植物原生质体的分离与培养
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。
原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。
植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。
二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。
保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。
三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。
四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。
以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。
另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。
- 1 -。
植物原生质体的分离
实验原理
对细胞壁成分进行降解后分离得到。在 适宜的培养条件下，分离的原生质体又 可重新合成新的细胞壁，经过细胞分裂 并再生成完整的植株。原生质体培养的 条件和对营养的要求与组织、细胞培养 相似。但原生质体由于是除去了细胞壁， 所以培养基中有一定浓度的渗透压稳定 剂来保持原生质体的稳定。常用的渗透 压稳定剂。
植物原生质体的分离与培养
实验目的
掌握植物原生质体的分离、提纯和培养 技术。 掌握无菌操作技术
实验原理
原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、 裸露的、有生活力的原生质团。原生质体可从 培养的单细胞、愈伤组织和植物器官(叶、下 胚轴等)获得。但一般认为从叶肉组织分离原 生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便， 供应及时，而且遗传性较为一致。而从单细胞 和愈伤组织分离到的原生质体，由于受培养条 件和继代培养的影响，易使细胞间发生遗传和 生理差异。所以从培养的单细胞和愈伤组织中 获得的原生质体不是十分理想的材料。原生质 体的分离通常采用酶解法，
实验结果
2012.11.15观察为下图情况 2012.11.22观察仍无任何变化。
实验失败的原因分析： 1、培养基配制可能出现问题。 2、接种前用显微镜未检测出原生质体是 否存在。
实验原理
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、 盐类等。培养基中添加生长素、细胞分 裂素也是必需的高等植物原生质体除了 用于细胞融合的研究以外，还能通过它 们裸露的质膜摄人外源DNA、细胞器、 细菌或病毒颗粒。原生质体的这些特性 与植物细胞的全能性结合在一起，已经 在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一 个理论和应用研究的崭新领域。
实(离心管带盖)，用600r／ min的速度离心5min，使完整的原生质体沉淀。 用吸管除去上层酶液，加人洗涤液，小心将原生质体 悬浮起来，待悬液充分混匀后，再离心一次。这样反 复洗涤2-3次，洗净酶液与残余的细胞碎片。 加入适量(如4nd)的原生质体培养基，小心将原生质体 悬浮起来，取少量用血球计数板计数。离心去掉上述 加入的培养基，再按计数结果加入相应量的培养基， 使培养基中悬浮原生质体的密度为105／ml。 用吸管将原生质体悬液转人灭过菌的培养皿内，控制 液体的厚度在1 mm左右，并用封口膜封住培养皿，置 26℃下恒温培养
原生质体无菌分离培养与融合
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高pH法
头，滤膜（*4） 和电融合法。
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部，然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。 加1ml13%CPW洗液悬浮。
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头，滤膜（*4）
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有
效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。
材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW
原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 CPW洗生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
植物原生质体培养
3 提取方法
①机械分离法（Machanical isolation） ②酶法分离（Enzymatic isolation）
①机械法
早在1892年，克莱若克（Klercker）就已采用机 械法分离原生质体。 方法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织， 在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁，从而释放出完整的原生质体。 缺点：产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点：可获得大量的原生质体，几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点：酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质，影响原生质体的活力。
注意事项： ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450～800mmol/L
⑵酶处理： 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500～1000rpm,离心5～6min）。 第三步吸去上清液，沉淀物重新悬浮，再离心 沉淀。如此2～3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。
植物原生质体培养
原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。
原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。
在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。
营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。
(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。
这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。
一、原生质体(protoplast)的分离（一）材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。
自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。
通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。
原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。
1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。
他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。
然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
第五章 植物原生质体的分离与培养
八. 原生质体融合
（二）杂种细胞的选择与细胞杂种的鉴定 1. 杂种细胞的选择方法 （1）培养基促进异核体生长的选择方法 （2）叶绿素缺失互补选择法 （3）机械分离，肉眼分辩法 （4）双突变系选择法 （5）荧光标记选择法
八. 原生质体融合
2. 体细胞杂种的鉴定
这种鉴定不但在于确认细胞杂种的杂种
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
原生质体的融合过程
八. 原生质体融合
八. 原生质体融合
（一）原生质体融合的方法 1. 无机盐诱导融合 用来做融合剂的无机盐是硝酸钠，1972年
Carlsony就是用它来融合烟草的原生质体，并 首次获得种间的体细胞杂种。其原理是硝酸钠 的作用是中和了质膜的负电荷，使原生质体不 再相互排斥，而紧密结合在一起，但硝酸钠对 原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以 目前很少有人采用。
二. 植物原生质体的基本特点与作用
5.植物原生质体为研究细胞壁的生物合成
提供了方便。 6.植物原生质体为研究细胞膜与信息的传 递，能量的转换，物质的运输等基本现 象之间的密切联系提供了可能。 7.植物原生质体不但是良好的受体，同时 又是分离细胞内各种细胞器，如细胞核、 叶绿体、线粒体等的好材料。 见图1：
融合技术要点：
P1 P2
混合静止1min
P1 P2
加入PEG
选 择
培 养
高Ca2+高pH
加入培养基
融 合
洗 涤
电场下形成原生质体凝聚体
八. 原生质体融合
3. 电融合技术
就是使用电融合仪，其优点在于避免了
《细胞生物学》实验指导书(不太全供参考).doc
《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
克服有性杂交不亲和、雄性不育、多胚性干扰及花期不遇等常规 育种中的问题
实现远缘物种与近缘栽培种之间的遗传物质的转移
实现核基因的重组与细胞质基因组的重组，特别是在转移线粒体 及叶绿体控制的有益性状方面，具有得天独厚的优势
已经获得了具有优良性状的作物品系
要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组 织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一
完整植株
愈伤组织
无菌试管苗
悬浮细胞
2 原生质体分离的基本方法
机械分离法
在高渗溶液中，是植物细胞质壁分离，机械切割细胞壁，在质壁 分离复原时，原生质体从切口处释放
酶解分离法
采用可以消化细胞壁的酶（如纤维素酶、果胶酶等）处理移除细 胞壁，释放原生质体
包括原生质体的分离、培养及植株再生过程
红豆草原生质体培养
原生质体培养的意义
基础理论研究 体细胞杂交 遗传转化 无性系变异及突变体的筛选 细胞器的分离与导入 种质资源保存
基础理论研究
便于开展因细胞壁存在而难以进行研究的课题 在单个细胞水平研究细胞壁的再生、细胞膜的通
机械分离法
早期使用较多 仅限于具有较大体积、
液泡化的细胞 原生质产量低 很难得到完整原生质体
酶解分离法
常用酶类 酶液配制 酶解分离原生质体
酶液配制
酶溶剂：一般可以采用原生质体培养基或特殊配制
渗透势：去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的 渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、 洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者 比细胞内渗透压略大些葡萄糖、甘露醇或山梨醇等
遗传转化
排除细胞壁上的核酸酶阻止外源DNA进入细胞的作用 使原生质体利于从外界摄取DNA、染色体、细菌、病毒及细胞
器、蛋白质等 对单个原生质体进行准确操作，避免出现嵌合体 可以获得大量均一的原生质体，利于转化成功及条件筛选 已经成为遗传工程较为适宜的转化体系，特别是在瞬时表达方
成功 通过原生质体获得再生植株的植物约有300余种，其中有20多种为我国
首先报道
二：原生质体的分离
原生质体供体的选择 原生质体分离的基本方法 原生质体的纯化 原生质体活力的检测 影响原生质体分离的因素
1 原生质体供体的选择
植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤组织 和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料
胶体性质
胶体是物质的一种分散状态，一种或几种物质以1-100 nm大小的颗 粒分散于另一种物质中
带电性与亲水性 扩大界面 凝胶作用 吸胀作用
液晶性质
3 原生质体培养定义及意义
原生质体培养（Protoplast Culture）：
利用去掉细胞壁的原生质体为外植体，离体进行细胞培养，以获得 再生植株及细胞产物的培养方法
pH：纤维素酶及果胶酶单独使用时，其pH分别以5.4及5.8 为宜；混合使用时pH5.4-pH5.6为宜。但对于细胞来说， pH6-7较为适宜
过滤：酶液配制后需以0.45 μm微孔膜过滤除菌，而不可采 用加热灭菌法
酶解分离
方法： 一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理 2—24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶 脱壁而释放原生质体
原生质体：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质 膜所包围的裸露细胞
包括细胞膜及膜内细胞质及其它具有生命活性的 细胞器
特点：
无细胞壁，质膜直接与外界接触，利于摄取外来遗 传物质
便于进行细胞融合，形成杂交细胞 仍具有全能性
2 原生质体的性质
物理性质
张力 黏性及弹性 流动性
种质资源的保存
低温保存，具有细胞低温保存的所有优点 对低温伤害对细胞内部结构伤害的研究提供了便利的材料
4 原生质体培养的研究进展
1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词 1892年，Clercker首次以机械方法从藻类中分离到原生质体 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功 1971年，Takebe 首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株 1985年，Fujimura 第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株 1986年，Spangenberg 单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得
酶解时间：酶解时间几十分钟至几十小时不等、以原生质体游离下 来为准 酶浓度 供体材料比例 酶解温度
酶解条件 酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几 下。 对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上， 低速振荡以促进酶解
第六讲：植物原生质体的分离与培养
主要内容
原生质体培养的概念、意义及研究进展 植物原生质体的分离 植物原生质体的培养 原生质体培养实例
一：原生质体培养的概念、意义及研究进展
原生质体 原生质体的性质 原生质体培养概念及意义 原生质体培养的研究进展
1 原生质体（Protoplast）
面
无性系变异及突变体的筛选
无细胞壁的保护，对外界理化因子的诱变更为敏感，突变频率 高
突变后，可以通过有丝分裂保持下来，并一直维持纯系
细胞器的分离与导入
以原生质体为材料，温和破碎质膜，可以分离到完整的细胞 器，如叶绿体、线粒体、细胞核甚至染色体等，用于细胞器的 结构、生理生化功能研究，以及分子生物学分析提供了便利条 件
透性及离子转运、细胞分裂及分化等 以原生质体制备膜包小泡，研究物质运输及贮藏
等 生殖细胞原生质体利于研究花粉离体萌发机理、
发育过程、机理及调控，发育过程中的细胞骨架 的变化及花粉壁的形成；精卵体外融合及培养等 作为抗寒、抗热等的材料，为早期筛选抗性植株 提供材料，节省时间，空间及资源
体细胞杂交