病毒盲传
猪的病毒性传染病——猪繁殖和呼吸障碍综合征
猪的病毒性传染病——猪繁殖和呼吸障碍综合征概述猪繁殖和呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”，本病以妊娠母猪的繁殖障碍(流产、死胎、木乃伊胎)及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道疾病为特征。
本病是20世纪80年代末发生于养猪业发达国家的一种病毒性疾病，在世界各国引发了空前的“流产风暴”，给世界养猪业造成巨大的经济损失，现已成为规模化猪场繁殖障碍和呼吸道疾病的主要疫病之一。
本病于1987年在美国首先发生，随后加拿大也报道了本病， 90年代初欧洲开始流行，在我国，本病首先于1995年底在华北地区规模化猪场发生，其后短短几年时问在我国大部分养猪地区流行。
本病曾称为“神秘猪病”、“新猪病”、“猪流行性流产和呼吸综合征”、“猪生殖与呼吸综合征”、“蓝耳病”、“猪瘟疫”等。
1991年，欧洲学者提出将本病命名为“猪繁殖与呼吸综合征”，1992年在美国的明尼苏达州召开的第一届国际研讨会正式采用该命名，也是世界动物卫生组织(OIE)正式定名。
OIE将该病列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病。
病原猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，属套式病毒目、动脉炎病毒科(Arterividdae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。
呈球形，有囊膜，直径在40～60nm之间，表面有约5nm大小的突起。
核衣壳呈二十面体对称，直径为25～30nm。
无血凝活性，不凝集哺乳动物或禽类红细胞。
有严格的宿主专一性，对巨噬细胞有专嗜性。
病毒的增殖具有抗体依赖性增强作用，即在亚中和抗体水平存在的情况下，在细胞上的复制能力反而得到增强。
病毒在氯化铯中的浮密度为1.13～1.19g/mL，在蔗糖梯度中的浮密度为1.18～1.23g/mL。
病毒的稳定性受pH和温度的影响比较大。
肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定
肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定罗青平;汪辉;张蓉蓉;温国元;王红琳;邵华斌【摘要】通过分子PCR检测,初步证明在湖北一发病肉鸽群感染H9亚型禽流感病毒.病原分离后,盲传3代,其血凝效价达到109～10H,经生物学特性进行测定,其鸡胚半数致死量为1075,9日龄鸡胚平均致死时间为54.3 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.8,6周龄小鸡静脉接种致病指数为2.0,证明该H9亚型禽流感为毒力较强.将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的H9亚型禽流感症状,采集其肺、喉头、泄殖腔等病变组织进行病毒分离,均可分离到H9亚型AIV.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】3页(P2170-2172)【关键词】肉鸽;H9亚型禽流感病毒;分离【作者】罗青平;汪辉;张蓉蓉;温国元;王红琳;邵华斌【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064【正文语种】中文【中图分类】S836H9亚型禽流感（Avian influenza，AI）是持续危害中国及世界养禽业发展的重要禽类传染病之一。
禽类感染H9亚型禽流感病毒后，常表现为呼吸道疾病、产蛋量降低、急性死亡等多种形式［1］。
虽然对禽的致病率低，但可引起生产性能下降，造成免疫抑制，因而在普遍存在复合感染的情况下，对养禽业造成的经济损失也很大。
同时H9N2亚型禽流感病毒还可感染人，提供内部序列与H5N1亚型禽流感病毒重组；并且具有人流感病毒的受体结合位点［2］，因此研究H9N2亚型AI的病原及防控对养禽业持续健康发展具有重要意义。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
病毒感染的实验诊断
病毒感染的实验诊断● 考点病毒的生物学性状病毒的实验室检查方法常见病毒的感染【内容讲解】第一节概述一类非细胞型微生物，个体极小，可通过细菌滤器，需用电子显微镜观察。
仅含一种核酸作为遗传物质，外被蛋白质衣壳或还有包膜。
病毒只能在活细胞内寄生，以复制的方式进行增殖。
在临床微生物感染中，近75%的传染病是由病毒引起的。
一、病毒的基本性状（一）形态结构1.大小和形状：大小：测量单位用纳米表示，一般在20-300nm之间。
形态大致可分为：球形或近似球形、杆状、弹形、砖形、蝌蚪形等。
2.结构（二）病毒的增殖病毒必须依赖宿主细胞，以特殊的自我复制方式进行增殖。
病毒的复制周期：吸附、穿入、脱壳、生物合成、组装与成熟、释放6个阶段。
异常增殖：顿挫感染：病毒进入细胞后的环境不利于它的复制，不能合成本身的成分或不能组装和释放有感染性的病毒颗粒。
缺陷病毒：由于病毒基因组不完整或基因位点改变而不能进行正常增殖的病毒。
干扰现象：当两种不同的病毒或两株性质不同的同种病毒，同时或先后感染同一细胞或机体时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象。
（三）噬菌体以细菌、真菌等为宿主，能引起细菌等裂解的病毒。
噬菌体特异性识别细菌表面受体，可用于进行细菌的鉴定与分型。
噬菌体感染细菌后产生两种后果：溶菌周期和溶源性周期。
（四）非寻常病毒比病毒更小更简单的致病因子，又称为亚病毒因子，包括类病毒、卫星病毒和朊粒等。
朊粒个体微小，不含核酸，其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白，对各种理化作用的抵抗力强，具有传染性，是引起传染性海绵状脑病的病原体。
朊粒致中枢神经系统退化性病变，引起牛海绵状脑病（疯牛病）。
克雅病（CJD）和Kuru病被认为与朊粒感染有关。
二、病毒的分类与命名科、属、种3级或科、亚科、属、种4级。
DNA病毒、RNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒三大类。
按传播途径可分为呼吸道病毒、胃肠炎病毒、经性传播感染的病毒等。
按感染部位与症状特征可分为肝炎病毒、出血性热病毒、疱疹病毒等。
动物微生物学中常见的病毒和细菌病诊断
陈双钊一常见的致动物疾病性病毒狂犬病病毒狂犬病病毒（Rabies virus）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是引起人和动物狂犬病的病原，该病在世界各地均有发生。
一、生物学特性病毒子长140～180nm，宽75～80nm，一端钝圆，另端平凹，呈子弹头形或试管形。
在螺旋对称的衣壳中，含有负股单股RNA。
具有脂蛋白的囊膜，在膜上有血凝素的穗状突起。
该病毒只有一个血清型。
二、抵抗力病毒在pH为7～9的范围内比较稳定，在56℃经30min可使病毒灭括。
五、致病性狂犬病病毒几乎可以感染所有的温血脊椎动物，同样也能感染人。
本病主要由患病动物咬伤后而感染。
当健康动物皮肤粘膜有损伤时，接触病畜的唾液亦可以感染。
病犬的唾液于症状出现前1～2周便可能会有病毒。
存在于病畜唾液中的病毒，通过咬伤而进入易感动物的皮下组织，然后沿着神经纤维由外周进入神经中枢。
也有人认为病毒是由外周经血液侵入脑组织。
病毒在脊髓和脑组织中增殖，并可按离心方向由中枢神经向外扩散，而脑脊髓液在病毒扩散中，亦起着重要作用，使所有器官都能查出病毒。
抵达唾液腺的病毒，在其上皮细胞内又大量增殖，并进入到唾液中。
病毒在中枢神经系统中的继续繁殖，损害神经细胞和血管壁，引起血管周围的细胞浸润。
神经细胞受刺激后，首先引起兴奋症状，如神经紊乱和反射性增高，后期神经细胞变性，逐渐引起麻痹，当呼吸中枢麻痹后即可造成死亡。
六、微生物学诊断常用的特异性检查方法有包涵体检查，动物试验，荧光抗体检查等三种。
（一）包涵体检查取大脑、小脑，特别是海马角部分，用刀片切开印片，趁印片未完全干燥时，以塞勒（Seller）氏液染1～5s，水洗、干燥、镜检。
内基氏小体呈鲜红色、间质呈粉红色、红细胞则为桔红色。
内基氏小体为圆形、卵形、核形、阿米巴形。
大小为24～27μm，位于细胞浆内。
用姬姆萨氏（Giemsa）染色，小体为红色（图10-1）。
由于有些犬、猪和草食兽的病例及病初死亡或早期剖杀动物中可能不见包涵体，所以并不是所有的病例都能检查出包涵体来。
眼部常见病毒有哪些
主要感染病毒有单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒、腺病毒和肠道病毒等。
1.疱疹病毒与人类眼部感染较密切的主要有单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒和EB病毒。
(1)单纯疱疹病毒：分I型和II型两个血清型，前者主要引起病毒性角膜炎。
微生物学检査：采集病变分泌物或组织标本接种于人羊膜、兔肾细胞培养，进行病毒分离，然后再用单克隆抗体或核酸杂交技术进行分型鉴定。
也可应用免疫电镜、免疫荧光法、酶免疫法或聚合酶链技术直接检查疱疹液、皮肤黏膜病灶刮取物、活检组织中是否存在病毒颗粒或特异性抗原。
刮取病变角膜上皮组织直接涂片检查可见病变上皮细胞大小不一，细胞肿胀融合，细胞核增大，核内可见包涵体。
血清抗体测定不能用于复发性单纯疱疹病毒感染的诊断，双份血清抗体效价测定有助于原发性单纯疱疹病毒感染的诊断，注意I型和II型抗体之间存在交叉反应。
(2)水痘-带状疱疹病毒：水痘病毒和带状疱疹病毒的抗原性相同，均具有疱疹病毒的形态结构特征，只有一个血清型;儿童时期感染引起水痘，潜伏后复发引起成人带状疱疹。
微生物学检查：刮取新鲜病灶的基底部细胞，固定后用免疫荧光法、酶免疫法、免疫电镜、免疫电泳和核酸杂交等直接检查病毒或抗原。
用人胚肾或人胚肺细胞进行分离培养，接种物为病灶早期内容物，然后用单克隆抗体进行鉴定。
酶联免疫吸附试验是常用的血清抗体测定方法。
(3)巨细胞病毒：形态结构与单纯疱疹病毒相似，但对宿主细胞有严格的种属特异性，人巨细胞病毒仅在人成纤维细胞中生长。
人群中巨细胞病毒的亚临床感染非常普遍，免疫功能低下者可引起巨细胞病毒性视网膜炎或葡萄膜炎。
微生物学检查:取患者的病变分泌物接种于人成纤维细胞或人胚肺细胞，进行病毒分离培养;由于巨细胞病毒生长缓慢，初次分离时常需1个月才出现细胞病变，然后用免疫荧光法进行鉴定。
也可采用组织病理学、脱落细胞学、免疫荧光技术、电镜观察、核酸杂交和聚合酶链反应等直接检查病变标本中是否存在病毒颗粒或特异性抗原。
微生物学[第七章病毒]山东大学期末考试知识点复习
![微生物学[第七章病毒]山东大学期末考试知识点复习](https://img.taocdn.com/s3/m/accd422ca5e9856a561260f8.png)
第七章病毒一、要点提示1．病毒是一类结构极其简单、具有特殊的繁殖方式的绝对细胞内寄生物；是既具有化学大分子属性、又具有生物体基本特征，既具有细胞外的感染性颗粒形式、又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。
2．病毒的宿主范围是病毒能够感染并在其中复制的生物种类和组织细胞种类。
根据病毒的宿主范围，可将病毒分为原核生物病毒和真核生物病毒。
前者包括噬菌体、噬蓝(绿)藻体和支原体噬菌体等，后者包括植物病毒、真菌病毒、原生动物病毒、无脊椎动物病毒和脊椎动物病毒等。
3．病毒主要依据包括病毒形态、毒粒结构、基因组、复制、化学组成在内的毒粒性质，病毒的抗原性质及生物学性质进行分类；按照ICTV 1998年提出的病毒命名规则命名。
4．病毒的分离与纯化，包括病毒的物理颗粒计数和病毒的感染性测定的定量分析，以及依据病毒感染的宿主范围及表现、病毒的理化性质、病毒的血细胞凝集性质、病毒的免疫学性质以及分子生物学性质进行的病毒鉴定是病毒学研究的基本方法，其对于病毒学的研究与实践具有重要的意义。
5．病毒具有确定的形态结构和化学组成。
病毒的基本结构是核壳结构，即包围着病毒基因组核酸(DNA或RNA)的蛋白质壳体。
壳体的基本对称形式是螺旋对称和二十面体对称。
有的病毒的核壳外还覆盖由细胞膜衍生而来的脂蛋白膜即包膜。
毒粒的主要化学组成包括核酸、蛋白质、脂类和糖类等。
核酸是病毒的遗传物质，病毒的基因组核酸有dsDNA、ssDNA、dsRNA、ssRNA 4种基本类型，其中根据基因组核酸是线状还是环状，是单一分子还是分段，以及单链核酸的极性分成不同的种类。
构成毒粒的结构蛋白包括壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶，它们各具有不同的功能。
6．病毒的繁殖是以复制方式进行。
病毒的复制周期大致可以分为连续的5个阶段：即吸附、侵入、脱壳、大分子合成和装配释放。
病毒表面蛋白特异地与细胞受体相互作用，导致病毒与细胞的结合，从而启动病毒的感染。
侵入是病毒感染的第二阶段，病毒能以核酸、或核壳、或毒粒等形式进入细胞，且不同病毒进入细胞的方式不同。
病毒分离鉴定
附件1 病毒分离鉴定采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种灵敏方法。
通常使用对猪瘟病毒敏感的细胞系如PK-15细胞等加入2扁桃体、肾脏、脾脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。
37℃培养4872小时后用荧光抗体染色法检测细胞培养物中的猪瘟病毒。
步骤如下1. 制备抗生素浓缩液青霉素10000IU/mL、链霉素10000IU/mL、卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL小瓶分装-20℃保存。
用时融化。
2. 取12g待检病料组织放入灭菌研钵中剪刀剪碎加入少量无菌生理盐水将其研磨匀浆再加入Hank’S平衡盐溶液或细胞培养液制成20w/v组织悬液最后按1/10的比例加入抗生素浓缩液混匀后室温作用1小时以1000g离心15分钟取上清液备用。
3. 用胰酶消化处于对数生长期的PK-15细胞单层将所得细胞悬液以1000g离心10分钟再用一定量EMEM生长液含5胎牛血清无BVDV抗体56℃灭活30分钟、0.3谷氨酰胺、青霉素100I U/mL、链霉素100I U/mL悬浮使细胞浓度为2×106/mL。
4. 9份细胞悬液与1份上清液混合接种68支含细胞玻片的莱顿氏管leighton’s或其它适宜的细胞培养瓶每管0.2mL同时设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照另设3支莱顿氏管接种猪瘟病毒作阳性对照。
5. 经培养24、48、72小时分别取2管组织上清培养物及1管阴性对照培养物、1管阳性对照培养物取出细胞玻片以磷酸缓冲盐水PBS液pH7.20.01M或生理盐水洗涤2次每次5分钟用冷丙酮分析纯固定10分钟晾干采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进行检测见附件2。
6. 根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度判定病毒在细胞中的增殖情况若荧光较弱或为阴性应按步骤4将组织上清细胞培养物进行病毒盲传。
临床发病猪或疑似病猪的全血样是猪瘟早期诊断样品。
接种细胞时操作程序如下取-20℃冻存全血样品臵37℃水浴融化向24孔板每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞37℃吸附2小时。
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盲传三代的意思就是：毒种接种细胞后未发现病变（一般是指观察指标，并不是检验指标）但是仍然按照正常收获手段进行收获即假设病毒存在、收获成功然后再按照正常的接种方法继续进行接种感染此之为“盲”如此再重复操作二次则为“盲传三代” 如此完成盲传后一般活性较低的病毒活性会逐渐增加从而产生CPE 即由“盲”转明另一种情况是盲传三代以后仍然没有病变则视为无病毒活性存在。
后面接种就采用冻融直接接就行不用滤掉碎片（大多数病毒都可以这样做）碎片对后期带毒培养基本没什么影响逐渐会被健康细胞给代谢掉的（窝吃窝啦。
呵呵）因为有些病毒是依附在细胞膜上的如果采用过滤或者离心去除细胞碎片的同时也会损失很多病毒。
当然如果你的病毒属胞外释放型的话是可以这样做的但确实不是很必要。
如果确实需要去除：
离心：一般只有超速离心或介质密度离才能将病毒沉淀下来，换言之中高速不会造成病毒损失的，那也就可以放心的离了只要看细胞碎碎片的去除效果即可视细胞破碎情况而定块大就转速低些块小就高些一般最少也得3000rpm以上的离个半小时能把肉眼见到的离心下去可以更高时间更长或者按RCF 800g以上平转离心效果比角转会好些但是角转机速度上限空间大。
总之要自己摸索而且做离心需要的量比较大，很增加工作量。
冻融接种时比较普遍的做法最多是有些病毒为释放彻底些而多做几次冻融也就是传说中反复冻融法、但要看你的是什么病毒是否皮实反复冻融是否会造成较大损耗别折腾几次把活性折腾没了。
盲传即是将收获的病毒液,再次种入细胞中,再次收获病毒液,
病毒传代常用的有两种：一种是鸡胚传代（主要用于禽源病毒），一种是细胞传代。
鸡胚传代将病毒稀释后接种9～11日龄鸡胚，一般在48～96小时左右收获病毒，然后再将收获的病毒液按上述同样方法再次接种和收获病毒，即为病毒传代。
细胞传代是指病毒接种细胞后一段时间后，消化细胞或收获病毒液，然后重新分装接种细胞。
所谓盲传，就是我们没有对培养的病毒进行检测，或者因病毒的量少不足以检测到，继续进行传代使病毒大量增殖。