实验七 酵母菌的形态观察及微生物的显微直接计数法
实验七酵母菌的形态观察、死活细胞鉴定及血球计数法
通过血球计数板对酵母菌进行计数，我们得到了每毫升菌 液中酵母菌的数量。结果显示，菌液中酵母菌的数量在合 理范围内，计数结果准确可靠。
对实验过程的反思与总结
实验操作方面
在实验过程中，我们需要注意无菌操作 ，避免杂菌污染。同时，需要准确配制 试剂，保证实验结果的准确性。
VS
实验设计方面
在实验设计时，需要考虑实验的可行性和 可重复性。本实验中，血球计数法的操作 较为简便，且结果准确可靠，是一种有效 的计数方法。
死活细胞鉴定结果分析
死活细胞鉴定结果
通过染色法和荧光染色法，我们成功地对酵母菌的死活细胞进行了鉴定。活细胞能够吸 收染料并发出荧光，而死细胞则不能。在显微镜下观察，活细胞呈现明显的荧光，而死
细胞则无荧光。
分析
死活细胞鉴定结果表明，大部分酵母菌为活细胞，仅有少量酵母菌为死细胞。这说明在 实验过程中，酵母菌的生长条件较为适宜，且培养基的营养成分能够满足酵母菌生长的
实验七酵母菌的形 态观察、死活细胞 鉴定及血球计数法
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 结论
01
CATALOGUE
实验目的
掌握酵母菌的形态观察方法
了解酵母菌的形态特征
通过显微镜观察，了解酵母菌的单细 胞形态，包括其形状、大小、细胞壁 、细胞膜等结构特点。
学习染色法
THANKS
感谢观看
酵母菌是单细胞真菌，通常呈卵圆形或圆柱形，具有细胞壁、细胞膜、细胞质和 细胞核等基本结构。通过显微镜观察酵母菌的形态，可以了解其生长状态和繁殖 方式。
酵母菌在生长过程中，会经历由单倍体到二倍体的过程，通过观察其形态变化， 可以了解其生长周期和繁殖特点。
实 验7 酵母菌的形态观察
实验7酵母菌的形态观察、大小测定和直接计数一、实验目的酵母菌的形态及出芽生殖，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；学习并掌握用测微尺测定微生物大小和使用血球计数板进行微生物计数的方法。
二、实验原理1.酵母菌形态观察酵母菌个体较大，常规涂片方法可能损伤细胞，因此用美蓝染液水浸片法观察其出芽生殖。
美蓝染液的氧化形式蓝色，还原形式无色。
活细胞由于新陈代谢，细胞内还原性物质还原美蓝而呈现无色，死细胞或代谢能力弱的细胞不能将美蓝还原呈现蓝色。
2.细胞大小测量微生物大小的测定需借助测微尺：目镜测微尺和镜台测微尺。
镜台测微尺用于矫正目镜测微尺，总长1mm，分100个小格，每小格10μm。
目镜测微尺是一块可放入目镜的圆形玻片，有50小格和100小格2种。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度，然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞的实际大小。
3.细胞计数血细胞计数板，大格1.0mm，体积0.1m3。
三、步骤1.酵母菌观察1)在载玻片中央加一滴0.05%吕氏碱性美蓝染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均匀。
2)加盖玻片。
3)将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色区别死、活细胞。
4)染色约0.5h后再次进行观察，观察死细胞数量是否增加。
5)形态记录，计算0.5h后酵母菌的死亡率。
2.细胞大小测量1)装目镜测微尺：把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
2)校正目镜测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
校正：先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌的形态观察及死活鉴别一、目的要求观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。
二、基本原理酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。
繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。
本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。
用它采对酵母细胞进行染色。
活细胞内由于新陈代谢作用而具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母活细胞染色后无色。
而死细胞或代谢缓慢的老细胞因无还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。
因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。
三、器材酿酒酵母（Saccharomyces cerevissiae）；0.1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。
四、操作步骤（美蓝浸片观察）(1)在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。
然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
(2)用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。
盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触；然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。
(3)将制好的水浸片放置3分钟后镜检。
先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
五、实验报告(1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
II 显微镜直接计数法一、目的要求1．明确显微镜计数的原理。
2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。
酵母菌数量的测定—显微镜直接计数法
五、数据处理
各中格中的菌数（个）
二室 平均
菌数
A
B
值 （个/
1
2
3
4
5
（个 mL）
） 第一
室 第二
室
15
六、思考题 能否利用显微镜直接计数的方法测定
酵⺟菌菌液中的死细菌与活细菌？如果可 以，如何进行？如果不可以，请说明原 因。
16
式1：总菌数（个/mL）=A/5×16×10000×B 式2：总菌数（个/mL）=A/5×25×10000×B
三、实验器材 血球计数板、显微镜、盖玻片、滴管、 酿酒酵⺟菌液
8
四、实验步骤
1、加样品
•取净洁干燥的血球计数板盖上盖玻片。 •将菌悬液适当稀释（稀释1倍），摇匀。
•用滴管吸取菌悬液，加1～2滴于盖玻片边 缘，让菌液靠毛细渗透作用进入计数室。 •放置5 min左右让计数室充满菌液。
• 如遇酵⺟出芽，芽体大小达到⺟细胞一般时，即作 为两个菌体计算。
• 计算一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来 计算样品的含菌量。
• 菌体在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下 才能看全，所以，观察时必须不断调节细螺用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷； •镜检观察是否清洗干净； •洗后干燥（晾干、吹干，或乙醇、丙酮等有 机溶剂脱水干燥）。
4
5
血球计数板规格
计数室高度：0.1mm 大方格边⻓：1mm。 每个大方格分成400个小方格。
规格一：每个大方格分成16个中方格，每个中方格又分 成25个小方格。 规格二：每个大方格分成25个中方格，每个中方格又分 成16个小方格。
设五个中方格的总菌数为A，菌液的稀释倍 数为B，规格一、规格二计数板，分别采用式 1、式2计算。
酵母菌形态的观察和显微镜直接计数法
显微镜直接计数法的优缺点
优点
操作简单、快速，适用于初步估 计样品中微生物的数量。
缺点
主观性强，误差较大，无法准确 反映样品中微生物的种类和分布 情况。
03 酵母菌的应用
酿酒工业
酿造啤酒
酵母菌是酿造啤酒的关键微生物，通 过发酵作用将麦芽中的糖分转化为酒 精和二氧化碳。
选择高倍数显微镜，以 便清晰观察酵母菌形态。
用于放置观察样本，需 干净无痕。
酵母菌培养液
选择适当的培养基，以 便培养和观察不同种类
的酵母菌。
染色剂
如美蓝或苯酚品红，用 于染色酵母菌，使其更
易于观察。
实验操作步骤
1. 制备样本
将酵母菌培养液滴在载玻片上 ，然后盖上盖玻片。
2. 染色
用染色剂对样本进行染色，使 酵母菌更容易观察。
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3. 观察
在显微镜下观察酵母菌形态， 记录其特征。
4. 计数
采用直接计数法，统计显微镜 下观察到的酵母菌数量。
实验注意事项与安全须知
样本新鲜度
确保样本新鲜，避免酵母菌死亡 或污染。
显微镜操作
正确操作显微镜，避免损坏仪器或 造成人身伤害。
安全须知
避免染色剂与皮肤、眼睛接触，如 不慎接触，应立即用大量清水冲洗。
酵母菌的分类学依据
形态学特征
根据酵母菌的形态、大小、 出芽方式等特征进行分类。
生理生化特征
根据酵母菌的生理生化反 应和代谢产物进行分类。
分子生物学特征
通过分析酵母菌的基因组 序列和分子标记进行分类。
02 显微镜直接计数法
微生物实验@实验7 酵母菌形态观察与计数和放线菌形态观察
三、实验材料
放线菌和酵母菌培养物
1. 放线菌培养物：青色链霉菌四天插片培养 物。 2. 啤酒酵母24至28h液体培养物。 3．显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、
镊子等。
插片培养防线菌
插片法 培养放线菌
四、实验步骤
观察放线菌气生菌丝
和基内菌丝的区别
取插片一片，直接在显微 镜下进行观察，注意分界 面两侧菌丝形态的差异
酵母细胞计数步骤
菌悬液的制备：以无菌生理盐水将酿酒酵母培养物制成浓度适 当的菌悬液。 加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛 细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿 缝隙靠毛细作用自动进入计数室（注意取样前要摇匀菌液；加 样时计数室不可有气泡产生）。 找计数室：加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载 物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进 行计数（注意调节显微镜光线强弱，使菌体和计数室线条清 晰）。 显微镜计数：取左上、右上、左下、右下和中央5个中方格进 行计数。位于中方格边线上的菌体一般只计上边和右边线上的 （或只计左边和下边线上的）。如遇到酵母出芽，芽体大小达 到母细胞一半以上时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要 从上下两个计数室中得到的平均数值来计算样品的含菌量。 清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水 冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。 镜检，观察计数室内是否有残留菌体或其它沉淀物。若不干净， 则必须重复洗涤至干净为止。
实验七 酵母菌形态观察与计 数和放线菌形态观察
一、实验目的
进一步学习并掌握光学显微镜低倍镜和高 倍镜的使用方法； 观察并掌握酵母菌的细胞形态； 学习并掌握鉴别酵母菌细胞死活的方法； 学习并掌握血球计数板计数的原理； 掌握利用血球计数板进行微生物计数的方 法。 了解并观察放线菌的形态特征
酵母菌大小测定及显微镜直接计数
实验一：酵母菌大小测定一、实验器材1、菌种：酵母菌液体培养物2、仪器和其他物品目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸，载玻片，滴管等。
二、实验目的及要求1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。
2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。
三、基本原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。
四、操作步骤1、装目镜测微尺(换目镜)把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝上放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
※双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目镜测微尺一般都安装在右目镜中。
2、校正目镜测微尺（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
（2）校正先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
酵母菌的计数方法
酵母菌的计数方法酵母菌是一类单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
酵母菌在食品加工、工业生产、科研等领域中具有重要应用价值。
酵母菌的计数方法主要分为直接计数和间接计数两种。
直接计数方法包括显微镜计数法、染色计数法和自动计数法；间接计数方法包括背景数法和平板计数法。
下面将详细介绍这些方法。
显微镜计数法是一种常用的酵母菌计数方法。
首先，将样品制成适当的稀释液，然后使用显微镜进行观察和计数。
计数时需要使用显微镜和计数室，通过观察样品中的酵母菌数量来进行计数。
这种方法的优点是简单易行，可以直接观察酵母菌的形态和数量，缺点是操作比较繁琐，计数的准确性受到操作者的经验和技术水平的影响。
染色计数法是一种通过给酵母菌样品染色来进行计数的方法。
将样品制成薄片，然后使用染色剂对酵母菌进行染色，待染色剂干燥后使用显微镜进行观察和计数。
染色计数法的优点是能够清晰地看到染色的酵母菌，并且可以和其他微生物区分开来，缺点是染色过程中可能会对酵母菌的数量和形态产生影响。
自动计数法是一种利用自动计数器对酵母菌样品进行计数的方法。
这种方法利用仪器的精确性和高效性，可以快速准确地计数大量的酵母菌。
自动计数法的优点是快速准确，可以自动化地进行大批量计数，缺点是设备价格较高，操作相对复杂。
背景数法是一种通过计算样品的背景数来估算酵母菌数量的方法。
首先选择一个不含酵母菌的标准培养基样品作为背景数，然后将待测样品和背景数进行对比，从而估算出酵母菌的数量。
背景数法的优点是简单易行，无需特殊设备，缺点是只能粗略估计酵母菌的数量，对于低浓度的样品计数效果不佳。
平板计数法是一种通过在培养基上进行传统菌落计数的方法。
首先将样品制成适当的稀释液，然后在固体培养基上均匀涂布样品，培养一段时间后在培养基上出现的菌落进行计数。
平板计数法的优点是简单易行，可以较为准确地计数酵母菌，缺点是需要一定的培养时间，且对于不同种类的酵母菌可能存在选择性生长的问题。
综上所述，酵母菌的计数方法有多种，每种方法都有其特点和适用范围。
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用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。
2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放 下使其盖在菌液上。
3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形
态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。
Байду номын сангаас
以减少误差。(调节光亮度和聚 光器使计数区的格线清晰)
6．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可
作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值 不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细 胞平均数（N），按公式计算出每ml菌悬液所含酵母菌细 胞数量。
7清洗计数板
思考题
1. 根据你的观察结果，吕氏碱性美蓝染液 及作用时间与酿酒酵母死、活细胞比例变 化是否有关系？试分析原因？ 2. 酿酒酵母除了通过出芽方式无性繁殖外， 还可以形成子囊孢子进行有性繁殖，你在 实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？ 若未观察到，试分析原因。
2 血球计数板的计数原理
三、实验材料与器材
菌种：酿酒酵母 培养基和试剂：麦芽汁琼脂培养基，0.05％ 和0.1 吕氏
碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液.
显微镜，玻片血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、
吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
四 操作步骤
（一）酵母菌形态观察 1、菌种活化
将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，25~28℃培养48 h左右备用。
5）用0.5%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 3、水一碘液镜片的观察 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水， 取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。
注意事项
1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现 大量气泡而影响观察。
2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。
美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝 对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较 强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有 还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞 则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。
4 静置5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下
找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
5．计数时若计数区是由16个 中方格组成，按对角线方位， 数左上、左下、右上、右下的 4个大方格（即100小格）的 菌数。如果是25个中方格组成 的计数区，除数上述四个大方 格外，还需数中央1个大方格 的菌数（即80个小格）。如菌 体位于格线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，
实验六 酵母菌的形态观察及微生物的显 微直接计数法
一、实验目的
1
2
学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。
了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下微生
物直接计数的方法。 二、实验原理 1 酵母菌形态观察及死活细胞的鉴别 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍 甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁 殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片或水—碘液 水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。
（二）微生物显微镜直接计数
1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到 10-2，每个小方格5－10个菌体为宜），以每小格的菌数可数 为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管或毛细吸管吸取少许，由盖玻 片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计 数室，使计数室充满菌液。