酶的高通量筛选
黑曲霉高产纤维素酶菌株的高通量筛选
孔间和板 间酶活力值 的变异 系数均在 ５ 以下 ， 重现性和稳定性均能够满足高通量 复筛 的需要 ； 经过对所得菌株 固 态发酵条件优化后发现 ， 当碳源为稻草粉和麸皮 的混合物 ， 氮源为 ２５ 硫酸铵添加量 为 １５ 时 的玉米 浆作为生 ． ．
长促进剂 ， 加水量 为 ３ ／ １ ０ｇ 的 培养 基产 酶 效果 最 好． 最 佳 培养 条 件下 ， 分 泌纤 维 素 滤纸 酶 活力 为 ５ｍＬ （０ ） 在 其
６ １ ８ｗａ ｕ ｊｃｅ ｏｍｕａｉｎｉｖ ｌｉｇｉ ａ ｉ ｉｎｗｉ ｌ ａ ｉｌ ｇ ｔａ ｄｓ ｂ ｅｕ ｎｌ ｔ ｌ ｔｏ ０ ０ ｓｓ ｂｅｔｄｔ ｔｔ ｏｖｎ ｒｄａ ｏ ｔ ｕｔ ｖｏｅ ｌ ｈ ｎ ｕ ｓｑ ｅ ｔ ｗｉ ｅｅ ｒｎ ｏ ｎ ｒ ｔ ｈ ｒ ｔｉ ｙ ｈ ｃ
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化学行业中的高通量筛选技术使用教程
化学行业中的高通量筛选技术使用教程高通量筛选技术（HTS）是化学行业中一种重要的实验方法，它可以高效地筛选大量化合物，用于寻找新的药物、材料或化学品。
本文将为您介绍高通量筛选技术的原理、应用、操作步骤和注意事项，帮助您更好地理解和应用这一技术。
1. 高通量筛选技术的原理高通量筛选技术是指通过自动化系统对大量化合物进行筛选，以寻找具有特定活性的化合物。
其核心原理是将化合物与靶分子进行反应，并通过测量产生的信号来评估其活性。
这些信号可以是光谱、荧光、吸收、发射等，也可以是酶活性或细胞增殖等生物学响应。
2. 高通量筛选技术的应用高通量筛选技术广泛应用于药物研发、材料研究和农药开发等领域。
在药物研发中，它可以加速新药发现的过程，降低研发成本。
在材料研究中，它可以快速筛选出具有特殊性能的材料。
在农药开发中，它可以高效地评估候选农药的活性和安全性。
3. 高通量筛选技术的操作步骤（1）实验准备：准备待测试的样品、反应体系和相关设备。
（2）样品加载：将待测试的化合物加载到高通量筛选平台的微孔板中。
通常使用多通道移液器进行自动化操作，保证每个样品的准确性和一致性。
（3）靶分子反应：将待测化合物与靶分子进行反应。
可以使用多种反应方式，如酶活性测定、光谱测定等。
（4）信号检测：使用相关设备对反应后的样品进行测量，并记录下产生的信号。
这些设备通常包括光谱仪、荧光读数器、显微镜等。
（5）数据分析：对测得的数据进行分析和处理，评估样品的活性。
可以使用统计学方法、机器学习等技术进行数据处理和筛选结果的判定。
（6）筛选结果验证：对于通过高通量筛选技术筛选出的潜在活性化合物，进行进一步的验证和确认。
4. 高通量筛选技术的注意事项（1）实验条件的控制：在进行高通量筛选实验时，需要严格控制实验条件的一致性和稳定性，以保证得到可靠的结果。
例如，温度、反应时间、pH值等参数应保持一致。
（2）样品来源的选择：选择合适的样品来源非常重要，这可以是天然产物、合成化合物或已知活性化合物，以增加筛选成功的概率。
酶学靶点筛选
酶学靶点筛选酶学靶点筛选是药物研发过程中的重要环节，通过筛选出适合作为药物靶点的酶，从而为疾病治疗提供有力的靶向药物。
本文将从酶学靶点的定义、筛选方法和应用等方面进行阐述。
一、酶学靶点的定义酶学靶点是指在疾病发生发展中起关键作用的酶，通过干预酶的活性或表达水平，可以调控疾病的进展。
酶学靶点的选择需要满足多个条件，包括在疾病发生发展中的关键作用、与疾病相关的基因或蛋白表达异常等。
1. 生物信息学筛选法：通过对基因组数据进行分析和比对，筛选出与疾病相关的酶基因。
这种方法可以通过大数据分析和模型预测，快速筛选出候选靶点，为后续实验提供指导。
2. 高通量筛选法：利用高通量筛选技术，通过快速筛选大量化合物，寻找能够与目标酶结合的潜在药物。
其中包括酶抑制剂筛选法、酶活性检测法等。
3. 基于代谢组学的筛选法：通过研究疾病相关的代谢通路，找到与酶相关的代谢物，从而筛选出潜在的靶点。
这种方法可以从代谢组的角度揭示疾病的发生机制，并辅助靶点筛选。
三、酶学靶点筛选的应用1. 药物研发：酶学靶点筛选可以为药物研发提供靶点的选择和优化。
通过选择合适的酶学靶点，可以设计出更加有效的药物，提高药物的疗效和减少副作用。
2. 疾病治疗：酶学靶点筛选可以为疾病治疗提供有力的靶向药物。
通过干预酶的活性或表达水平，可以调控疾病的进展，提高治疗效果。
3. 个体化治疗：酶学靶点筛选可以为个体化治疗提供依据。
通过对患者基因组和代谢组的分析，可以筛选出与患者疾病相关的酶学靶点，为个体化治疗提供指导。
四、总结酶学靶点筛选是药物研发过程中的重要环节，通过筛选出适合作为药物靶点的酶，可以为疾病治疗提供有力的靶向药物。
通过生物信息学筛选法、高通量筛选法和基于代谢组学的筛选法等多种方法，可以快速高效地找到潜在的酶学靶点。
酶学靶点筛选的应用领域广泛，包括药物研发、疾病治疗和个体化治疗等。
未来，随着技术的不断进步，酶学靶点筛选将在药物研发和疾病治疗中发挥越来越重要的作用。
高通量筛选技术在化学研究中的应用
高通量筛选技术在化学研究中的应用随着科技的不断进步，化学研究的方法也随之发展。
其中，高通量筛选技术作为一种新兴的快速筛选方法，被广泛应用于化学研究领域。
本文将介绍高通量筛选技术的基本原理、应用场景以及未来发展趋势。
一、高通量筛选技术的基本原理高通量筛选技术是一种高效的快速筛选方法，其基本原理是通过大量的样品组合进行快速筛选，从中找出所需的化合物。
根据筛选原理的不同，高通量筛选技术可分为无酶、酶促和细胞筛选三种。
1.无酶筛选：无酶筛选是指通过化合物对蛋白的直接作用，来筛选出希望的小分子化合物。
这种方法通过直接和蛋白相互作用，从而寻找出具有生物活性的小分子化合物。
2.酶促筛选：酶促筛选是将蛋白放置在一组化合物中，筛选具有特定活性的化合物。
在这个过程中，蛋白质由于其特定结构的缘故，可以将其高度选择性地与一种化合物相互作用。
因此，可以通过酶促筛选寻找到具有特定活性的小分子化合物。
3.细胞筛选：细胞筛选是通过将蛋白置入细胞，筛选出具有特定功能的化合物。
在这个过程中，化合物不仅仅与蛋白相互作用，还与细胞通信发生相互作用。
因此，细胞筛选可以扩大筛选的范围，不仅可以寻找具有特定活性的小分子化合物，还可以寻找细胞内的具有活性的化合物。
二、高通量筛选技术的应用场景高通量筛选技术在化学研究与药物开发中具有非常广泛的应用场景。
其中，应用场景主要包括以下几个方面。
1.寻找小分子化合物：高通量筛选技术可以用于寻找具有特定活性的小分子化合物。
它可以通过与阻止病原体感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等多种特定功能的化合物相互作用，筛选出具有药物作用的化合物。
2.寻找新药靶点：高通量筛选技术可以在大量不同化合物中筛选出特定的靶点，从而发现新的药物靶标。
这是药物研发的重要环节，因为通过发现新的药物靶标，能够开发出更多的药物。
3.寻找化学反应：高通量筛选技术不仅可以用于寻找小分子化合物和新药靶点，还可以用于寻找化学反应。
在这个过程中，高通量筛选技术通过反应物的不同组合以及反应条件的不同，筛选出具有特定化学反应的化合物。
淀粉酶产生菌的筛选注意事项
淀粉酶产生菌的筛选注意事项淀粉酶是一种重要的酶类，在食品加工、制药和生物技术等领域有着广泛的应用。
而淀粉酶产生菌则是淀粉酶发酵的关键微生物，因此筛选合适的淀粉酶产生菌对于淀粉酶的生产至关重要。
下面将从以下几个方面介绍淀粉酶产生菌的筛选注意事项。
一、筛选前的准备工作1. 确定筛选目标：在进行淀粉酶产生菌筛选之前，需要明确自己所需要的菌株特性，如产量、稳定性、适应性等。
2. 了解基础知识：在筛选之前需要对淀粉酶发酵过程中微生物代谢途径、营养需求等基础知识有一定了解，以便于更好地设计实验方案。
3. 准备培养基：根据所需菌株特性选择合适的培养基，并进行消毒和质量检测。
二、筛选方法选择1. 传统方法：传统方法包括平板法、液体培养法等，这些方法简单易行，但筛选效率较低。
2. 高通量筛选：高通量筛选方法可以同时对大量菌株进行筛选，具有快速、高效的优点，但需要较高的设备和技术要求。
3. 分子生物学方法：分子生物学方法通过扩增和检测目标基因来确定淀粉酶产生菌，具有高灵敏度、高特异性和快速等优点。
三、菌株的来源选择1. 野生菌株：采集自然环境中的微生物进行筛选，可以获得多样性较高的菌株，但需要进行适应性培养和改良。
2. 已知菌株：已知菌株包括文献报道的、已经商业化应用的等，在筛选时可以优先选择这些已知稳定可靠的菌株。
3. 自体分离：自体分离是指从淀粉酶发酵中分离出产酶微生物进行筛选，这种方法具有与发酵过程相适应、稳定性好等特点。
四、实验设计与操作注意事项1. 设计合理实验方案：实验方案需要考虑到微生物营养需求、培养条件等因素，同时需要进行对照实验和重复实验以确保结果的可靠性。
2. 严格控制操作条件：操作过程中需要严格控制温度、pH值、氧气含量等因素，以确保微生物的正常生长和代谢。
3. 合理选择筛选指标：筛选指标需要与淀粉酶产生相关，如淀粉酶活力、淀粉酶产量等。
4. 筛选后的确认和评价：在筛选出淀粉酶产生菌后，需要进行进一步的确认和评价，包括菌株稳定性、代谢途径分析等。
医药研发中的药物筛选方法
医药研发中的药物筛选方法在医药研发领域，药物筛选是一项至关重要的环节。
通过筛选能够找到具有潜在药效的化合物，为新药的研发打下基础。
本文将会介绍几种常见的药物筛选方法，并探讨它们的优缺点。
一、高通量筛选法高通量筛选法（High-Throughput Screening, HTS）是一种大规模进行药物筛选的方法。
这种方法利用自动化技术，可以在相对短的时间内对数以千计的化合物进行测试。
通常，高通量筛选法涉及到一系列的检测步骤，例如酶反应的检测、细胞增殖的检测等。
优点：高通量筛选法具有高效性和快速性的特点，可以在较短时间内快速筛选出具备潜在药效的化合物。
缺点：高通量筛选法的主要缺点是成本较高。
另外，它的结果也需要进一步验证，因为只有少部分通过筛选的化合物能够真正展现出治疗效果。
二、虚拟筛选法虚拟筛选法（Virtual Screening）是一种通过计算机模拟来进行药物筛选的方法。
通过使用分子建模和计算机算法，虚拟筛选法可以预测某个分子与靶点之间的结合情况，并推断其药效。
优点：虚拟筛选法具有速度快、成本低、无需实际化合物的优点。
同时，虚拟筛选能够产生全面的候选化合物，为下一步的实验设计提供指导。
缺点：虚拟筛选法的主要缺点是预测结果的准确性相对较低，需要进一步的实验验证。
三、化学结构筛选法化学结构筛选法（Chemical Structure Screening）是一种基于分子结构相似性的药物筛选方法。
通过比较已知药物与候选化合物之间的结构相似性，化学结构筛选法可以快速识别候选化合物的潜在活性。
优点：化学结构筛选法具有较高的可信度和相对快速的速度。
相对于其他方法，它对大规模化合物的筛选也更具优势。
缺点：化学结构筛选法存在一定的局限性，仅能识别与已知药物结构相似的候选化合物，并无法预测其药效。
四、靶点筛选法靶点筛选法（Target Screening）是一种通过筛选目标蛋白质与化合物相互作用的方法。
该筛选方法能够评估化合物与特定靶点之间的相互作用，进而判断其是否具有潜在的药效。
什么是高通量筛选技术
什么是高通量筛选技术高通量筛选(high—throughout screening)是近年来迅速发展起来的药物筛选技术。
高通量药物筛选就是应用分子细胞水平的药物活性评价方法（模型），通过自动化手段，对大量样品进行生物活性或药理作用的检测，发现新药的过程。
高通量药物筛选的规模至少为每日筛选数千个样品。
同时它通过运用基因科学、蛋白质科学、分子药理学、细胞药理学、微电子技术等多学科理论和技术，以及与疾病相关的酶和受体为作用靶点。
对天然或合成化合物进行活性测试，并在此基础上进行筛选。
高通量筛选具有快速、高效、经济、高特异性等优点，其中所用的样品量甚少的特点尤其适用于天然化合物的活性筛选。
高通量筛选可以根据待测样品的种类分为非细胞相筛选、细胞相筛选、生物表型筛选。
其中非细胞相筛选常用的方法有Microbead—FCM 联合筛选、放射免疫性检测、荧光检测(FA)、闪烁接近检测、酶连接的免疫吸附检测(ELISA)等；细胞相筛选常用的方法有选择性杀死策略、离子通道检测、报告基因检测等；生物表型筛选可以有目的敲除或屏蔽掉某些未知功能的基因等等。
高通量筛选在抗病毒药物筛选中有很大的应用，介绍一些抗病毒药物筛选方法：利用亲合闪烁分析对HIV逆转录酶活性测定、HCV NS5B 活性测定、HCV NS3(nonstructural protein 3，NS3)解旋酶活性的测定；利用荧光共振能量转移对SARS—CoV病毒3CL 蛋白酶活性测定；抗病毒药物的其它高通量筛选模型如病毒与宿丰细胞结合的细胞模型、HCV NS3／4A蛋白酶活性测定、HIV整合酶(integrase，IN)活性的测定等等。
高通量筛选体内药动学模型中传统的药动学研究以测定药物在体内的浓度及分布为主要手段。
高通量筛选体外药动学模型中常用的筛选模型建立在组织、器官水平和细胞及亚细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接体现药物的基本作用机制。
高通量筛选的体内和体外筛选模型是互为补充、相辅相成的。
第十章 新酶的发现与筛选
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微生物作为酶源的优点
（ 2 ）培养简便、繁殖快、发酵周期短， 能控制培养条件大幅度提高酶的产量。 （ 3 ）微生物易变异，可采用各种遗传变 异手段，培育出新的、更理想的菌株。
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第10章 新酶的发现与筛选
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二、 微生物新酶的获取途径
购买商品化的酶
购买产酶微生物
获取途径 从自然界筛选产酶微生物
第10章 新酶的发现与筛选
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示例1 基因组序列搜索
查找基因组序列：Kluyveromyces lactis 搜索基因组序列中的还原酶 reductase
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第10章 新酶的发现与筛选
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2、 基因挖掘法
基因组狩猎原理
以已知酶为探针，与整个数据库的酶进行比 对，获得中等相似度（ 50%~70% ）的酶进行克 隆表达，通过功能筛选并获得所需要的酶。
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第10章 新酶的发现与筛选
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示例2 数据库比对寻找相似酶序列
酶探针的氨基酸序列
NADPH-dependent alpha-keto amide reductase [Kluyveromyces marxianus]
GenBank: BAP73216.1
1 61 121 181 241 301 MTNQKFFTLS AETYKTYPEL IHSPFFDKDL FSPFLQNQTP QVLLLWVYKR YTKYNSEAQK NGNKIPAVAV GAALKETKKP NIDLETAWKQ GIVEFSQKND GILPVTTSAK VGTGTKWYKA REEIFITDKF LEELYKSGKA ILLEAYSPLG IERIKQAQDI EETDATFSQE SSLHKISEDP KNIGVSNFTV PLQKKPADAD FSFDLTEEEV LTDIVKLSLD KSALETALKK EDLKKVLAIA QQPFYQYLKE KKITDLGLQH TVPGIVHIDA LGVDYVDLYL EIKPQVNQIE LSEKYNKTEA EPVRLYWVDF
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大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。 基于这种技术的检测方法简单快捷，结果准确容 易实现数字化，可以做到实时监控，得到了广泛 的应用。 但这类底物通常不够稳定，反应特异性差，反应 速度快，比普通底物高出几个数量级，不适用于 一些难转化的和难合成的反应以及粗酶催化的反 应和一些条件剧烈的反应，如高温，高的pH值等。
随机插入/去除技术 半理性外显子重组技术 合成重组技术 计算机辅助设计技术
酶分子的定向进化（小结）
定向进化不仅是一个酶分子改造的良好工具，也是探索和 研究酶蛋白构效关系的良好工具。 随着各种基因技术的应用和发展，究方向是更有效的突变技术和构建更简洁的突 变体库的技术。 突变体的筛选技术仍然是主要技术瓶颈，当前除了要继续 发展本文介绍的各种结合酶催化功能的高通量筛选技术， 还要进一步完善各种与重组表达技术相结合的蛋白筛选技 术和蛋白展示库技术。尤其是一些无明显表型的突变体的 筛选还需给与更多的研究与重视 。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要： (1) 产生包含大量带有微 量有利突变的突变体的文 库; (2) 突变体应能在适当的 微生物(如大肠杆菌或酵母 菌) 体内进行功能的表达; (3) 必须有一种灵敏的筛 选方法,能反映出由一个氨 基酸的置换而F, Tiss A, Rivière C, Verger R: Methods for lipase detection and assay: a critical review. Eur J Lipid Technol 2000, 133-153. A comprehensive and detailed review about all lipase assays involving carboxylic ester hydrolysis 11Beisson F, Ferté N, Nari J, Noat G, Arondel V, Verger R: Use of naturally fluorescent triacylglycerols from Parinari glaberrimum to detect low lipase activities from Arabidopsis thaliana seedlings. J Lipids Res 1999, 40:2313-2321. 12Klein G, Reymond J-L: Enantioselective fluorogenic assay of acetate hydrolysis for detecting lipase catalytic antibodies. Helv Chim Acta 1999, 82:400-407. 13Pérez Carlón R, Jourdain N, Reymond J-L: Fluorogenic polypropionate fragments for detecting stereoselective aldolases. Chem Eur J 2000, 6:41544162. 14List B, Barbas CF III, Lerner RA: Aldol sensors for the rapid generation of tunable fluorescence by antibody catalysis. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:15351-15355. 15Copeland GT, Miller SJ: A chemosensor-based approach to catalyst discovery in solution and on solid support. J Am Chem Soc 1999, 121:43064307. 16. Morís-Varas F, Shah A, Aikens J, Nadkarni NP, Rozzell JD, Demirjian DC: Visualization of enzyme-catalyzed reactions using pH indicators: rapid screening of hydrolase libraries and estimation of the enantioselectivity. Bioorg Med Chem 1999,7:2183-2188. 17. Janes LE, Löwendahl AC, Kazlauskas RJ: Quantitative screening of hydrolase libraries using pH indicators: identifying active and enantioselective hydrolases. Chem Eur J 1998, 4:2325-2331. 18 Bornscheuer UT: Methods to increase enantioselectivity of lipases and esterases. Curr Opin Biotechnol 2002,13:543-547. 19Jenne A, Gmelin W, Raffler N, Famulok M: Real-time characterization of ribozymes by fluorescence resonance energy transfer (FRET). Angew Chem Int Ed Engl 1999, 38:1300-1303. 20Jandeleit B, Schaefer DJ, Powers TS, Turner HW, Weinberg WH (1999) Combinatorial materials science and catalysis. Angew Chem Int Ed 38:2494–2532 21Reetz MT, Becker MH, Liebl M, Fürstner A (2000a) IR-thermographic screening of thermoneutral or endothermic transformations: the ring-closing olefin metathesis reaction. Angew Chem Int Ed 39:1236–1239 22Holzwarth A, Schmidt H-W, Maier WF (1998) Detection of catalytic activity in combinatorial libraries of heterogeneous catalysts by IR thermography. Angew Chem Int Ed 37:2644–2647 23Hirose A, Esaka Y, Ohta M, Haraguchi H: On-line HPLC determination of enzymatic activity of alkaline phosphatase in natural water using spectrofluorometric detection. Chem Lett 1993:307-310.
酶的高通量筛选与定向进化
高通量筛选技术 目的基因 基因突变技选技术 有益正向突变 高效生物催化剂
生物催化剂 定向进化
展望
高效的筛选技术使我们可以筛选到更多的新酶， 定向进化技术使酶的性质得到了极大的改善使酶 更加适合工业应用，这些技术的发展和完善使生 物催化的应用成为可能，并继续推动着生物催化 向各个领域不断渗透。 人们对经济的生产方式的追求，对能源与环境的 重视，尤其是对医药和精细化工产品日益增长的 巨大需求，进一步推动了生物催化在各个领域的 广泛应用和飞速发展。
酶的高通量筛选与定向筛选
报告人：黄剑宇 导 师: 张 卫
生物催化简介
生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转 化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。
优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶 优点 具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比 拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。 缺点：生物催化剂在目的介质中的不稳定性导致的活性降低甚至完全 缺点 丢失；虽然生物催化剂可以催化我们所知的各种反应，但对于特定的 底物和产物可选择的酶通常是很少的，而且目前只有极少数的酶可以 商业获得；从酶的发现到生产应用通常是一个艰苦的漫长的过程。 实际应用取决于它与传统工业过程的竞争，只有在竞争获得明显的经 济优势才能得到生产应用
酶分子的定向进化
通过以上方法从自然界筛选到的酶通常还 无法适应工业应用的需求，主要限制因素 包括 酶对非天然底物的惰性， 在工业应用环境中的不稳定性和低的耐受 力， 在非水环境下的低活力， 对辅酶的依赖等。
酶分子的定向进化
定点突变等基因改造技术， 改变蛋白序列中的个 别氨基酸残基，可以对酶的性质和其催化特性进 行改造，产生符合特定需要的酶，这一蛋白质工 程技术又称为分子进化的理性设计。 采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。 这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
pH指示剂显色高通量筛选
许多水解反应伴随pH的变化，根据反应介质和反 应平衡常数选择合适的pH指示剂可以准确的检测 水解反应速率。pH指示剂显色技术被广泛地用于 腈水解酶和酯水解酶等水解酶的筛选 Quick E法通过pH指示剂的显色反应监测互为对 映体底物的水解速率，根据水解速率的差异来评 价酶的立体选择性。这一技术最近被用于荧光假 单胞菌酯酶定向进化中突变体的筛选，得到了立 体选择性明显提高的突变体