伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列
四川农业大学硕士研究生毕业论文猪...
四川农业大学硕士研究生毕业论文猪伪狂犬病病毒ｇＤ基因生物信息学分析齄里皇口木１．ＰＲＶ野毒株的分离１．１ＰＣＲ检测ＰＲＶ特异常性检测将不同的病毒接种细胞后，待细胞出现部分病变后，用ＳＤＳ法将病毒的核酸抽提出来，用建立好的ＰＣＲ检测ＰＲＶ的方法对不同病毒的核酸模板进行扩增，主要是检测该检测方法的确种属特异性。
从ＰＣＲ结果看，仅有ＰＲＶ扩增出来特异的目的条带，而其它病毒的核酸抽提物中，只有引物二聚体，所以证明了该方法具有较好的种属特异性。
图２ＰＣＲ方法检测ＰＲＶ特异性电泳图Ｆｉ９２ｓｐ∞ｉ五ｃ姆ｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇＰＲＶｂｙ’ＰＣＲＭ．ＤＬ｝Ｏｏｏ１．ＰＲＶ２．ＰＲＲＳＶ３．ＨＣＶ４删５．ＪＥＶ６．ＰＣＶ７．空白细胞１．２ＰＣＲ检测病料ＤＮＡ的结果对１４个疑似病料的ＤＮＡ通过ＰＣＲ扩增检测，电泳检测有两个疑似病料（３。
、７８）扩增出来约３０５ｂｐ的特异性条带，将该两株病料定为阳性病料。
图３ＰＣＲ检测病料电泳图Ｆｉ９３Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇｐｉｇ’ｓａｂｏｒｔｕｓｂｙＰＣＲＭ１．ＭａｒｋＩ］Ｉ１．１＃病料２．２＃病料３．３＃病料４．硝病料５．５＃病料６．硎芮料７．７＃病料８．８＃病料９．９＃病料Ｍ２．ＤＬ２０００１．３ＰＲＶ野毒株的分离对ＰＣＲ检测为阳性的两株病料进行病毒分离后，使用ＶＲＥＯ细胞进行细胞培养，在盲传的第一、二代虽然细胞会出现细胞固缩、融合、堆积成小丘状、折光性增强等细胞异常现象，但是没有出现ＰＲＶ接种ＶＥＲＯ细胞后的明显的和特异的拉网病变现象。
在盲传的第三代ＶＥＲＯ细胞才出现ＰＲＶ接种后特异的细胞拉网现象。
由于该两株病料的分别采自四川的遂宁、邛崃，所以分别命名为ＳＳ株和ＳＱ株。
２ＰＲＶ＿ｇＤ基因的ＰＣＲ扩增采用ＳＤＳ蛋白酶Ｋ方法抽提ＰＲＶ病毒基因组ＤＮＡ，用ＰＣＲ对ＰＲＶ标准株Ｆａ疫苗株ＳＡ２１５株、７８３株扩增、哈尔滨株；早期分离的野毒株ＳＮ株、ＳＬ株、ＳＣＺ株、ＢＪｌＦ４株、ＤＧＢＳＦｌ、ＨＳＦ０株；本次实验分离的四川野毒株Ｓｓ株、ｓＱ株共计１２株病毒株进行了ＰＣＲ扩增，结果１２株毒株均获得了约１．２ｋｂ的特异性扩增条带。
猪伪狂犬病病毒基因序列分析
猪伪狂犬病病毒主要功能蛋白基因序列分析摘要:根据Genbank中已发表得猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、TK基因得序列各设计了1对引物,对分离得到得PRV毒株得gE、gG、TK基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期得PRV gE、gG、TK基因片段相符。
遗传进化树分析与氨基酸序列比对结果发现PRV毒株得gE、gG、TK氨基酸序列发生变化得位点与2012年国内分离到得PRV流行株相同,从而推测该毒株为PRV变异毒株。
关键词:伪狂犬病毒;gE基因;TK基因;序列分析猪伪狂犬(Pseudorabies,PR)就是由伪狂犬病毒(Peudorabies virus,PRV)引起得以家畜与多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征得急性传染病[1]。
该病在我国发生较为严重,就是严重危害我国养猪业得疫病之一。
我国目前广泛应用得就是自然缺失弱毒活疫苗Bartha-k61株,使猪伪狂犬病得到了很好得控制。
但就是,2011年底至2012年该病在中国东北部分省份流行,甚至在许多使用基因缺失活疫苗免疫得规模化猪场出现了猪伪狂犬病疫情,给中国得养猪业造成了巨大得经济损失[2-6]。
伪狂犬病病毒(猪疱疹病毒1型)属于双股线性DNA病毒,大小约150kb,DNA 基因组中G+C得含量高达73%,可编码100种蛋白质。
基因组由独特得长节段(UL)、独特得短节段(US)、内部倒转重复序列(IRs)与末端倒转重复序列(TRs)组成。
在病毒得结构蛋白中,gE糖蛋白就是主要毒力因子之一,并作为标志基因用来区分疫苗免疫与野毒感染。
TK基因不仅就是最主要得毒力基因,而且也就是决定病毒持续感染得重要因素[7]。
一旦TK基因缺失,PＲV变异株对宿主得毒力将丧失或明显降低。
2013年至2014年上海市农业科学院畜牧兽医研究所繁殖障碍研究室从山西某免疫猪伪狂犬病(Bartha)疫苗得规模化猪场成功分离并鉴定出四株PRV,命名为SX1,SX2,SX3,SX4株,为明确该四株分离株就是否属于PRV抗原变异毒株,本研究对PRV SX株得gE、gG、TK全基因进行克隆与测序,通过与国内外其她已公布PRV分离株得gE、gG、TK推导得氨基酸序列进行比对,构建核苷酸序列遗传进化树,以期为丰富PRV分子流行病学与开发科学有效得新型猪伪狂犬病疫苗提供重要科学依据。
伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析
摘 要 ： 广 东四会 某猪场分 离到一株疑为猪伪狂 犬病病毒（Ｒ ） 从 Ｐ Ｖ 的病毒． 病毒在猪 肾细胞上 出现 细胞 变圆、 拉 网、 融合等典型病变 ， 并具有 细胞泛嗜性特点 。在 ＭＤＣ 细胞上 测得 其 Ｔ Ｄ Ｋ ＣＩ 值为 １－ ０１ ， ０ｓ ． ／ ｍＬ 能被伪狂 犬病病毒 标 准阳性血清 中和。 ０１ｍＬ病毒液接种小鼠后发 生奇痒并麻 痹致死， 将 ． 接种猪 ３天后发病 ， ７天死亡． 从攻毒病死猪 的脑组织病理切片上观 察到 典型的病毒性脑膜脑 炎及血管套现 象。通过 Ｐ ＣＲ 扩增到 Ｐ 基 因． Ｒｖ 由此进一步证 明所分 离病毒为猪伪 狂犬病毒 ， 并命名为 Ｇ Ｈ株 。根据 Ｇ ｎ ａｋ中发表 的序 列， ＤＳ ｅＢ ｎ 设计一对扩增 Ｐ Ｒｖ 吐 基 因的特 异性 引物 ， 建立可以区分 Ｐ Ｒｖ 野毒株 与疫苗株 的 Ｐ Ｒ 诊断方法。 以此方法对病毒 的细胞培养液进行检测 ． Ｃ 结果证 实所分毒株为 Ｐ ｖ野毒株 ， Ｒ 经克隆测序后与 Ｇ ｎ ａｋ收 录的其 它 Ｐ ｖ ｇ ｅ Ｂｎ Ｒ Ｅ基 因序列进行 比较 ， 发现 所测毒 株的核 苷 酸 序 列 与 其 它 Ｐ Ｖ 毒 株 的 同 源性 介 于 ９ ． ￣ ９９ Ｒ ８ ％ ９． ３ ％之 间 ， 中与 Ｐ ห้องสมุดไป่ตู้ａ 的 亲缘 关 系最 近 为 ９ ． 其 ＲＶ Ｅ 株 ９％ ９ 关键词 ： 伪狂 犬病毒（ Ｒ ； 离鉴定 ： 基 因； Ｐ ｖ）分 吐 序列分析
表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００７，１５（２）：１９２￣１９７＊基金项目：国家高技术研究与发展（８６３）计划课题（Ｎｏ．２００２ＡＡ２４１３４）资助。
＊＊通讯作者。
Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．教授，博士生导师，主要从事动物分子病毒学与免疫学研究。
Ｔｅｌ：８６－１０－６２７３１２９６；Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｙａｎｇｈａｎｃｈｕｎ１＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ＞．收稿日期：２００６－０６－１９接受日期：２００６－０８－２８·研究论文·表达伪狂犬病毒ｇＣ糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果＊陈振海，杨汉春＊＊，郭鑫，陈艳红（中国农业大学农业部预防兽医学重点实验室，北京１０００９４）摘要：通过双酶切将伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）Ｆａ株ｇＣ囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到５型腺病毒ＡｄＭａｘ系统穿梭质粒ｐＤＣ３１６中，得到ｐＤＣ３１６－ｇＣ。
用此质粒与腺病毒ＤＮＡ辅助质粒ｐＢＨＧｌｏｘΔＥ１，３Ｃｒｅ共转染２９３细胞，包装出重组腺病毒Ａｄｖ－ｇＣ。
通过ＰＣＲ鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Ａｄｖ－ｇＣ病毒液。
间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达ＰＲＶｇＣ蛋白。
该病毒经肌注免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。
攻毒试验表明，此重组病毒能提供１００％的免疫保护。
关键词：伪狂犬病毒；ｇＣ糖蛋白；重组腺病毒；免疫中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：１００６－１３０４（２００７）０２－０１９２－０６ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇＣＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＧｅｎｅｆｏｒＤｅｖｅｌｏｐｉｎｇＶａｃｃｉｎｅａｇａｉｎｓｔＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓＣＨＥＮＺｈｅｎ－ｈａｉ，ＹＡＮＧＨａｎ－ｃｈｕｎ＊＊，ＧＵＯＸｉｎ，ＣＨＥＮＹａｎ－ｈｏｎｇ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｅｖｅｎｔｉｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ＦａｓｔｒａｉｎｇＣｇｅｎｅｗａｓｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＤＣ３１６ｔｈｒｏｕｇｈｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｐＤＣ３１６－ｇＣａｎｄＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＤＮＡｈｅｌｐｅｒｐｌａｓｍｉｄｐＢＨＧｌｏｘΔＥ１，３Ｃｒｅｉｎｔｏ２９３ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｇＣｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｍａｒｋａｂｌｙｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ．Ａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ｈｉｇｈｔｉｔｅｒｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｄｅｓｉｇｎａｔｅｄａｓＡｄｖ－ｇＣｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｆｔｅｒＰＣＲｉｄｅｎ－ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｖｉｒｕｓｐｌａｑｕｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｇＣｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｉｎＭａｒｃ１４５ｃｅｌｌｓｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｔａｉｎ－ｉｎｇａｓｓａｙ．ＩｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｄｖ－ｇＣｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅＰＲＶｓｐｅｃｉｆｉｃｈｕｍｏｒａｌａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｍｉｃｅ．Ｉｎｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅｇｒｏｕｐｉｍｍｕｎｉｚｅｄｂｙＡｄｖ－ｇＣｐｒｅｓｅｎｔｅｄ１００％ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｓｃｏｎｔｒａｓｔｔｏ０％ｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｏｔａｌｌｙ，ｔｈｅｐｒｅｓｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｌｐｒｏｖｉｄｅａｇｏｏｄｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇａｎｏｖｅｌＰＲＶｌｉｖｅｖｅｃｔｏｒｖａｃｃｉｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ；ｇＣｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）引起的动物传染病。
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第１ ７卷 ２期
２０ ０ ２年 ５月
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伪狂 犬 病病 毒 上海 株 ｇ 和 ｇ 因的克 隆 及缺 失 转移 载体 的 构建 Ｅ Ｉ基
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但 各种 灭活疫 苗及 弱 毒 疫 苗对 该 病 的 防制 、
根除 及 对持 续 性 感 染 的 防 制 都 是 不成 功 的ｉ 随 ｔ Ｉ ｏ 着分 子 生物 学 的发 展 ， 一些 传 染 病病 原的 分 子 剖 对 析， 使致病 基因和 免 疫 保护 性 抗 原 基 因的 鉴 定 和分 离得 以 实 现 。 自 ２ ‘ Ｊ 。 ０世 纪 ７ ０年 代 以 来 ． 过 对 通 Ｐ Ｖ基 因组 的改造 已先 后研 制 了 多利 Ｐ Ｖ 基 固歃 Ｒ Ｒ 失疫 苗 。这些基 因缺失 疫 苗株有 的是缺 失病 毒的主 要毒 力基 因， 以降低其 毒力 ； 的缺 失 ｒ 有 病毒 的糖 蛋 白基 因 ， 而可 以通过 血 清学 等 方 法 将 疫 苗免 疫猪 从 和 自然感染野 毒猪 区 分开 来 ， 控 制并 最 终 消灭此 使 病成 为可能 。 ｇ 和 ｆ是 以 非共 价 键 形式结 合成 。Ｅ
ｐ ｒｉｌ Ｉｇ ｎ ｒ ｂａｎ ｄ ｂ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅ ｃｉｎ Ｐ Ｒ）， ｕ ｓｑ ｅ ｔ ｌｎ ｄ ｉ ｔ ＧＥ Ｔ ａｔａ ｇ ｅ ｅｗｅ ｅｏ ｔｉｅ ｙ ｐ ］ｍｅａ ｅｃ ａｎ ｒａ ｔ （ Ｃ ｏ ｓ ｂ ｅ ｕ ｎ ｌ ｃｏ ｅ ｎ ｏｐ Ｍ ｙ
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狂犬病毒分离株糖蛋白基因的克隆与序列分析
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狂 犬病是 由狂 犬病病 毒 （ ａ ｉ ｉ ｓ Ｖ） 起 Ｒ ｂｅ ｖｒ ，Ｒ 引 ｓ ｕ 的人和 哺乳 动 物 的急 性致 死 性 中枢神 经 系统 的 自然 疫 源性 疾病 ，病 死 率几 乎达 １０％【。Ｒ 基 因组 为 ０ ” Ｖ
猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达
猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达猪伪狂犬病毒(Rabies virus)是一种令人担忧的病毒，可以感染多种动物，包括狗、猪和人类。
与典型的狂犬病相比，猪伪狂犬病在猪身上表现出更为复杂的病理变化。
目前，防控猪伪狂犬病的主要手段是疫苗接种。
然而，现有的疫苗对于预防这种疾病的效果并不理想，因此需要研发更为有效的疫苗。
疫苗的主要成分是病原体的抗原部分，它们可以激发机体产生免疫应答从而进行防御。
在猪伪狂犬病疫苗中，糖蛋白G是最主要的抗原。
糖蛋白G是病毒表面的蛋白质，它具有多个B细胞表位(epitope)，这些表位是免疫系统识别病原体的关键。
因此，克隆和融合表达猪伪狂犬病病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的研究对于开发新型疫苗具有重要意义。
为了实现这一目标，研究人员首先从猪伪狂犬病毒的基因组中选取糖蛋白G基因，并通过PCR扩增获得所需的DNA序列。
接下来，这段DNA序列被插入到适当的表达载体中，以便在宿主细胞中产生糖蛋白G蛋白质。
同时，为了方便检测和纯化融合蛋白，研究人员引入了一些标签序列。
经过以上步骤，研究人员成功获得了猪伪狂犬病毒糖蛋白G的表位融合蛋白。
这种融合蛋白包含了糖蛋白G的多个B细胞表位编码序列，因此有望在机体中诱导更强的免疫应答。
接着，研究人员将融合蛋白转染到哺乳动物细胞中，利用细胞的表达机制和代谢途径，使蛋白质得以正确表达和折叠。
在融合蛋白的表达过程中，研究人员进行了一系列的实验和优化。
他们调整了转染的细胞系、转染的时间和蛋白的表达量，以确保融合蛋白在细胞内得到高效表达。
同时，为了增加蛋白的稳定性和纯度，研究人员对细胞培养基进行了优化，添加了一些特殊的培养物质，并利用亲和层析等方法对蛋白进行纯化。
经过以上实验步骤，研究人员成功获得了猪伪狂犬病毒糖蛋白B细胞表位编码序列的克隆及融合表达产物。
通过进一步的免疫学实验，研究人员将测试这些融合蛋白的免疫原性和保护性，评估其在预防猪伪狂犬病中的应用前景。
伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析
福建畜牧兽医第43卷第1期2021年17伪狂犬病病毒FJSW的分离鉴定及gG基因序列分析傅星源兆丰华生物科技(福州)有限公司福州350014摘要从福建省某规模化猪场的患猪中分离到一株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为FJSW株，对其进行PCR鉴定、gG基因测序等鉴定，并与GenBank上发表的国內外毒株进行序列分析和遗传进化分析遥结果显示，病毒经Vero细胞培养可产生典型细胞病变遥该毒株gG基因核苷酸序列与国內分离毒株的同源性为99.7%〜100.0%,与国外分离毒株核苷酸同源性为98.9%〜99.1%遥遗传进化分析表明，FJSW株与国內2012年以来新分离的流行毒株属于同一分支,与国外分离的毒株亲缘关系较远遥鉴定结果表明，分离株FJSW是一株伪狂犬病变异毒株遥关键词伪狂犬病病毒分离鉴定gG基因序列分析文献标识码:A文章编号：1003-4331(2021)01-0017-03Isolation and identification of FJSW of pseudorabies virus and sequence analysis of gG geneFu Xingyuan(Jofunhwa Biotechnology(Fuzhou)Co.Ltd.,Fuzhou350014)Abstract A suspected pseudorabies virus variant,named FJSW,was isolated from dead piglets in a large-scale pig farms of Fujian province and determined by PCR identification,gG gene sequence and analyze with domestic and foreign strains from Genbank.The results showed that the virus grown on Vero cell culture can produced typical cytopathic effect.It was shown that the related genes were highly homologous among Chinese isolates(99.7%~100.0%),but relatively lower between Chinese and foreign isolates(98.9%~ 99.1%).Phylogenetic analysis showed that FJSW strain was clustered to a relatively independent branch together with newly isolated strain in recent years,and it was far from the classical strains from foreign-country.These results demonstrated that a new wild pseu-dorabies virus had been isolated.Key words Pseudorabies virus Isolation and identification gG gene Sequence analysis伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。
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伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13(11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095;21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005)摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。
结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。
与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。
但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。
gG 具有膜蛋白的结构特点。
关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704Cloning ,sequence analysis of the gG geneof Pseudorabies virus SH strainHUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1,ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13(1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Scienceand Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China )Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。
PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。
其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。
糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。
gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。
但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。
在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。
在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。
g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。
3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity失的野毒株。
因此可以利用g G作为疫苗株的缺失标志蛋白,用血清学方法鉴别野毒株感染或疫苗株免疫猪。
为深入了解g G的结构特点,构建g G缺失株,建立g G血清学鉴别诊断方法,对PRV SH(上海株)g G基因进行克隆和序列测定,并从核苷酸和氨基酸水平上进行了分析比较。
1 材料和方法111 实验材料猪PRV SH株、兔肾传代细胞株(R K13)、大肠杆菌DH5α株、质粒pcDNA3由南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室保存。
p GEM T easy载体及连接试剂购自Promega公司。
112 主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR反应试剂、DNA marker均为大连Takara公司产品,DNA 胶回收试剂盒为上海华舜公司产品。
113 病毒的培养和模板制备接种适量PRV SH株种毒至R K细胞中,待80%细胞病变后收获,冻融3次;低速离心去除细胞碎片,上清液加入终浓度为1%的SDS、100μg・mL-1蛋白酶K,50℃水浴1h;用酚/氯仿混合物和氯仿各抽提一次,上清用无水乙醇沉淀DNA;待DNA干燥后溶解于适量灭菌双蒸水中,作PCR模板。
114 引物设计与合成根据G enBank上发表的Rice株g G基因序列[2]设计一对引物,并在5′端分别加上Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点。
包括完整的g G基因及部分非编码序列,由大连Takara公司合成。
引物序列为:g G1:5′CGG AA TTCTTTG A TCCCGTCCGCCGCCCTTC3′;g G2:5′GCTCTA G ACCCGGTAA GCAA G2 GCCGTAC3′。
115 gG基因的PCR扩增和回收PCR反应体积50μL,依次加入2×GC缓冲液25μL,dN TP混合物(均为215mmol・L-1) 8μL,引物g G1和g G2(20μmol・L-1)各1μL,LA Taq酶015μL,双蒸水1215μL。
模板DNA先在沸水中煮10min,冰浴冷却后取2μL加入PCR系统中,先在95℃预变性240s,再按95℃50s,64℃60s,72℃150s进行35个循环,最后一次循环72℃延伸10min。
取8μL经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,分子量大小符合的PCR产物用胶回收试剂盒回收。
116 基因的克隆和序列分析纯化的PCR产物按Promega公司使用说明与p GEM T2easy载体连接,总体积10μL,4℃过夜。
转化DH5α大肠杆菌感受态细胞涂布于加有氨苄青霉素的平板,培养14～16h;挑取菌落培养,抽提质粒,用Eco RⅠ酶切筛选阳性质粒。
用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切出117kb的克隆片段,插入pcDNA3的相同酶切位点上,得到重组质粒pCg Gsh,送大连Takara公司测序。
得到的g G序列用DNAStar 生物软件与Rice株的g G基因进行核苷酸和氨基酸水平比较。
2 结 果211 PCR扩增和克隆结果从PRV SH株病毒培养物总DNA中扩增出一条约117kb的产物,符合设计要求。
产物连接到p GEM T2easy载体后,用Eco RⅠ和XbaⅠ双酶切,切出的117kb片段克隆到pcDNA3质粒,得到重组质粒pCg Gsh(图1)。
图1 PRV gG基因PCR扩增和重组质粒pCgG sh酶切结果Fig.1 PCR product and enzyme digestion of pCgG sh1.Plasmid pCgGsh;2.pCgGsh digested with Eco RⅠandXbaⅠ;3.PCR product of gG gene;41DL2000・81・ 南 京 农 业 大 学 学 报 第26卷212 gG 基因核苷酸序列分析经测序,克隆的gG 片段长1719bp ,G+C 含量69141%,包含一个1491bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有一个TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有一个AA TAAA 的poly (A )尾。
该片段与Rice 株相应片段的同源性为97161%。
在g G 编码区内,SH 株与Rice 株有19个核苷酸不同,而且在687～696位缺少9个核苷酸,在786,1001和1018位各插入1个核苷酸,在895～896位插入2个核苷酸,在1119～1120位缺少2个核苷酸,这些插入与缺少导致了突变与移码(图2)。
图2 PRV SH 株与Rice 株gG 基因核苷酸序列比较Fig.2 Comparison of the nucleotide sequences of the gG gene betw een SH strain and Rice strain(Note :(1)S :Shanghai strain ;R :Rice strain (2)“1”代表相同的核苷酸;“”代表缺失的核苷酸。
“1”denotes identical nucleotides ;“”denotes deleted nucleotides 1)213 氨基酸序列分析PRV SH 株g G 基因推导的氨基酸序列与Rice 株相比,不仅长度减少2个,只有496个氨基酸,而且同源性仅有8716%,差异较大。
这主要是由于在1001和1018位各插入一个核苷酸,导致氨基酸序列图3 PRV SH 株与Rice 株gG 基因氨基酸序列比较Fig.3 Comparison of the amino acid sequences of gG gene of SH strain and Rice strain(“1”代表相同的氨基酸;“”代表缺失的氨基酸;下划线代表糖基化位点。