色谱分析(中国药科大学)第4章第1-6节高效液相色谱分析

（一）固定相
本法采用未改性的原形硅胶为固定相，以水性溶液作流动相。常用于分析中药中的生物碱成分，或化学合成的生物碱类药物。
该方法的保留机制是基于硅胶表面的硅羟基在一定的条件下具有离子交换特性，改变任一流动相条件（pH, 离子强度，含水量），都会对保留时间产生影响。
（二）流动相
该法常用的流动相为：乙醇（或甲醇）—1~3%三乙胺水溶液（磷酸或醋酸调节pH值至6~7.5）（85：15）或（80：20）。该法的色谱保留机理相当于离子交换机理，主要依碱性强弱出峰。色谱峰的对称性很好，峰形尖锐。适合于分离在反相HPLC中不宜分离的生物碱类混合物（反相HPLC中生物碱可能拖尾及峰展宽，有时tR相差很大）。
经典柱色谱填料颗粒粒径一般大于100um，颗粒较大，传质扩散缓慢，手工装柱不易装均匀，涡流扩散现象较严重，因此经典液相色谱法柱效较低，分离能力差，只能胜任各组分分配系数相差较大的样品（各组分性质相差较大的样品）的分离，HPLC填料粒径一般为5-10μm，传质快，采用高压均浆技术装柱，装柱均匀性号，涡流扩散小，因此HPLC柱效很高，比经典柱色谱高数百～数千倍，25cm长的硅胶柱柱效可达2万理论塔板，能胜任复杂物的分离，峰容量大。
色谱柱不能很长，柱效不会太高
载气不影响分配，靠改变固定相来改变选择性
固定相：没有GC那样种类繁多靠改变流动相来改变选择性
回收困难
可定量回收，可用于制备
第二节 液－固吸附色谱及液－液分配色谱
一 液－固吸附色谱（LSC）
(一)定义
色谱分离是基于吸附效应的色谱法称为吸附色谱，又称液－固吸附色谱、正相色谱法（normal phase chromatography，NPC）。
影响NS/RE色谱保留的因素如下：
1. 水的比例增加，洗脱能力减小；
2. 三乙胺浓度升高，对含碱性基团组分的洗脱能力提高，保留时间缩短。流动相中三乙胺为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消除硅羟基对生物间的吸附。
3. pH值对NS/RE的色谱保留具有两面性。一方面，增大pH值，硅醇基解离程度提高，离子交换特性增强，使保留时间增大。但另一方面，对于碱性化合物，增大pH会压制该化合物的解离，反而会使保留时间缩短。流动相的pH值以pH 6~7为好。原因有三：（1）pH太低，硅羟基失去离子交换能力。（2）pH值太高弱碱性药物不易离子化。（3）pH值太高，硅叫在碱性溶液中有一定的溶解度。
LLC的固定液的选择也可参考纸色谱法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配体系。如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是不溶解的。
3.载体的涂渍
采用GC中常用的固定液涂渍方法。
硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类
吸附强弱
样品类型
无吸附
脂肪烃
弱吸附
烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、卤代烃
中等吸附
绸环芳烃、醚、腈、硝基化合物和大多数羰基化合物
强吸附
醇、酚、酰胺、亚胺、砜、酸
一般规律
1. F化物＜Cl化物＜Br化物＜I化物
2. 顺式比反式几何异构体保留值大
3. 官能团之间的分子内氢键将使保留值减小
（三）流动相
采用与固定液性质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相使用前需预先用固定液饱和，或在分析柱前增加预饱和柱，以避免固定液流失。
（四）应用
LLC较适合于分离中等极性和极性物质，这些物质对LSC来说极性太高，LLC的应用范围几乎全被键合相色谱所包含，故现在已很少使用。
三、正相硅胶反相洗脱（NS/RE）色谱法
第三节 化学键合相色谱
一、意义和特点
化学键合相色谱使用的固定相是借助于化学反应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上的，主要用于反相、正相、离子交换及离子对色谱中。据统计。键合相色谱在高效液相色谱的整个应用中占80%以上。
要形成化学键合固定相，有两个必要条件：一是所用的担体材料应有某种化学反应活性，如硅胶、氧化铝、硅藻土等表面都具有化学反应的官能团；但以硅胶为最理想的和最常用。二是有机分子应含有能与担体表面发生反应的官能团（详见下节讨论）。硅胶（SiO2·xH2O）之所以是理想的化学键合相担体，主要由它的表面性质所决定。硅胶表面硅原子主要以硅醇基（≡Si-OH）和硅氧烷形成存在，这种硅醇基是进行键合的活性官能团。
hplc与经典液相色谱的比较高压220mpa柱口压力低00010150分析速度快分析速度慢可重复多次使用色谱柱只用一次能在线检测不能在线检测二与gc比较适合于热不稳定性样品的分析gc中使用气体为流动相要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离这就使得热不稳定性样品用gc分析比较困难需衍生化以保护被测物的不稳定基团有利于有机酸碱等极性化合物的分离这些物质用gc直接来测定时由于有较大的极性一方面易产生托尾的现象另一方面保留时间过长因而测定困难需利用衍生化来减小其极性后方可gc分析可分离离子型化合物及蛋白质肽类等大分子化合物这些物质无法气化不可gc分析
这种方法的基本原理是物质在两种液相间的分配。它类似于实验中常用的液-液萃取法。其保留机理为溶解度。物质在固定液中的溶解度越大，保留时间越长。
（二）固定相
LLC的固定相为载体上涂渍的固定液。
1. 载体
原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固定液的载体。一般常用硅胶，硅藻土等。结构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型二种。多孔层微珠是较早使用的一种载体，它柱效好，分析时间短；但它的多孔层很薄，只能涂渍少量固定液（最大涂渍1~2%），故柱容量低，柱稳定性也差，因为少量的固定液流失将大大改变保留体积。全多孔微粒（如硅胶）孔容大（≈1ml/g），可涂渍较多的固定液，涂渍量可达1克固定液/每克载体（称为100%涂渍），其柱效比前者高，且柱容量高，柱子稳定性也好——载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失对样品保留体积的影响就越不显著，理想的载体应该具有如下特点：
3、可分离离子型化合物及蛋白质，肽类等大分子化合物
这些物质无法气化，不可GC分析。
总之，HPLC与GC各有所长，互相补充，均成现代分析中不可缺少的工具。
HPLC与GC的比较
GC
HPLC
挥发性物质，适用于20％的化合物
几乎可以分析各种物质
对热不稳定的物质不能分析
可以用于热不稳定的物质
用毛细管柱色谱可得到很高的柱效
能在线检测
不能在线检测
定性定量的准确度
好
差
（二）与GC比较
1、适合于热不稳定性样品的分析
GC中使用气体为流动相，要求被测样品在气化室高温气化后方可在柱上分离，这就使得热不稳定性样品用GC分析比较困难，需衍生化以保护被测物的不稳定基团
2、有利于有机酸，碱等极性化合物的分离
这些物质用GC直接来测定时，由于有较大的极性，一方面易产生托尾的现象，另一方面，保留时间过长，因而测定困难，需利用衍生化来减小其极性后方可GC分析
（四）液—固色谱的应用
随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用LSC模式的分离分析被更方便、稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方面仍有其独特的意义：
1. 异构体的分离
许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者是很困难的，而采用以硅胶为固定相的LSC却很容易分开。
2. 样品预处理
许多生物样品可使用经典LSC来进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进一步以GC或HPLC等分离分析。
1）孔容大
2）孔径应为100~500埃之间，孔径太小较大的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，分离不佳。孔径太大，则固定液易流失，柱稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔要比大孔内保持的好。
2. 固定液
固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和其他醚。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。
4. 极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小
5. 环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端取代基有更强的保留
例如：环丙氟哌酸的中间体2，4—二氯氟苯的合成工艺如下：
(1) (2) (3)
(4) (5)
现对合成的最终产品2，4—二氯氟苯进行纯度检查。采用的检查方法为HPLC，以硅胶柱分析得到如下色谱。试判断图中各峰所对应的化合物（归属）。
HPLC与经典液相色谱的比较
HPLC
经典液相色谱法
色谱柱入口压力/MPa
高压，2-20MPa
柱口压力低,0.001～0.1
固定相粒度：粒径/μm
2-5
>100
色谱柱柱效/（理论塔板数/m）
2000-50000
2 -50
分析速度
分析速度快
分析速度慢
色谱柱使用情况
可重复多次使用
色谱柱只用一次
在线检测情况
1、液－固吸附色谱法
2、液－液分配色谱法
3、化学键合相色谱法
4、离子交换色谱法
5、离子对色谱法
6、凝胶色谱法（又称分子筛色谱法，分子排阻色谱法，尺寸排阻色谱法）
二、HPLC的特点和其它色谱法的比较
（一）与经典液相色谱比较
1、高分离效能
H=A+B/u+Cu (A=2 dp，C与dp2呈线性关系，dp↑→C↑，A↑)
4. 非解离型物质在该系统的出峰顺序类似于RP-HPLC（硅氧烷基疏水）
（三）柱子的培养
由于流动相中含有三乙胺，三乙胺吸附在硅羟基上。很难以甲醇清洗，所以每次做完样品，先以0.1%冰乙酸冲洗15-20min,洗去三乙胺，然后再用甲醇冲洗20min。经这样处理后，柱压可长期保持不变，达到保护柱子的目的。
2用，且体积大（0.1～2m长，0.5～5cm粗），分离速度慢（几小时～几周），每次均要重新装柱，造成人力，物力及时间上的浪费，而一根HPLC柱能重复使用数百次，此外，由于配备了高压输液泵可实现快速分析。