高效液相色谱分析
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过高效液相色谱技术，对给定的混合物进行分离和分析，掌握高效液相色谱仪的操作方法，以及对不同成分的定量分析。
二、实验原理。
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它利用高压泵将样品溶液以高压送入色谱柱，通过与填料相互作用而进行分离。
在色谱柱中，不同成分将因其在填料中的亲和力不同而被分离开来。
通过检测器检测各个组分的峰面积或峰高，从而进行定量分析。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将待分析的混合物溶解于适当的溶剂中，并进行过滤处理。
2. 色谱柱准备，连接色谱柱，并进行平衡处理。
3. 仪器调试，将色谱仪的流动相、检测器等参数进行调试。
4. 样品进样，将处理好的样品通过自动进样器送入色谱柱。
5. 数据采集，通过色谱仪软件进行数据采集和记录。
6. 数据分析，根据色谱图进行各组分的峰识别和定量分析。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功地对给定的混合物进行了分离和定量分析。
得到了混合物中各组分的峰面积和峰高，并通过标准曲线进行了定量分析。
实验结果表明，本实验的色谱分离效果良好，各组分分离度高，定量分析结果准确可靠。
五、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱技木的基本操作方法，了解了色谱柱的选择和调试、样品的制备和进样、数据采集和分析等基本步骤。
同时，我们也认识到了高效液相色谱技术在化学分析中的重要性和广泛应用性。
希望通过今后的实验操作，能够进一步提高我们的操作技术和分析能力。
六、参考文献。
1. Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage Learning.2. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (2011). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.以上就是本次高效液相色谱实验的全部内容，希望对大家有所帮助。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
高效液相色谱分析HPLC
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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§3-4 液相色谱法固定相
色谱柱是色谱法的心脏，固定相及装柱技术是关键。 一、液-液色谱法及离子对色谱法固定相 1.全多孔型担体：直径小于10µm（75/-4） 2.表面多孔型担体，目前不用。 3.化学键合固定相（P76及P69） a.成相：用化学的方法通过化学键把有机分子结合 到担体表面。常用18碳柱 b.特点76/-5：4点. 4.分离机制77/2：既不是全部吸附过程，亦不是典型 的液-液分配过程，而是双重机制兼而有之，只是 按键合量的多少而各有侧重.
第7讲
高效液相色谱
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离子对色谱分离过程示意图
第7讲
高效液相色谱
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五、离子色谱法 1.固定相:离子交换树脂 流动相:电解质溶液 检测器:电导检测器 主配件：抑制柱 2. 流程图：fig3-2 3.分离机制 （阴离子为例） a.双柱型：化学抑制型离子色谱法； b.单柱型：非抑制型，用低电导的洗脱液； 4.应用：从无机和有机阴离子到金属阳离子，从 有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用该法分析.
高效液相色谱
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第三章
高效液相色谱分析（HPLC）
§3-1高效液相色谱的特点 一、定义：液相色谱法是指流动相为液体的色谱 技术。 二、特点 1.高压: 可达150～350×105 Pa 2.高速: 例，分离20种氨基酸，经典色谱法要20 多小时，用HPLC只需1小时。 3.高效：3万塔板/米（GC2000塔板/米） 4.高灵敏度： 紫外检测器10-9 g 荧光检测器10-11g
高效液相色谱
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第7讲
高效液相色谱
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高效液相色谱结果分析
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析方法，它基于样品在液相中的分配
行为以及在固定相上的吸附和解吸行为。
它能够对样品中的物质进行分离、定量和定性分析。
高效液相色谱的原理如下：
1. 选择性分离：高效液相色谱中，样品混合物被注入装有固定相（柱填充物）的色谱柱中。
不同物质在柱填充物上的吸附和解吸速度不同，因此可以通过调整流动相的组成、温度和流速等参数来实现对样品中物质的选择性分离。
2. 吸附-解吸过程：在高效液相色谱中，样品溶解于流动相中，与固定相表面发生相互作用。
这个过程涉及吸附和解吸，吸附过程发生在固定相表面，解吸过程发生在固定相表面和流动相中物质的分配行为。
通过控制流动相的性质和柱填充物的特性，可以实现对不同物质的选择性吸附和解吸。
3. 柱填充物：高效液相色谱柱的填充物通常是多孔性固体颗粒，如硅胶或石英。
填充物的选择与样品的性质和分离的目的有关。
柱填充物的粒径、孔径和表面性质将影响色谱分离的效果。
4. 检测器：高效液相色谱的结果通过检测器进行检测和记录。
常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等，根据待分析物的性质和浓度选择适当的检测器。
总之，高效液相色谱是利用样品在液相中的分配和在固定相上的吸附解吸过程进行分离和定量分析的方法。
通过调整柱填充物、流动相和检测器等参数，可以实现对样品中不同物质的选择性分离和定量测定。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
分析实验报告高效液相色谱
分析实验报告高效液相色谱引言：高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC）是一种广泛应用于生物化学、药物分析、环境检测等领域中的分析技术。
其原理是利用固定相和液相之间的相互作用进行化合物的分离与定量分析。
本实验旨在通过操作高效液相色谱仪，掌握HPLC的基本原理、操作方法和数据处理技巧。
实验方法：实验所使用的仪器为Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪，柱为C18柱，以甲醇-水为流动相进行分离。
首先，使用样品溶液（如药物或化合物混合物）进行系统性能调试，包括柱温、流速、梯度洗脱程序等参数的优化。
根据实验要求，确定分离柱和流量。
然后，按照仪器操作手册的指导，进行初始条件设置、进样及洗脱等步骤。
最后，通过检测器检测到的信号，确定各组分的峰面积或峰高，以定量分析目标化合物的含量。
实验结果及分析：在实验中，我们以对硝基苯酚为目标化合物，进行了HPLC分离与定量。
首先，通过系统性能调试，确定了优化的柱温、流速和梯度洗脱程序等参数。
然后，按照仪器操作手册的指导，进行了初始条件设置、进样及洗脱等步骤。
最后，通过检测器检测到的信号，确定了各组分的峰面积。
在HPLC色谱图中，我们观察到了目标化合物对硝基苯酚的峰。
通过计算该峰面积，并与一系列标准溶液峰面积进行比较，可以确定目标化合物的含量。
分析实验结果，我们发现目标化合物对硝基苯酚在该条件下呈良好的分离，并且峰形较好。
根据峰面积的大小，可以定量分析目标化合物的含量。
而对于其他组分的峰，也可以据此进行进一步的鉴别和分析。
讨论：在本实验中，我们成功地运用了高效液相色谱进行化合物的分离和定量分析。
HPLC作为一种高效、灵敏的分析方法，广泛应用于生物化学、药物分析等领域。
然而，在实际应用中，仍存在一些问题需要解决。
例如，在一些情况下，可能会出现柱堵塞、峰形畸变等问题，影响分离效果和数据准确性。
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高效液相色谱分析
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于化学、生物学、环境科学等领域的分析方法。
它以液相为载流相，通过对样品溶液进行分离、检测和定量分析。
HPLC基于物质在固定相表面
上的分配和吸附性质的差异，通过调节流动相的组成、浓度和温度等参数，实现对样品组分的分离和定量。
高效液相色谱技术具有以下几个优点。
首先，它可以对
几乎任何类型和性质的化学物质进行分析。
不同于气相色谱仅适用于气体和挥发性液体的分析，HPLC可以处理各种样品类型，包括有机化合物、小分子药物、天然产物、生物大分子等。
其次，HPLC分析具有高度的灵敏性和选择性。
通过使用不同
类型和特定的固定相材料，可以实现对样品成分的高效分离和检测。
此外，HPLC具有较高的分辨率和重现性，使得得到准
确和可靠的分析结果成为可能。
高效液相色谱的基本原理是在不同固定相表面上，样品
分子在溶剂中以不同的速率分配和吸附。
为了实现对样品的有效分离，需要选择合适的固定相、流动相和检测方法。
固定相通常是多孔性颗粒，如硅胶、气相色谱柱填料等。
流动相是溶解样品的溶剂，其组成和性质对分析结果具有重要影响。
为了实现高效的分离和检测，常常需要优化流动相的组成和流速等参数。
检测方法通常使用紫外可见吸收光谱检测，通过测量样品在紫外可见光范围内的吸收强度，可以得到定量信息。
高效液相色谱可以应用于各种分析问题。
例如，在药物
研发和质量控制中，HPLC可以用于判断药物纯度、测定活性
成分浓度等。
在环境分析方面，HPLC可以用于检测水中的有
机物、重金属离子等污染物。
在食品安全和质量监控中，HPLC 可以用于检测食品中的添加剂、农药残留物、重金属等有害物质。
在生物医学研究中，HPLC可以用于分离和定量分析生物
样品中的代谢产物、蛋白质、核酸等。
为了实现高效的色谱分离和定量分析，HPLC方法的优化
是至关重要的。
首先，需要选择合适的固定相材料、柱尺寸和填充方式等。
不同固定相材料具有不同的化学性质和适用范围，需要根据分析目标进行选择。
其次，流动相的组成和流速等参数需要优化。
在优化流动相组成时，通常需要考虑实验操作的简便性和分析结果的准确性。
此外，还需要选择合适的检测方法和波长范围。
最后，对于一些复杂样品矩阵和分析条件，可能需要进行样品前处理、洗涤和预处理等步骤。
总而言之，高效液相色谱是一种强大的分析方法，具有
广泛的应用前景。
通过优化色谱分离条件和检测方法，可以实现对各种样品的高效分离和定量分析。
高效液相色谱技术对于化学、生物学、环境科学等领域的研究和应用具有重要意义，为科学研究和实际问题解决提供了强有力的工具和方法。