高效液相色谱(HPLC)简介
hplc高效液相色谱
hplc高效液相色谱HPLC高效液相色谱简介高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），也被称为液相色谱法（Liquid Chromatography），是一种广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域的分离技术。
HPLC色谱技术通过物质在液体流动相和固定相之间的相互作用，实现对分子化合物的分离、检测和定量。
相对于传统的柱层析技术，HPLC具有分离效率高、分析灵敏度高、分析速度快等特点，被广泛应用于科学研究和工业生产。
HPLC的基本原理HPLC色谱技术是建立在分配系数理论的基础上。
它通过固定填料上溶解物质与流动相中溶解物质之间的分配与再分配，实现目标化合物在固定相中的分离。
HPLC色谱法的基本步骤包括：样品制备、装柱、选择流动相、进样、洗脱分离、检测及数据处理等。
HPLC的主要组成部分HPLC主要由一系列组成部分组成，包括：溶剂输送系统、无菌进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统等。
其中，溶剂输送系统用于控制流动相的输送速率和压力，确保流动相以一定速率通过色谱柱；无菌进样器用来将样品进样并转送到色谱柱中；色谱柱是分离目标化合物的关键组成部分，根据所分离物质的化学性质和目标要求选择合适的色谱柱；检测器用来检测溶质的浓度，并将信号转换为电信号输出；数据处理系统用来处理和分析检测到的信号，得出结果。
HPLC的种类和应用领域根据不同的分离机制和柱填料，HPLC可以分为很多不同的类型，包括：反相色谱、离子交换色谱、分子筛色谱等。
反相色谱是最常用的一种HPLC技术，其应用领域非常广泛。
例如，在药物研究领域，HPLC被广泛应用于药物分析、药代动力学研究、质量控制等方面。
在环境监测领域，HPLC被用来检测土壤和水体中的有机污染物、重金属和农药等化学物质。
在食品安全检测领域，HPLC被用来检测食品中的添加剂、农药残留和重金属等有害物质。
HPLC的发展和进展自HPLC技术在20世纪60年代首次提出以来，随着科学技术的不断发展，HPLC技术也在不断进步和改进。
什么是高效液相色谱(HPLC)
（高效液相色谱）？
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 2004年，液相色谱的仪器和 色谱柱技术取得了进一步发 展，在分离度、速度和灵敏 度方面实现了显著提升。需 要具有更小颗粒[1.7微米]的 色谱柱和具有专门功能的仪 器，提供15,000 psi [1,000 bar]的流动相，以达到更高 的性能水平。必须从整体上 创建一套新系统来执行超高 效液相色谱（现在称为 UPLC技术）。
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简史和一些定义
• 液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初 定义的概念。他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶 剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先 驱性研究。
• Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。他发现粉状白垩[碳酸钙] 和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。他将样品[均质化植物 叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。然后使纯 溶剂通过。当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样 品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快 于其他组分。
• 高效液相色谱法现在是分析化学领域的一种强大的工具。它能够 分离、鉴定和定量存在于任何可溶于液体的样品中的化合物。目 前，可以轻松鉴定出浓度低至万亿分之一[ppt]级的痕量化合物。 HPLC可以并且已经应用于几乎任何样品，例如药品、食品、保健 品、化妆品、环境基质、法医学样品和工业化学品。
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什么是超高效液相色谱（UPLC技术）？
• 目前，科学家们正在使用颗粒直径甚至 小于1微米的色谱柱以及能够在100,000 psi [6,800 bar]下运行的仪器来从事 基础研究。这让我们可以一窥这项技术 的未来。
• 图：HPLC色谱柱
高效液相色谱法 HPLC
1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
高效液相色谱法简介
高效液相色谱的特点
高压——压力可达150～300 kg/cm2。色谱
柱每米降压为75 kg/cm2以上。
高速——流速为0.1～10.0 mL/min。 高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中
同时分离成份可达100种。
高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
第二节
塑料块 Teflon
1 cm
工作电极 (Pt, Au, 碳糊)
e.电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理： 根据待测物在一些介质中电离后所产 生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质 的含量。 电导检测器的主要部件是电导池。其响应 受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温 箱中。另外，当 pH>7时，该检测器不够灵敏。 电导检测器不能用于梯度洗脱。
◆恒流泵
注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。
往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 （使用较多） 对流量变化敏感的检测器会有噪声 干扰，此时可连接一脉动阻尼器。
◆恒压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。
输液泵操作注意事项：
防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
F=2.3QKI0εCl
Q为量子产率，K为荧光效率，ε为摩尔吸光系 数，l为光径长度。
F=KC
特点：选择性好，
专属型检测器，灵敏 度比紫外检测器高 （检测限10-10 g/ml） 对多环芳烃，维 生素 B 、黄曲霉素、 卟啉类化合物、农药 、药物、氨基酸、甾 类化合物等有响应；
c. 示差折光检测器
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法的简介..
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法
液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂
分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
3.2 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
HPLC简介
高效液相色谱高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。
是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。
又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。
高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。
高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
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柱类型与温度选择性的关系
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•
柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度。
色谱柱条件
流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔 板数，在50度时较好。
其他因素
工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好
液相色谱贮液器的使用及维护
• 常用干净的无水甲醇试剂瓶作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但瓶盖与导 管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器， 即沉子，孔径为10μ m，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管 的重物，使导管能沉在并底。 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
高效液相色谱（HPLC）简介
什么是高效液相色谱(HPLC)？
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography ) —高效液相色谱 法 • 是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段: 高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器… • 广泛应用于各个领域: 医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业… • 无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段
特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏 度高，是通用型检测器。
紫外吸收检测器有三种类型
固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254nm或280nm紫外光。
可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光
光二极管阵列检测器photo－diode－array detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯 和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。
操作过程图示
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
HPLC的特点
项 目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
高效液相色谱法 样品制成溶液 溶液 吸附、分配、筛析、亲和等 UVD、PDAD、RID等 低、中、高沸点有机化合物 离子型无机化合物 热不稳定化合物 生物活性分子
流动相的选择原则
• • • • • • • • ①样品易溶，且溶解度尽可能大。 ②化学性质稳定，不损坏柱子。 ③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。 ④粘度低，流动性好。 ⑤易于从其中回收样品。 ⑥无毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高纯度，即色谱纯。 ⑧废液易处理，不污染环境
提高柱效的方法
• • • • 固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀 流动相粘度低 低流速 升高柱温。
流动相
• 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度 H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇 ＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 • 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
液相色谱图相关术语(1)
• 色谱图相关术语:
–色谱峰(Peak):色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的微分曲线 –峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线 –峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离 –峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰 底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰 高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
• 反相柱------固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团 的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、 乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出， 而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl） 等。
PDA 可以辅助定性。
液相色谱分析法的特点
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、 分离效率高和操作自动化。兼具分离和分析功能，可以在线检测。
高效液相色谱法的主要类型及原理
1、液-液分配色谱
2、液-固吸附色谱 3、离子交换色谱
4、离子对色谱
5、离子色谱 6、排阻色谱 7、亲和色谱(AC)
• • •
溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
Байду номын сангаас
←色谱峰
峰宽
基线 ↓ 峰高
时间(分)
液相色谱图相关术语(2)
色谱图相关术语: 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响 应值 标准偏差(σ )(Standard Error):0.607倍峰高处所 对应峰宽的一半 拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
h
A B 1/10h
拖尾
前伸
B T f＝ A
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动 保留时间(tR)(Retention time):组分从进样到出现峰 最 大值所需的时间
检测器简介（三）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。 色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气 （氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流 动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微 小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光 被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。
液相色谱类型
•
•
正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。
反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
评价液相色谱方法的标准
α，k'，N∶如何控制分离度?
K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱。 a 是分离因子，描述两个组分分离的好坏程度，是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
流动相不畅的原因 原因 管路阻塞 长了霉菌 管道有大量气泡造成空化 贮液并盖子太紧 解决方法 更换管路 用稀硝酸洗去管内微生物（洗前必须洗净醇类） 采用色谱的空灌注和湿灌注 抬高贮液并或向并内加压去掉沉子
色谱柱使用及维护（一）
• 在使用前一定要注意看使用说明，了解柱子的使用范围如pH值等，一般来说，硅 胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。 • 温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃； 5μm柱，＞70℃。 • 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。。 • 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器， 若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去 2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。 • 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降40～60 ％）。 • 使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） • 避免流动相组成及极性的剧烈变化 • 压力升高是需要更换预柱的信号
确定最佳的溶剂强度
• ―试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。 • 采用梯度洗脱的实验方法，即在20min内，高强度的溶剂的比例从5%增 加到100%，找出在梯度洗脱期间，流出峰到达中点的时间tx(即流出的第 一谱峰与最末谱峰之间的中心点)，然后用下式计算合适的流动相离开梯 度混合器的时间tk=tx-2t0-tD. • t0为死时间，tD为溶剂由梯度混合器流出，通过泵和所连管线到达柱子的 时间 最佳溶剂强度时溶剂浓度%：=初始浓度（%）+tk/20[最终浓度-初始浓度]
液相色谱分析法
（一）高效液相色谱分析的流程 1、由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导 入进样器。 2、被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检 测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。 3、废液流入废液瓶。 遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。 这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是 流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 • • （二）高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一 种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不 同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。