超高效液相色谱系统简介
高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
•
• •
• •
防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
高效液相色谱仪使用说明书
高效液相色谱仪使用说明书序言高效液相色谱仪（High-performance liquid chromatography, HPLC）是一种常用的分离技术，广泛应用于药物分析、食品安全监测、环境检测等领域。
本说明书旨在提供关于高效液相色谱仪的基本操作原理、使用方法和注意事项等信息，以帮助用户正确、高效地使用该仪器。
一、仪器概述高效液相色谱仪主要包括进样系统、色谱柱、泵液系统、检测器和数据处理系统等基本组成部分。
1. 进样系统进样系统用于将待测样品引入色谱柱中进行分离。
常见的进样方式包括自动进样器、手动进样器和微量注射器等。
2. 色谱柱色谱柱是分离相和固定相组成的圆柱体，是进行样品分离的关键组件。
用户应根据待测样品的特性选择适当的色谱柱型号和填充物。
3. 泵液系统泵液系统通过输送流动相将样品送入色谱柱中，并提供足够的压力以保持流速和流动相性质的稳定。
泵液系统可根据实际需求配置恒压、梯度或等压梯度等控制方式。
4. 检测器检测器用于监测和记录样品的化学信号，并将其转化为可读的信号输出。
常见的检测器包括紫外可见检测器、荧光检测器、电化学检测器等。
5. 数据处理系统数据处理系统用于采集、处理和分析检测到的信号，通常配备有专业的软件。
用户可根据需要选择合适的数据处理系统，并进行适当的参数设置。
二、操作方法1. 仪器准备（1）保证仪器通电正常并处于稳定工作状态。
（2）检查流动相储液瓶中是否有足够的流动相，并确保其配制符合要求。
（3）检查色谱柱的连接情况，确保柱座和柱连接部位严密无泄漏。
（4）开启数据处理系统，确保与色谱仪的连接正常。
2. 样品准备根据实验要求选择合适的样品，并进行必要的前处理工作，如过滤、稀释等。
3. 进样操作（1）将样品溶液通过合适的进样方式加入进样器中。
（2）设置进样体积和进样方式等参数，并进行进样操作。
4. 流动相系统设置（1）根据实验要求选择合适的流动相，注入流动相储液瓶中。
（2）设置流速、梯度等参数，并进行流动相系统的初始化。
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
高效液相色谱仪主要组成
高效液相色谱仪主要组成高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种在化学分析中广泛使用的分离技术，主要用于分离和测定样品中的化合物。
HPLC是液相色谱的一种进化形式，相比传统的液相色谱，其分离效率更高，分离速度更快。
下面将介绍HPLC的主要组成部分。
1.液相输送系统：液相输送系统由溶剂供应、进样、混合和泵送过程组成。
其中，溶剂供应单元负责提供所需的溶剂，通常由一个贮液瓶和一组输送管道组成。
进样器用于将待分析样品注入到流动相中，常见的进样方式有汽缸进样和自动进样器。
混合器用于混合不同的溶剂以得到所需的流动相。
泵送单元负责将混合好的流动相通过色谱柱进行分离。
2.色谱柱：色谱柱是HPLC中最为重要的部分，用于分离样品中的化合物。
色谱柱是由特定的填充材料填充而成，填充材料可以根据待分离样品的性质选择不同的类型，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
色谱柱通常由不锈钢、玻璃或硅胶等材料制成。
在色谱柱两端，通常会安装一些连接件，如高压接头和柱连器，以确保柱与其他部件的连接牢固。
3.检测器：检测器用于检测色谱柱流出的化合物，并将其转化为可以被记录和分析的电信号。
常见的HPLC检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、质谱检测器等。
不同的检测器可以对不同类型的化合物进行特异性检测。
4.数据处理系统：数据处理系统用于记录、处理和分析HPLC实验得到的数据。
数据处理系统通常由计算机和相关的软件组成。
计算机负责与HPLC仪器的其他部件进行通信，并将检测到的信号转化为数字数据。
软件则用于对数据进行处理和分析，如峰识别、峰面积积分和定量分析等。
5.控制系统：控制系统用于控制整个HPLC仪器的运行。
控制系统通常由一个控制面板和相应的控制器组成，用于设置和调节液相输送系统、检测器和数据处理系统的参数。
通过控制面板，用户可以设置流速、柱温、检测器波长等参数，以满足不同的分析要求。
UPLC(超高效液相色谱)简介
UPLC（超高效液相色谱）简介超越HPLC随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。
这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。
因此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将HPLC的极限作为自己的起点。
在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC时的主要目标是提高液相色谱的"精度"。
当时多数公司都认为HPLC技术已经发展到极致了、而同时用户对性能没有更高的需求，因此HPLC的目标应该是降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用。
针对这样的观念，Waters公司提出：HPLC的技术没有到达极限，用户对HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高对更好、更可靠的结果有极大的益处，对法规的遵从也是一个极大的促进。
站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的需求。
首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很短的时间内完成，例如代谢组学分析；其次是在生化样品及天然产物样品的分析中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在与MS及MS/MS等检测技术联用时，对连接的质量提出了更高的要求。
简而言之，我们需要"更快地得到更好的结果"。
今天我们发现，随着科学技术的进步，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角度的改进已经不行。
这就需要同时从科学与技术的角度出发，或者说从理论高度对液相色谱重新认识。
因此UPLC（超高效液相色谱）概念的提出也就十分自然。
简而言之，UPLC是用HPLC的极限作为自己的起点。
理论基础早在1956年，J.J van Deemter就发表了他著名的理论：van Deemter曲线及其方程式。
最早这个理论是用在气相色谱上的，但是后来出现的液相色谱上也能应用这个理论。
Waters公司引入UPLC的概念就是由研究这个著名的方程式开始。
首先探讨一下这个著名的方程式。
超高效液相色谱简介及应用比较
3 讨论与结论 3. 1 通过对磺胺类药物 HPLC和 UPLC的分析结 果比较 ,显示 UPLC的主要优势在于缩短了分析时 间 ,同时减少了溶剂用量降低了分析成本 。 3. 2 利用 UPLC技术 ,有助于解决传统 HPLC遇到 的分离组分愈多 ,耗时 、耗能愈大的技术问题 ,有效 地提高工作效率 ,并可进一步拓宽液相色谱的应用 范围 ,特别是对于基质复杂的混合痕量组分的分 析 ,通过 UPLC方法研究或从 HPLC 到 UPLC 方法 转换可获得更高的分析通量 。
[摘 要 ] 介绍了超高效液相色谱的技术特点和优势 ,并对磺胺类药物的测定进行了 HPLC和 UPLC两种条件下的分析比较 ,结果表明 :超高效液相色谱方法的突出优点体现在节省分析时间 和溶剂用量上 ,尤其对基质复杂的痕量组分测定采用该方法以提高分析通量是今后发展的必然 趋势 。 [关键词 ] 超高效液相色谱 ;磺胺类药物 ;高效液相色谱 ;分析
流速 /
(mL ·m in - 1 )
1. 0
0. 5
柱温 / ℃
30
30
进样量 /μL
20
2
波长 /λ
270
270
分析时间 /m in
25
3
溶剂用量
(mL) /样
25
1. 5
·50·
中国兽药杂志 2010, 44 (4) : 48～50 /胡海燕 ,等
表 2 UPLC与 HPLC测定猪肉中磺胺类药物数据比较
与传统的 HPLC相比 , UPLC的速度 、灵敏度和 分离度分别是 HPLC的 5 ～9 倍 、3 倍和 1. 7 倍 ,这 就拓展了我们进一步研究的空间 :保持分离度而追 求更快的分析速度 ,或在同样及较 HPLC更短的时 间内优化分离度再分出更多的色谱峰 。笔者利用 UPLC 转化参数换算 , 将同时测定磺胺二 甲嘧 啶 ( SM2 ) 、磺胺间甲氧嘧啶 ( SMM ) 、磺胺甲基异噁唑 ( SM Z) 、磺胺地索辛 ( SDM )和磺胺喹噁啉 ( SQ ) 5种 磺胺类药物的 HPLC 方法转换并优化为 UPLC 方 法 ,通过两种测定条件 (表 1)和检测图谱 (图 1、图 2)比较可知 : 5 种磺胺类药物的分离由原来的 25 m in (HPLC)缩短至 3 m in (UPLC) ,从而使一个样品 检测的分析时间缩短了约 1 /8, 进样量减少了 1 /
高效液相色谱HPLC简介
h
AB
1/10h
拖尾
T
f
＝
B A
前伸
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动
• 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。
• 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 • 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质
在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
确定最佳的溶剂强度
• “试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。
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1
发展背景
2
理论基础
3
仪器组成
4
实际应用及展望
20世纪90年代，高效液相色谱发展的目标应该是 降低成本、走向更低的价格以获得更广泛的应用 实际上，高效液相色谱的技术没有到达极限，用 户对HPLC有更高的要求 超高效液相色谱是用高效液相色谱的极限 作为自己的起点
UPLC(Ultra Performance Liquid Charomatography) UHPLC(Ultra High Performance Liquid Charomatography) UFLC(Ultra Fast Liquid Charomatography) …………
BEH(Ethylene Bridge Hybrid)
应用 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离
度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此UPLC在代谢 组学分析、天然产物的分析及其他一些生化领域有较 多应用。
使用UPLC与质谱检测器连接，会对天然产物分析， 特别是中药研究领域的发展是一个极大的促进。
因此，建立UPLC系统需要解决的主要问题： 1、提高色谱柱的性能； 2、高压溶剂输送单元（超过15,000psi,约103MPa）； 3、高速检测器；优化流动池以解决高速检测及扩散问 题； 4、完善的系统整体性设计。
输液泵压力： 6,000psi(42MPa)→15,000psi(103MPa) 色谱柱填料粒径： 5μm → 1.7μm 检测器流动池体积： 10μL→500nL 其他
氨基酸分析
HPLC 40min
UPLC 10min
天然产物分析
展望 发展更小粒径填料 与质谱仪联用 痕量及复杂天然产物、代谢产物的分析 发展国产超高效液相色谱
van Deemter方程简化形式：
H=a(dp)+b/u+c(dp)²u 理论塔板高度（H）与流速（线速度；u）及填 料颗粒度（dp）之间的关系，其中，a项代表了 颗粒度和柱床填装的优良程度；b项代表了轴向 扩散；而c项则代表了传质
Байду номын сангаас
由曲线可以看出： 颗粒度越小柱效越高 其次每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速 最后，更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线 速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围