倒入比色杯中，用紫外分光光度计在325nm 处测定A 值，每反应30s 记录一组，共反应5min 。
抗氧化实验方法
附录抗衰老实验实验一：对超氧阴离子清除作用的测定（邻苯三酚自氧化法）一实验原理：超氧阴离子自由基产生体系模型:邻苯三酚在弱碱性(Tris-HCl 缓冲液，pH8.2)溶液中自身氧化分解产生超氧阴离子的反应为：在一定条件下，随着反应的进行，生成的超氧阴离子在体系中会不断积累，导致反应液的吸光度(299nm波长)在反应开始后5min之内随时间变化而线性增大。
因此在该时间内，于299nm处测定含被测物反应液的吸光度随时间的变化率, 并与空白液比较便可得出被测物抑制超氧阴离子积累的作用能力。
抑制率可根据下式计算：式中F O和F X分别表示空白液和被测液的吸光度随时间的变化率二实验仪器和试剂：1 主要仪器：紫外可见分光光度计，恒温水浴锅，10mL试管,分析天平。
2 主要试剂：待测液，弱碱性(Tris-HCl)缓冲液，邻苯三酚溶液，HCL溶液。
三试剂配制：1、Tris碱溶液：6.05g定容于500mL水中，形成0.1mol/L的Tris碱溶液。
2、0.1mol/L HCL溶液：1.0mL浓盐酸（36%，11.6mol/L）加入91.4mL水中。
3、Tris-HCL缓冲液（0.05mlo/L,pH8.2）：50mL的0.1mol/L的Tris碱溶液与22.9mL的0.1mol/L HCL溶液混合，定容至100mL。
4、25mmol/L 邻苯三酚溶液（焦性没食子酸）：将0.0315g邻苯三酚定容于10mL水中。
现配现用，4h内有效。
四实验方法：1、取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5ml于试管中，置于25℃水浴中预热20min；2、分别加入1ml不同浓度的试样和0.4mL,25mmol/L的邻苯三酚溶液（2.5 mmol/L邻苯三酚(由10 mmol/L HCl配制)0.4 ml），混匀后于25℃水浴中反应5min；3、加入8mol/L 盐酸1.0ml终止反应，以Tris-HCl缓冲液作参比，空白组以0.1 ml蒸馏水代替样品试液，在299nm处测定吸光度，计算清除率。
抗氧化实验方法
1还本力的测定之阳早格格创做样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐慢冲液（pH6.6）战2ml 1%的铁氰化钾溶液的混同液中.混同物正在50℃保温20min，而后正在反应混同物中加进2ml 10%的TCA，混同后以3000rpm离心10min，与上浑液2ml与2ml蒸馏火以及0.4ml 0.1%氯化铁正在反招考管中反应，10min后测定其正在700nm处的吸光值.吸光值越大标明还本力越强.注意：修议蛋黑浓度以5mg/ml安排变更，比圆2.5，5之类变更.然而简曲情况应根据吸光值大小而定.0.2mol/L pH6.6的磷酸盐慢冲液的配制睹附表.铁氰化钾溶液应衰拆正在棕色瓶中.比色皿的用法：可睹光(>400nm)用玻璃比色皿（即不标字母大概者标G的比色皿），紫中光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）.2 DPPH自由基扫除活性的测定将1.5ml样品液增加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混同，振荡，正在室温下搁置30min，而后正在波少517nm处检测（Ai）.扫除率估计公式为：空黑为1.5 ml 95%的乙醇加进1.5 ml蒸馏火调整.式中：Ac——对于照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏火正在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇正在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液正在517nm处的吸光值；注意：修议酶解液蛋黑浓度以2mg/ml 安排变更，如0.5,1,2,2.5之类变更，然而是简曲情况应视扫除率而定，最后截止应有扫除率大于50%战小于50%的情况.DPPH样品有毒，需戴心罩战脚套举止支配.而且DPPH试剂很高贵，用时注意俭朴.0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称与0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml.3 正在卵黄磷脂体系中抗氧化本领的测定以卵黄脂蛋黑为底物的LPO模型反应体系包罗:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS慢冲液补脚至2.0mL.对于照管除不加样液中其余试剂共前.将上述2种试管共时置37℃恒温火浴锅中保温培植1h.与出后，加进20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对于照管于3500r/min离心10min，与2.0mL上浑液，分别加进品量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液 1.0mL，加塞于100℃火浴15min，与出热却.空黑管以 2.0mLPBS溶液代替，正在532nm下测定吸光度，样品对于卵黄脂蛋黑LPO 的压制率表示为:SA(%)=(Ac一AS)/AC×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加进样品的吸光度注意：卵黄溶液不必时应搁置冰箱保存.酶解液蛋黑浓度以5mg/ml安排安排，然而简曲应视扫除率大小而定，对于酶解液蛋黑浓度举止安排.硫代巴比妥酸溶液需搁置于棕色瓶内保存.并以50m mol/L NaOH溶液配制.再正在50℃火浴溶解.FeSO4溶液应以棕色瓶衰拆.4 过氧化值的测定参照本食品教院林华娟等教授主编的食品分解真验道义一书籍.5 超氧阳离子自由基扫除率的测定邻苯三酚自氧化速率（V对于照）：对于照组战空黑对于照组加进4ml 蒸馏火（去离子火）战，0.1 mol/LTris-HCl 慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm 处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑对于照管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对于照.（V对于照正在0.05A/min~0.065A/min之间，可则应安排邻苯三酚加进量）样品自氧化速率（V样品）：样品组战空黑组均加进一定浓度的样品溶液4ml，0.1 mol/LTris-HCl慢冲溶液(pH8.2) 4.5ml，正在25℃火浴20min后，样品组加进0.2ml （大概0.3ml）3m Mol/L邻苯三酚溶液，空黑组以相共体积蒸馏火（去离子火）代替.震匀后赶快正在320nm处测定吸光值.赶快混匀并启初计时，每隔30 s读与吸光值,4 min后中断，以空黑管调整.做吸光度随时间变更的返回圆程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品，按下式估计样品对于超氧阳离子的压制率：式中：压制率(%)=(V对于照-V样品)/V对于照×100V对于照－对于照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)V样品－样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)动物真验资料：戴自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效验受到多种果素的效率，惟有正在死物体内具备抗氧化做用的物量才搞灵验的扫除体内爆收的自由基，才搞表示出一定的死物活性.由于体中抗氧化测定要领简单支配，周期短，果此评介一种物量的抗氧化效验往往最先采与体中抗氧化体系.然而体中抗氧化体系往往与人体内的死理环境出进太大，许多钻研截止标明采与体中要领评介灵验的抗氧化剂加进人体后却表示不出应有的抗氧化效验，果此抗氧化剂的抗氧化效验正在采与体中要领举止收端评介后应采与动物真验举止体内评介.人体正在仄常死理代开历程中会爆收少量的含氧自由基，如超氧阳离子、羟自由基、过氧化氢等，那些自由基通过自然存留于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维死素E组成的抗氧化系统去与消.果此，正在仄常状态下，体内自由基保护正在一定火仄并处于动向仄稳中，仄常量的自由基对于细胞的死少、团结、解毒等具备有益的效率，正在杀菌、免疫安排等圆里具备主动而要害的意思.然而，随着删龄大概正在某些病理状态下以及肌体受到创伤时，体内抗氧化酶活性下落，进而引导肌体代开非常十分而骤然爆收洪量活性氧自由基；大概由于肌体抗氧化物量缺乏，使促氧化剂与抗氧化剂之间的仄稳得常，以致自由基与机的一些死物大分子，如蛋黑量、核酸、脂量等爆收反应，死成洪量氧化物大概过氧化物，并进一步引起细胞牺牲战构制益伤.业已道明，氧化益伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉软化、神经退止性病变以及人类免疫缺陷病毒(HIV)熏染等均有稀切闭系.D-半乳糖诱导的亚慢性衰老模型是依照衰老的代开教道修坐的，其体制与糖代开混治[6]、D-半乳糖醇中毒[7]战活性氧自由基过剩有闭；稠稀钻研标明是死物体内含有半乳糖氧化酶，正在催化D-半乳糖时可爆收超氧阳离子自由基(O2·-)战H2O2；如果少久人为天赋予过量D-半乳糖，使肌体战细胞内自由基爆收过量，除了制成构制细胞曲交益伤中，还引导抗氧化酶活力下落战过氧化产品聚集，进而表示出与人类自然衰老相似的死化变更、免疫功能矮下、基果表黑与调控非常十分细胞繁殖力下落及细胞退化性衰变等.有钻研标明，D-半乳糖可落矮人胚肺两倍体成纤维细胞(HBS)，进而使该细胞SOD活力落矮战过氧化产品MDA删加，进而起到加速细胞老化的效率.本文正在前述章节已经标明，鹰嘴豆蛋黑酶解物具备体中抗氧化活性，然而其正在死物体内的效率效验尚不领会.为此本章采与D-半乳糖诱引导衰老小鼠动做模型，分别以小鼠的血浑、肝净战心净构制中的丙两醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苦肽过氧化物酶(GSH-Px)活性动做评介指标，探讨鹰嘴豆蛋黑酶解物正在死物体内的效率，为掀穿鹰嘴豆蛋黑酶解物对于体内过氧化状态的效率，明确其物量前提战相闭体制提供凭证.。
抗氧化实验方法
1还原力的测定样品2ml加到2ml L磷酸盐缓冲液和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中;混合物在50℃保温20min,然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA,混合后以3000rpm离心10min,取上清液2ml与2ml蒸馏水以及%氯化铁在反应试管中反应,10min后测定其在700nm处的吸光值;吸光值越大表明还原力越强;注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化,例如,5之类变化;但具体情况应根据吸光值大小而定;L 的磷酸盐缓冲液的配制见附表;铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中;比色皿的用法：可见光>400nm用玻璃比色皿即没有标字母或者标G的比色皿,紫外光时<400nm用石英比色皿即标Q字比色皿;2 DPPH自由基清除活性的测定将样品液添加到含mmol/L DPPH的95％乙醇中,混合,振荡,在室温下放置30min,然后在波长517nm处检测Ai;清除率计算公式为：空白为ml 95%的乙醇加入ml蒸馏水调零;式中：Ac——对照为ml DPPH溶液加上ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——样品液加上ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——样品液加上ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化,如,1,2,之类变化,但是具体情况应视清除率而定,最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况;DPPH样品有毒,需戴口罩和手套进行操作;而且DPPH试剂很昂贵,用时注意节约;mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取,用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml;3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液卵黄用等体积的,LPBS配成,使用前磁力搅拌10min mL、一定浓度的样品溶液、25m moll/LFeSO4溶液,用PBS缓冲液补足至;对照管除不加样液外其他试剂同前;将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h;取出后,加入20%,静置10 min后,与对照管于3500r/min离心10min,取上清液,分别加入质量分数为%硫代巴比妥酸TBA溶液,加塞于100℃水浴15min,取出冷却;空白管以溶液代替,在532nm下测定吸光度,样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为:SA%=Ac一AS/A C×100式中:Ac一不加样品的吸光度As一加入样品的吸光度注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存;酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整,但具体应视清除率大小而定,对酶解液蛋白浓度进行调整;硫代巴比妥酸溶液需放置于棕色瓶内保存;并以50m mol/L NaOH溶液配制;再在50℃水浴溶解;FeSO4溶液应以棕色瓶盛装;4 过氧化值的测定参照本食品学院林华娟等老师主编的食品分析实验讲义一书;5 超氧阴离子自由基清除率的测定邻苯三酚自氧化速率V对照：对照组和空白对照组加入4ml 蒸馏水去离子水和, mol/LTris-HCl缓冲溶液,在25℃水浴20min后,样品组加入或3m Mol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积蒸馏水去离子水代替;震匀后马上在320nm处测定吸光值;迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白对照管调零;作吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对照;V对照在min~min之间,否则应调整邻苯三酚加入量样品自氧化速率V样品：样品组和空白组均加入一定浓度的样品溶液4ml, mol/LTris-HCl缓冲溶液,在25℃水浴20min后,样品组加入或3m Mol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积蒸馏水去离子水代替;震匀后马上在320nm处测定吸光值;迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白管调零;作吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品,按下式计算样品对超氧阴离子的抑制率：式中：抑制率%=V对照-V样品/V对照×100V对照－对照组邻苯三酚自氧化速率ΔA/minV样品－样品组邻苯三酚自氧化速率ΔA/min动物实验资料：摘自鹰嘴豆:抗氧化剂的抗氧化效果受到多种因素的影响,只有在生物体内具有抗氧化作用的物质才能有效的清除体内产生的自由基,才能表现出一定的生物活性;由于体外抗氧化测定方法容易操作,周期短,因此评价一种物质的抗氧化效果往往首先采用体外抗氧化体系;但体外抗氧化体系往往与人体内的生理环境相差太大,许多研究结果表明采用体外方法评价有效的抗氧化剂进入人体后却表现不出应有的抗氧化效果,因此抗氧化剂的抗氧化效果在采用体外方法进行初步评价后应采用动物实验进行体内评价;人体在正常生理代谢过程中会产生少量的含氧自由基,如超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等,这些自由基通过自然存在于体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶及抗氧化剂如抗坏血酸、维生素E组成的抗氧化系统来消除;因此,在正常状态下,体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡中,正常量的自由基对细胞的生长、分裂、解毒等具有有益的作用,在杀菌、免疫调节等方面具有积极而重要的意义;然而,随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时,体内抗氧化酶活性下降,从而导致机体代谢异常而骤然产生大量活性氧自由基；或由于机体抗氧化物质不足,使促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡失常,致使自由基与机的一些生物大分子,如蛋白质、核酸、脂质等发生反应,生成大量氧化物或过氧化物,并进一步引起细胞死亡和组织损伤;业已证明,氧化损伤与衰老、肿瘤、糖尿病、动脉硬化、神经退行性病变以及人类免疫缺陷病毒HIV感染等均有密切关系;D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是按照衰老的代谢学说建立的,其机制与糖代谢紊乱6、D-半乳糖醇中毒7和活性氧自由基过剩有关；众多研究表明是生物体内含有半乳糖氧化酶,在催化D-半乳糖时可产生超氧阴离子自由基O2·-和H2O2；如果长期人为地给予过量D-半乳糖,使机体和细胞内自由基产生过量,除了造成组织细胞直接损伤外,还导致抗氧化酶活力下降和过氧化产物积累,从而表现出与人类自然衰老相似的生化变化、免疫功能低下、基因表达与调控异常细胞繁殖力下降及细胞退化性衰变等;有研究表明,D-半乳糖可降低人胚肺二倍体成纤维细胞HBS,从而使该细胞SOD活力降低和过氧化产物MDA增多,从而起到加速细胞老化的作用;本文在前述章节已经表明,鹰嘴豆蛋白酶解物具有体外抗氧化活性,但其在生物体内的作用效果尚不清楚;为此本章采用D-半乳糖诱导致衰老小鼠作为模型,分别以小鼠的血清、肝脏和心脏组织中的丙二醛MDA含量、超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性作为评价指标,探讨鹰嘴豆蛋白酶解物在生物体内的作用,为揭示鹰嘴豆蛋白酶解物对体内过氧化状态的影响,明确其物质基础和相关机制提供证据;。
抗氧化活性测定方法
抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。
抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。
本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。
一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。
通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。
实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。
实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。
2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。
3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。
4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。
三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。
该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。
实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。
2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。
3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。
4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。
以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。
不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。
抗氧化活性实验方法
抗氧化活性实验方法（体外实验）之巴公井开创作1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH 溶液。
分别取2mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。
取上清液于517nm处测吸光值。
用Vc作为阳性对照。
样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。
2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃ FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。
Vc作为阳性对照。
3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。
EDTA为阳性对照。
样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe 2+()1201100%A A A -=-⨯螯合率 A 0—1mL 蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值； A 1—样品溶液反应后的吸光值；A 2FeCl 2溶液后的吸光值。
4、超氧自由基（O 2-）清除率的测定采取邻苯三酚自氧化法测定。
取50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5mL ，置25℃水浴中保温20min ，分别加入1mL 样品溶液和0.4mL 25mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min ，加入1mL 8mmol/L HCl 终止反应，于299nm 处测定吸光度（A x ），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。
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一、试验方法
1、DPPH自由基清除率的测定
本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。
1.1实验原理
1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。
当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。
1.2溶液的配制
0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。
1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。
按下列公式计算DPPH自由基清除率。
DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100%
公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值
A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值
将实验重复三次，求得清除率的平均值。
2、总的抗氧化活性的测定
总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。
2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。
抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。
此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。
2.2溶液的配制
样品液:同上
磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀，即得。
2.3实验步骤
分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml 离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵）。
混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90 min、120 min、150 min。
放冷至室温，695nm处测吸光度值。
以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。
BHT做为阳性对照。
将实验重复三次，求平均值。
三、还原力的测定
3.1 实验原理
以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6，再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3，由700nm处吸光
值变化检测还原力大小。
吸光值愈高表示样品的还原力也就越强。
3.2 溶液的配制
3.2.1样品的配制：用乙醇配制浓度分别为0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml各样品溶液，浓度分别为0.06,0.12,0.18,0.24,0.30mg/mlBHT溶液，Vc溶液。
3.2.2 0.2mol/LPBS，PH=6.6:
A溶液:0.2mol/L Na2HPO4溶液:称Na2HPO4.2H2O35.63g，定容至1000mL;
B溶液: 0.2mol/L NaH2PO4溶液:称NaH2PO4.2H2O31.21g，定容至1000mL;
取A溶液37.5mL加B溶液62.5mL，即为pH=6.6的0.2mol/L PBS。
3.3 实验步骤
不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，加入0.2moL/L 的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5 mL，得混合物于50℃水浴保温20分钟，然后加入2.5ml10%（w/v）三氯乙酸溶液,混合溶液3000rpm 离心10min，精密吸取上清液2.5ml，加入2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1%的三氯化铁溶液，在700nm处测吸光度（吸光度值越大，还原力越强）。
BHT做为阳性对照。
将实验重复三次，求平均值。