植物原生质体融合技术
植物原生质体融合技术
要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细 胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效 手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优 化生物反应器，实现融合过程的自动化和连 续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参 数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间 优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中 基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗 病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以 及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通 常在特定的电融合装置中进行，需要 在特定的电场强度和脉冲时间下进行 操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等 诱导原生质体融合，通过调节PEG浓 度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出 具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
植物原生质体融合技术
融合
B. 高Ca2+和高pH值融合
• Ca2+浓度 0.05 mol/L • pH 9.5-10.5
具体做法(以烟草为例)
• 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的 比例混合;
• 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; • 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液，
FDA
荧光素
活细胞
活细胞 死细胞
死细胞
原生质体分离纯化流程图
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 植物原生质体的制备 • 植物原生质体的培养 • 植物原生质体的融合
二、植物原生质体的培养
1、原生质体的培养方法 2、原生质体培养程序 3、原生质体培养成功的技术关键
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
◆ Wh
植物细胞模式图
高尔基体
液泡
微丝
叶绿体 线粒体
质膜
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
◆ What 基本原理
4、原生质体的纯化
• 去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质
A、过滤法 B、漂浮法 C、离心法
例: 烟草叶肉细胞原生质体的 分离
1). 材料的准备与消毒： 2). 酶解： 3). 纯化： 4). 原生质体的活力测定
1). 材料的准备与消毒
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起，以形成单一的细胞。
在实验室中，原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法：
1. 制备原生质体：收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物：在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合：通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损，让细胞形成互通。
4. 分离融合物：将融合物分离出来，并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果：使用显微镜观察细胞是否真正融合，或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是，原生质体融合需要谨慎操作，避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中，需要仔细选择不同类型的原生质体，以确保它们能够融合。
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合的方法
植物原生质体融合技术是一种准确、灵活和快速的分子育种技术，它可以将一种植物中的遗传物质与另一种植物的遗传物质融合在一起，以获得更有效的育种方法。
下面介绍植物原生质体融合技术的基本概念和其应用：
一、植物原生质体融合技术的基本概念
1、原生质体的定义：原生质体（Protoplast）是指细胞原有的稳定的液体质结构，在植物细胞当中占据重要的分子物质，可以被用来搅拌，冷冻，施主或克隆植物细胞的核酸，蛋白质以及其他的分子物质。
2、破壁法的原理：破壁法是一种用于分离出植物原生质体的方法，它利用酶和/或静电力，这种酶使细胞壁细胞可以被剥离出来，从而形成原生质体。
3、原生质体融合技术：原生质体融合技术就是利用破壁法将不同植物的原生质体融合起来，以获得新的基因组的遗传材料，从而为植物的育种提供了新的思路。
二、植物原生质体融合技术的应用
1、引入新基因：原生质体融合技术可以有效地引入一些新的基因材料到植物细胞，从而改变植物的性状特征，从而获得抗逆性、抗病性、烘焙品质和其他重要特征，使植物更适应环境条件。
2、突变：通过将不同植物原生质体融合起来，可以引发基因突变，从
而获得新的外观形状或性状，更好地提高植物的繁殖力和适应性。
3、抗逆育种：原生质体融合技术可以有效地增强植物细胞体抗病性和抗逆性，从而大大提高植物的耐受性，使一些极端的环境能够更好地适应植物的生长和发育。
总而言之，植物原生质体融合技术旨在将宿主植物中基因携带的遗传改良物质融入受体细胞中，以获得更多优良育种材料，从而提高植物的适应性和抗逆性，从而提升作物的产量。
14.4原生质体融合的方法
原生质体融合的方法原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。
一、盐类融合法1909年，Kuster用低渗NaNO溶液引起原3生质体的融合。
融合方法获得1972年，Carlson等用NaNO3了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。
原理：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2等。
通过改变细胞膜表面的理化特性，增加细胞的内吞作用，而实现融合。
应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
二、高钙-高pH融合法1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5mM CaCl2·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。
原理：CaCl 2•2H 2O 0.05mol /L ，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。
异核体形成率有所提高，但对细胞有一定毒害，目前已不太应用。
三、聚乙二醇（PEG）融合法1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。
因此，该方法迅速展开。
1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。
薯番茄或番茄薯PEG融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成分子桥，进行融合。
四、PEG 、高钙-高pH 相结合的融合法PEG 融合液PEG600030%Ca(NO 3)2•4H 2O0.1M 甘露醇0.4-0.6M pH 10.0五、电融合法开发较晚，1979年，Senda发现电融合方法。
由于对细胞无毒害，已广泛应用。
电融合必须有融合仪和融合板。
电融合仪融合板两个电极原生质体电融合的基本程序①细胞膜的接触：两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状；②膜的击穿：再给以瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部受损失而导致融合。
园艺植物原生质体融合技术研究进展
1 引言原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。
植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。
原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。
原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。
原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。
经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。
1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。
随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。
第六章 原生质体融合
2 高pH(10.5)-高Ca离子法
1973年：Keller和Melchers用pH10.5的 50 mMCaCl2溶液在37℃时，诱 发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。
细胞质杂种
细胞质杂种只具有一个亲本的细胞核，而具 有两个亲本细胞质的遗传物质，细胞质杂种可用 来转移细胞质基因所决定的遗传性状，如胞质雄 性不育基因，抗除草剂基因及其对某些抗生素抗 性的特征，以及一些光合作用有关的特征，均可 通过胞质杂种来转移这些优良基因，因而在遗传 育种中具有重要意义。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一 亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞 质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一 亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同 的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因 组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。
植物+植物 植物+动物 动物+酵母
PEG法原理
PEG是一种带负电性的高分子化合物， 在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以 使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被 洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜 大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原 生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。
原生质体的融合过程包括3个主要阶段：
1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。
①凝聚作用阶段：
两个或两个以上原生 质体膜彼此靠近
②小区域融合阶段：
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• 盐类融合的优缺点
–优点：盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小 –缺点：融合频率低，对液泡化发达的原生质体不易诱发 融合
B. 高Ca2+和高pH值融合
• Ca2+浓度 0.05 mol/L • pH 9.5-10.5
具体做法(以烟草为例)
• 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的 比例混合; • 加入0.05mol/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇; • 再用甘氨酸钠缓冲pH值到10.5，成为融合液， 同时在37℃下保温0.5h; • 用0.4mol/L甘露醇洗净高CaCl2和高pH值； • 两种原生质体的融合率达到10%。
•
器官形成植株再生：
– 从愈伤组织诱导发生 – 胚状体发育
3、原生质体培养成功的技术关键
• 原生质体的活力
–影响因素：制备原生质体的方法，渗透压稳定剂种类、浓度， 质膜稳定剂种类、浓度，温度和保温时间
• 原生质体密度
– 起始密度一般为104-105 个/mL
• 细胞壁再生速度
– 植物种类和取材的生理状态；培养细胞所处的时期；酶解时 所用质膜稳定剂种类
★ 植物根尖组织
－可由各种植物的种子萌发后取得
★ 植物花粉
－产生单倍体原生质体
★ 愈伤组织、悬浮培养的细胞
－细胞壁容易解离
3、原生质体的分离
A、原生质体的分离方法
★ 机械分离法 －先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分 离，原体质体收缩成球形式，再用机械法磨碎细胞，从伤 口处可以释放出完整的原生质体。 －优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 －缺点：获得完整的原生质体的数量比较少。 ★ 酶解分离法 – 常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶 酶、果酸酶等 – 优点：可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或 它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。 – 缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及 酚类物质。影响所获原生质体的活力。
电融合基本过程
1. 将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微电极型 只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm， 整个装置放在一个培养皿中
◆ 聚乙二醇（PEG）融合法
◆ PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法 ◆ 电融合法
回顾：诱导动物细胞融合的方法 1、病毒诱导细胞融合 2、化学融合剂诱导细胞融合
3、电融合法
A. 盐类融合法
• 盐类融合剂种类
–硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 –氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 –葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫酸钠
• 细胞融合的意义：
– 克服种、属以上植物有性杂交不亲和性障碍 – 为携带外源遗传物质的大分子渗入细胞创造条件
2、植物细胞融合的程序
◆ 原生质体分离的分离、纯化 ◆ 融合方法选择 ◆ 杂种细胞的筛选 ◆愈伤组织形成器官分化植株再生
◆杂种植物的鉴定
3、诱导原生质体融合的方法及融合剂
◆ 盐类融合法 ◆ 高Ca2+和高pH值融合
C、分离原生质体所用的酶液和稳定剂
▲ 烟草叶肉细胞：0.5% Macerozyme R-10果胶酶+2% Onozuka R-10纤 维素酶，0.7M 甘露醇。 ▲ 烟草悬浮细胞： 2% Driselase纤维素酶+2% Cellusase纤维素酶+ 0.5% Macerozyme果胶酶；海水。 ▲ 胡萝卜悬浮培养的细胞：2% Onozuka纤维素酶+0.5% Driselase纤维 素酶+0.5% Rhoxyme半纤维素酶1% Pectinase果胶酶；0.35M甘露醇 + 0.35M 山梨醇 ▲ 甘蓝等的根细胞：4% Maicelase纤维素酶+2% Rhozyme半纤维素酶 +0.3% Macerozyme果胶酶； 0.7M 甘露醇。 ▲ 番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5% Cellulysin 纤维素酶+0.3% Macerozyme果胶酶；102.6g/L 蔗糖。 ▲ 水稻种子的愈伤组织的悬浮培养细胞：2% Onozuka Rs 纤维素酶+1% Driselase 纤维素酶+2% Macerozyme R-10果胶酶+1% Pectolyase果 胶酶 ；0.3M 葡萄糖
1、原生质体的培养方法
• 固体培养法
– 原生质体按照一定细胞起始密度，均匀分布于薄层固体培 养基中 – 此法优点有利于对单个原生质体的胞壁再生和对细胞团形 成的全过程进行定点观察
• 浅层液体培养法：
– 在培养皿或三角瓶中注入3~4ml原生质体培养液，然后将 纯净的原生质体，按一定的细胞密度注入并进行培养
◆融合细胞的鉴定
三、植物原生质体的融合
1、植物细胞融合的概念和意义 2、植物细胞融合的程序 3、诱导细胞融合的方法及融合剂 4、细胞融合的影响因素
5、细胞杂种的选择和鉴定
1、植物细胞融合的概念和意义
• 细胞融合(cell fusion)概念：
– 又称细胞杂交(cell hybridizaion)：离体条件下用人工的方 法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
◆ What
◆ Why
基本原理
技术应用
◆ How
技术方法
植物细胞模式图
高尔基体
微丝 叶绿体 线粒体 质膜
液泡
细胞核 内质网 微管 细胞壁
细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%
◆ What
• 原理：
– 改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变， 使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始 连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。
• 优点：
– 对原生质体的损害小，融合率高，重复性强；装置精巧、 方便简单，可在显微镜下观察或录像融合过程，免去PEG 诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。
C. 聚乙二醇（PEG）融合法
• Polyethylene glycol(PEG)是一种多聚化合物,分子式 H(OHCH2-CH2)nOH, 平均相对分子量200-20000之间 • 融合机制：可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和 原生质体表面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电 键，促使异源的原生质体间的粘着结合 • 用相对分子质量为1540的PEG处理40-50 min；再用 培养液缓慢稀释PEG最后洗去PEG，得到10%的异核 体
植物原生质体在理论研究和细 胞工程中的地位
信息传递、能量转换 细胞壁合成机理 融合产生体细胞杂种 分离各种细胞器
膜的结构与功能
核质关系 杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用 植物激素的作用机理 诱发突变体
引入各种细胞器
导入外源基因
纯化后的叶肉原生质体
2、原生质体材料来源
★ 植物叶片
－取材容易 －比较容易用酶解法分离
与 分 离 试 剂 相 同
-5.6
与 分 离 试 剂 相 同
21% 5.6
4).原生质体的活力测定
形态：
把形态上完整，富含细胞质，颜色新鲜的原生质体 释放到降低渗透压浓度的洗涤液或培养基中，即可 见到分离后缩小的原生质体会恢复原态，成为正常 膨大的一般是有活力的原生质体。
染色法：
用0.1%酚藏花红液染色，活的原生质体能着红色 用荧光素双醋酸酯（FDA）染色，在荧光显微镜下 观察到带有荧光的是有活力的原生质体
D. PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法
• 先用PEG处理30min；（PEG是相邻原生质 体表面间的分子桥） • 然后用高Ca2+和高pH值液，稀释PEG； （引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布， 从而促进了融合） • 再用培养液洗去高Ca2+和高pH值
PEG诱导原生质体融合过程
E. 电融合法
在离心管中加入适量洗涤液，再离心；重复 此步骤3次，使酶解液充分除去； 最后用原生质体培养液离心一次
分离、洗涤、纯化原生质体 的试剂
试剂 KH2PO4 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KI CuSO4.5H2O 甘露醇 纤维素酶 果胶酶 蔗糖 pH 分离 27.2 mg 101 mg 1480 4% 0.4% -5.6 洗涤 纯化
B、影响原生质体数量和活力的因素
1）不同种类植物或不同组织和细胞，其细胞壁的组成和结构 有差异 2）渗透压稳定剂：如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类 （KCl,MgSO4.7H2O)等 3）质膜稳定剂：如葡聚糖硫酸钾、氯化钙、磷酸二氢钾等增
加对质膜的稳定性
4）酶液的pH值：一般在5.4-6.0 5）温度因子 6）植物材料的生理状态：如株龄、发育状态、栽培条件等对 取材影响很大
4、原生质体的纯化
• 去除破碎的原生质体、末去壁的细胞、细 胞器及其他碎片等杂质 A、过滤法
B、漂浮法
C、离心法
例: 烟草叶肉细胞原生质体的 分离
1). 材料的准备与消毒： 2). 酶解： 3). 纯化： 4). 原生质体的活力测定
1). 材料的准备与消毒
选取在温室中生长两个月左右的烟草植株 从生长健康的植株上摘取充分展开的嫩叶片 经自来水冲洗干净后 放入70%乙醇中进行表面消毒 然后再放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟 接着用无菌水洗涤3～4次，以充分除去消毒剂
技术方法
第16章 植物原生质体融合技术 Plant Protoplast Fusion
• 植物原生质体的制备 • 植物原生质体的培养 • 植物原生质体的融合
一、植物原生质体的制备
• 原生质体的概念及培养的意义 • 原生质体材料来源 • 原生质体的分离