植物原生质体相关材料
3.原生质体技术
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2、 原生质体的分离
渗透压稳定剂
在配制酶液时，必须加入适量的渗透压稳定 剂，以代替细胞壁对原生质体所起的保护作用。 因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于低 渗透压的溶液中，就会立即破裂死亡。 甘露醇和山梨醇等糖醇是最常用的渗透压稳 定剂，有时也用葡萄糖。糖醇一般用于游离叶肉 等材料的原生质体。葡萄糖则常用于游离悬浮细 胞的原生质体。渗透压稳定剂的浓度因植物材料 不同而异，一般为0.3～0.7mol/L。
中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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2、 原生质体的分离
试管苗的子叶、胚轴以及培养的悬 浮细胞具有无菌、不受生长季节影响等 特点。 许多试验结果指出，利用试管苗作 为供体材料时，苗龄对分离原生质体及 其后培养的效果影响较大。另外，培养 的悬浮细胞，如果经过多次的继代培养， 常常会出现再生植株能力减退和遗传上 的不稳定性等现象。
1.原生质体的研究概况
原生质体
核质体
植物细胞
胞质体
中南林业科技学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室
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1.原生质体的研究概况
1.2 原生质体的研究进展
1、1863年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast) 一词。 2、1892年，Klercker用刀片细切植物组织机械分离 出原生质体。 3、1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质 体获得成功。 4、1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质 体培养的再生植株。 5、1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水 稻原生质体培养再生植株。 6、1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养 再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
植物中原生质体和液泡的组成和功能研究
植物中原生质体和液泡的组成和功能研究植物细胞是一类多细胞生物的细胞，研究细胞的组成和功能对于整个生命科学领域具有重要的意义。
在植物细胞中，原生质体和液泡是两个重要的组分。
以下将详细介绍植物中原生质体和液泡的组成和功能研究。
一、原生质体的组成和功能原生质体是植物细胞内部大量的基质，占据了植物细胞的大部分空间。
原生质体由胞质、细胞器、质膜、细胞壁等组分构成。
其中，胞质是原生质体的主体，包含了细胞内的大部分酶、降解酶和有机物质等。
细胞器包括了质体、线粒体、叶绿体、内质网和高尔基体等。
质膜是细胞与外界环境的交界处，起着物质交换、信号传递和细胞形态维持等重要作用。
细胞壁与细胞质紧密相连，起着保护、支持和维持细胞形态等作用。
原生质体在植物细胞中起着着重要的调节作用。
原生质体中包含丰富的酶类物质，通过调节酶类物质的含量和活性来调节植物细胞的代谢过程和生长发育。
原生质体还具有水分调节和离子平衡等重要功能，保证细胞内环境的稳定。
此外，在植物对环境的适应和调节中，原生质体也起着重要的作用。
例如，植物对干旱和盐碱等逆境的适应，在一定程度上来说就是通过原生质体的调节实现的。
二、液泡的组成和功能液泡是细胞内一种具有膜限性的容器，又称为细胞液泡。
在植物细胞中，液泡的数量和大小均非常大。
液泡的主要成分是细胞汁，其中包含着大量的离子、酶类、有机酸和多糖等。
液泡膜是由亲水性分子—磷脂类物质组成的膜，与质膜、内质网和高尔基体等膜系统互相联系。
液泡在植物细胞中具有多种重要的功能。
液泡包含大量的离子和有机物质，因此能够起到贮存、运输和分泌物质等重要作用。
例如，植物中大部分的调节物质就是经由液泡释放的。
此外，液泡还能够通过扩张和收缩来调节植物细胞的大小和形态。
在植物对环境适应和调节中，液泡也起着重要的作用。
例如，植物对寒冷和热带等不同环境的适应，在一定程度上也是通过液泡调节实现的。
三、原生质体和液泡的关系虽然原生质体和液泡都是植物细胞内部重要的组成部分，但它们之间的联系也非常密切。
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
烟草原生质体的分离纯化
烟草原生质体的分离纯化烟草原生质体（Nicotine Protoplast）是指烟草（Nicotiana tabacum L.）细胞中存储和合成尼古丁的部位。
作为一种重要的生物资源，烟草原生质体在药物开发、化妆品生产、食品添加剂等领域具有广泛的应用前景。
为了更好地利用烟草原生质体，需要对其进行了分离纯化。
本文将详细介绍烟草原生质体的分离纯化方法及其应用前景。
材料和方法实验材料：烟草植株：Nicotiana tabacum L.实验设备：高速离心机恒温摇床无菌操作台旋转蒸发器微量进样器实验试剂：缓冲液（pH 4）葡萄糖聚乙二醇（PEG）十二烷基硫酸钠（SDS）乙酸乙酯氯仿酚红指示剂尼古丁标准品实验步骤：萃取：将烟草植株剪成碎片，加入缓冲液，用高速粉碎机粉碎。
然后，用缓冲液冲洗粉碎后的材料，收集冲洗液。
分级沉淀：将冲洗液加入无菌操作台中，加入甘露醇和葡萄糖，用高速离心机进行分级沉淀，收集沉淀物。
透析：将沉淀物移入透析袋中，用缓冲液进行透析，去除小分子杂质。
超速离心：将透析液加入高速离心机中，用氯仿和甲醇进行超速离心，收集有机相。
萃取：将有机相加入无菌操作台中，加入缓冲液和尼古丁标准品，用高速震荡器震荡，收集震荡液。
透析：将震荡液移入透析袋中，用缓冲液进行透析，去除小分子杂质。
冻干：将透析液进行冻干处理，得到烟草原生质体粉末。
结果与数据分析通过对比不同实验步骤的实验数据，我们可以得出以下萃取和分级沉淀可以有效去除杂质，提高烟草原生质体的纯度；透析可以进一步去除小分子杂质，提高烟草原生质体的纯度；超速离心可以有效地将有机相和无机相分开，收集到有机相中的尼古丁；萃取和透析可以进一步去除杂质，得到高纯度的烟草原生质体粉末。
应用前景作为一种重要的生物资源，烟草原生质体在未来的应用前景广阔。
烟草原生质体可以作为药物开发的重要原料，用于制备尼古丁药物。
烟草原生质体中的尼古丁是一种天然的杀虫剂，可以用于生产绿色、无残留的化妆品和食品添加剂。
植物原生质体培养的技术流程
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原生质体
原生质体（Protoplast）:指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。
一、原生质体的应用由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。
原生质体可以用于下面几种研究。
用作细胞杂交服务于作物改良用作遗传转化的对象研究细胞壁的发生过程筛选突变体膜的结构、运输、激素接受位点等的研究用于分离细胞器和大分子种质资源保存二、原生质体分离、纯化原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。
（一）分离方法机械法分离缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力酶法分离 Cocking最早开展这方面研究克服了机械法分离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。
酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。
（二）影响原生质体分离的因素（酶法）从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。
但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。
原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。
1. 外植体来源:生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。
用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物（Suspension cultures）、原球茎、花瓣和叶表皮等。
叶肉细胞是常用的材料,因为叶片很易获得而且能充分供应。
取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。
另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒.选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。
一般在继代后的第三天游离原生质体。
原生质体培养方法和再生植株的遗传与变异
压，否则细胞团不会继续生长。待 小愈伤组织长至1 -2mm时，应及时
转移至固体培养基使其进一步生长
4.植株再生
原生质体培养再生的愈伤组织可直接转移到分化培养基，一步成苗 （器官发生）。愈伤组织也可通过体细胞胚发生，先形成胚状体，再 诱导生芽、生根。不同植物种属，其再生方式不同
供体细胞的分化程度：同一个基因型的植株生长在不同的环境条件下，其 生理状态会有改变。供试植株最好生长在控制条件下，以提高原生质体的细 胞分裂频率和再生能力，并且可提高实验重复性
柑橘：叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生，只有胚性愈伤 组织来源的原生质体才能再生
起始培养密度与培养基
–起始培养密度：适宜密度为1-5×105/ml –培养基激素水平：柑橘不添加外源激素，也可再生 –培养基营养成分完全性：越丰富越好
仙客来原生质体的再生
香蕉原生质体再生—Assani等2006 看护培养
Sugarbeet （糖 甜菜）callus and protoplast regeneration
影响原生质体培养的主要因素
基因型
– 番茄与秘鲁番茄有性杂交后性状分离的遗传分析表明，其愈伤组 织再生能力受2个显性基因决定(Koornneef等1987)。Cheng和 Veilleux(1991)对芙薯(S. phureja)原生质体培养能力进行遗传 分析，证明从原生质体培养到形成愈伤组织受2个独立位点的显性 基因控制(Cheng等1991)
• 变异程度的大小与起始材料及培养过程中产生的 变异有关
• 原生质体再生植株变异可为体细胞遗传学研究和 品种改良提供有益的材料
• 从原生质体培养再生植株已选育一些新品种（体细
胞突变育种）
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植物原生质体相关材料2013-9-2 From HZB一、植物材料研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。
根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。
花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。
材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
1. 细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织：取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。
从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。
具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。
通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。
2. 叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。
取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。
要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的：（1）光强为3000-6000lx。
（2）温度为20-25℃培养。
（3）相对湿度在60％-80％左右。
植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。
3. 植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。
这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。
例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。
在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。
龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。
但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。
二、酶1. 酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。
分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。
这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。
日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。
即二步法降解。
2. 渗透稳定剂植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。
因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol/L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，它可提高原生质体的稳定性。
这种物质可使RNA酶不活化，并使离子稳定。
3. 酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和活力影响很大。
例如，用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为5.0时，原生质体产生一得很快，但损坏较严重，并且培养后大量破裂。
当PH值提高到6.0时，最初原生质体却产生少，但与pH值为5.0时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。
原始pH值提高到7.0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
三、原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10-30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
对于这几种酶来说，最佳处理温度在40-50℃，但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25℃左右进行酶解。
1. 叶片、子叶等材料取已展开的生活叶片，用0.53％次氨酸钠和70％酒精进行表面灭菌，然后切成2cm2。
把4g叶组织置于含有200ml不加蔗糖和琼脂的培养基500ml三角瓶中，在4℃黑暗条件下培养16～24h。
之后将灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮；如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
叶片转入含有纤维素酶、果胶酶、无机盐和缓冲液的混合液中，pH值为5.6，通常在酶液中使用的等渗剂为0.55～0.6mol甘露醇。
然后，酶液真空渗入叶片组织。
在28℃条件下，每分钟40转的旋转式转床上培养4h后，叶片组织可完全分离。
2. 悬浮细胞等材料用悬浮培养细胞，可不经过果胶酶处理，因为悬浮细胞液主要由单细胞和小细胞团组成。
如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
取悬浮细胞放入10ml的酶液中（3％纤维素酶，14％蔗糖，pH值5.0～6.0），在25～33℃条件下酶解24h。
原生质体一酶混合液用30um的尼龙网过滤，通过低速离心收集原生质体。
四、影响原生质体分离的因素1.酶制剂活力和纯度粗制的商品酶含有核酸酶和蛋白酶等杂质，它们对原生质体的活力是有害的。
酶的活性还与pH值有关。
Onoznka纤维素酶R-10和离析酶R-10的最适宜pH值分别为5-6和4-5。
不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7-6.0之间。
2. 渗透稳定剂的作用在分离原生质体时，渗透稳定剂有保护原生质体结构及其活力的作用。
糖溶液系统可使分离的原生质体能再生细胞壁，并使之能继续分裂，其缺点是有抑制某些多糖降解酶的作用。
盐溶液系作渗透稳定剂时对材料要求较严格，且使原生质体稳定，使某些酶有较大活性。
但是易使原生质体形成假壁，同时使分裂后细胞是分散的。
五、原生质体的净化和活力测定在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片、维管束成分、未解离细胞、破碎的原生质体以及微生物等。
这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。
此外，还需去掉酶溶液，以净化原生质体。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：1. 将原生质体混合液经筛孔大小为40-100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2.将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r/min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3.将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4.用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104-106/ml。
在原生质体培养前，常常先对原生质体的活性进行检测。
测定原生质体活性有多种方法，一是凭借形态可识别原生质体的存活性，二是采用特异的染色方法来确定。
可用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色；最好是采用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，有活力的原生质体带有荧光，无活力的不产生荧光。
FDA染色测活性的方法如下：取洗涤过的原生质体悬浮液0.5ml，置于10×100mm的小试管中，加入FDA溶液使其最终浓度为0.01％，混匀、置于室温5min后用荧光显微镜观察。
激发光滤光片用QB24，压制滤光片用JB8。
发绿色荧光的原生质体为有活力的，不产生荧光的为无活力的。
由于叶绿素的关系，叶肉原生质发黄绿色荧光的为有活力的，发红色荧光的为无活力的。
六、原生质体的培养常用的原生质体培养方法有以下几种：1.液体培养法：是把纯化后的原生质体悬浮于液体培养基中的培养方法。
2.固体平板法：是把原生质体均匀地埋入琼脂培养基中的培养方法。
3.双层培养法：是在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液的培养方法。
来源：/doc/view-d2537567.html/view/81ecfaf39e314332396893a6.html。