高效液相色谱分析PPT
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【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
高效液相色谱法定性定量分析.正式版PPT文档
应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥 发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不 同极性的有机化合物；生物活性物质和多种 天然产物；合成的和天然的高分子化合物等 。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物 、生物化工产品及环境污染物等，约占全部 有机化合物的80％。其余20％的有机化合 物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等 分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分 析。
进样器
进样器： 目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。 对进样装置的要求：
密封性好，死体积小， 重复性好，保证中心进样， 进样时对色谱系统的压力、 流量影响小。 进样方式可分为：
隔膜进样、停流进样、阀进 样、自动进样。目前应用做多的 是阀进样和自动进样。
色谱柱
色谱柱的要求：
柱效高、选择性好，分析 速度快等。市售的用于HPLC的 各种微粒填料好多孔硅胶以及以 硅胶为基质的键合相、氧化铝、 有机聚合物微球(包括离子交换 树脂)、多孔碳等，其粒度一般 为3，5，7，10μm等，柱效理 论值可达5～16万/米。对于一 般的分析只需5000塔板数的柱 效;对于同系物分析，只要500 即可;对于较难的分离物质对则 可采用高达2万的柱子，因此一 般10～30CM左右的柱长就能 满足复杂混合物分析的需要。
数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计 算机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更 加迅速，简便，准确，精密和自动化，现在 已经可以在互联网上远程处理数据，目前计 算机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
HPLC的固定相和流动相
检测器
色谱系统优化和专家系检统。 测器是HPLC系统的三大关键部 件之一，作用是把洗脱液中的组分的量 市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
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应用范围 高沸点不易挥发，受热不稳定易分解，分
子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物， 化工产品及环境污染物等等。
方法局限性：
使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱 比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器
分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱 法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解 的生物活性样品
第十章 高效液相色谱分析
(high perfomance lquid chromatography) 第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 固定相与流动相 第四节 高效液相色谱仪 第五节 定性、定量分析
1
2
3
4
5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 高效液相色谱法概述
与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点
经典液相(柱)色谱法
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
10
第一节 高效液相色谱法概述
2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的
稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类 物质占有机物总数的80%。
11g。
9
高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较
项目
方法
色谱柱: 柱长/cm
柱内径/mm
固定相粒度: 粒径/ m
筛孔/目
色谱柱入口压力/MPa
色谱柱柱效/(理论塔板数/m)
进样量/g
分析时间/h
高效液相色谱法
10 ~ 25 2 ~ 10 5 ~ 50
2500 ~ 300 2 ~ 20
2103 ~ 5 104 10-6 ~ 10-2 0.05 ~ 1.0
11
第一节 高效液相色谱法概述
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰
性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流 动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了 起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用 产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制 和改进分离。
6
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱 方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色 谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透 色谱)。
早 期 液 相 色 谱 ， 包 括 Tswett 的 工 作 ， 都 是 在 直 径 1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的 柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。 即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很 长！
吸附系数 (KA)
分配系数 (KP)
离子色谱
高效微粒离 子交换剂
不同 pH 值 的缓冲溶液
可逆性的 离子交换
选择性系 数 (KS)
体积排阻色谱
不同孔径的 多孔性凝胶
有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液
多孔凝胶的 渗透或过滤
分布系数 (KD)
13
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的应用范围和局限性
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
12
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的分类
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较
方法 项目 固定相 流动相
吸附色谱
全多孔固 体吸附剂
不同极性 有机溶剂
分配色谱
固定液+ 载体
不同极性有 机溶剂和水
分离原理 吸附 解吸 溶解 挥发
平衡常数
全多孔微粒型 无定型全多孔微粒
23
第三节 固定相和流动相
一、固定相
薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔
活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺 等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且 孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分 析。
14
第二节 基本原理
一、柱内展宽 在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩
展叫柱内扩展。 由气相色谱速率理论可知，范氏方程
概括了影响柱效的各种动力学因素，将范 氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。
15
第二节 基本原理
一、柱内展宽
1. 涡流扩散
He 2dp
填充不规则因子 填充物颗粒的平均直径
16
第二节 基本原理
8
第一节 高效液相色谱法概述
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，
只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，
因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-
一、柱内展宽
21
第二节 基本原理
二、柱外展宽 柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起
的色谱峰展宽。
22
第三节 固定相和流动相
一、固定相
1. 液-固色谱固定相
液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附 活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子 多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为：
薄壳型 球形全多孔微粒及堆积硅珠
一、柱内展宽
2. 纵向扩散
Hd
Cd Dm u
组分分子在流动 相中的扩散系数
流动相的线速度
17
第二节 基本原理
一、柱内展宽
3. 传质阻力
(1) 流动相中的传质阻力(Hm)
Hm
Cm
d
2 p
u
Dm
(2) 滞留流动相中的传质阻力(Hsm)
Hsm
Csmd 2pu Dm
18
第二节 基本原理
一、柱内展宽
(3) 固定相(液)内的传质阻力(Hs)
Hs
C
s
d
2 f
u
Ds
柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高
度的关系归结为:
H 2 dpC d u D m C D m d m 2 pu C D ssm d m 2 pu C D sd s2 fu
19
第二节 基本原理
一、柱内展宽 上式可简写为
HABCu u
HAC u
20
第二节 基本原理
7
第一节 高效液相色谱法概述
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少， 但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为 有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效 固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了 分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才 真正得到广泛应用。
子量大，不同极性的有机物，生物活性物质及天然产物， 化工产品及环境污染物等等。
方法局限性：
使用多种溶剂，成本高，且易产生污染，梯度洗脱 比气相色谱的程序升温复杂 缺少通用的检测器
分析具有多种沸程的石油产品，不能替代气相色谱 法也不能代替中、低压液相色谱法，尤其对受压易分解 的生物活性样品
第十章 高效液相色谱分析
(high perfomance lquid chromatography) 第一节 概述 第二节 基本原理 第三节 固定相与流动相 第四节 高效液相色谱仪 第五节 定性、定量分析
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5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第一节 高效液相色谱法概述
与经典液相色谱法比较 与气相色谱法比较 高效液相色谱的特点
经典液相(柱)色谱法
10 ~ 200 10 ~ 50 75 ~ 600 200 ~ 30 0.001 ~ 0.1
2 ~ 50 1 ~ 10 1 ~ 20
10
第一节 高效液相色谱法概述
2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的
稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC 可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类 物质占有机物总数的80%。
11g。
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高效液相色谱法与经典液相(柱)色谱法的比较
项目
方法
色谱柱: 柱长/cm
柱内径/mm
固定相粒度: 粒径/ m
筛孔/目
色谱柱入口压力/MPa
色谱柱柱效/(理论塔板数/m)
进样量/g
分析时间/h
高效液相色谱法
10 ~ 25 2 ~ 10 5 ~ 50
2500 ~ 300 2 ~ 20
2103 ~ 5 104 10-6 ~ 10-2 0.05 ~ 1.0
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第一节 高效液相色谱法概述
流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰
性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流 动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了 起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用 产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制 和改进分离。
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第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱 方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色 谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透 色谱)。
早 期 液 相 色 谱 ， 包 括 Tswett 的 工 作 ， 都 是 在 直 径 1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的 柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。 即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很 长！
吸附系数 (KA)
分配系数 (KP)
离子色谱
高效微粒离 子交换剂
不同 pH 值 的缓冲溶液
可逆性的 离子交换
选择性系 数 (KS)
体积排阻色谱
不同孔径的 多孔性凝胶
有机溶剂或一定 pH 值的缓冲溶液
多孔凝胶的 渗透或过滤
分布系数 (KD)
13
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的应用范围和局限性
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
12
第一节 高效液相色谱法概述
高效液相色谱的分类
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较
方法 项目 固定相 流动相
吸附色谱
全多孔固 体吸附剂
不同极性 有机溶剂
分配色谱
固定液+ 载体
不同极性有 机溶剂和水
分离原理 吸附 解吸 溶解 挥发
平衡常数
全多孔微粒型 无定型全多孔微粒
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第三节 固定相和流动相
一、固定相
薄壳型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔
活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺 等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且 孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小。适于常规分离分 析。
14
第二节 基本原理
一、柱内展宽 在色谱柱内各种因素引起的色谱峰扩
展叫柱内扩展。 由气相色谱速率理论可知，范氏方程
概括了影响柱效的各种动力学因素，将范 氏方程加以修正后即可用于高效液相色谱。
15
第二节 基本原理
一、柱内展宽
1. 涡流扩散
He 2dp
填充不规则因子 填充物颗粒的平均直径
16
第二节 基本原理
8
第一节 高效液相色谱法概述
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，
只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，
因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-
一、柱内展宽
21
第二节 基本原理
二、柱外展宽 柱外展宽是指色谱柱外各种因素引起
的色谱峰展宽。
22
第三节 固定相和流动相
一、固定相
1. 液-固色谱固定相
液-固吸附色谱所用的固定相，多是具有吸附 活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子 多孔微球以及分子筛。如果按结构和形态可分为：
薄壳型 球形全多孔微粒及堆积硅珠
一、柱内展宽
2. 纵向扩散
Hd
Cd Dm u
组分分子在流动 相中的扩散系数
流动相的线速度
17
第二节 基本原理
一、柱内展宽
3. 传质阻力
(1) 流动相中的传质阻力(Hm)
Hm
Cm
d
2 p
u
Dm
(2) 滞留流动相中的传质阻力(Hsm)
Hsm
Csmd 2pu Dm
18
第二节 基本原理
一、柱内展宽
(3) 固定相(液)内的传质阻力(Hs)
Hs
C
s
d
2 f
u
Ds
柱内各种因素所引起的色谱峰展宽与塔板高
度的关系归结为:
H 2 dpC d u D m C D m d m 2 pu C D ssm d m 2 pu C D sd s2 fu
19
第二节 基本原理
一、柱内展宽 上式可简写为
HABCu u
HAC u
20
第二节 基本原理
7
第一节 高效液相色谱法概述
当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少， 但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为 有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 m ）！
直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效 固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了 分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才 真正得到广泛应用。