植物原生质体的分离与纯化
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
8原生质体的分离、培养和融合
③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离 出原生质体。
现在为常规方法。
二、酶解法的材料来源
1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处 理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。
无菌苗的叶片更具优势。
2、悬浮培养的细胞或愈伤组织
由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当 困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。
增加膜的透性。 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。
2. 酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm 直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于 25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 3、影响酶活性和酶解效果的因素 纯度：纯化的酶活性可能降低 PH值：4.7-6.0之间 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。
A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇 中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于 管底，原生质体上浮。
B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原 生质体层，碎屑在管底。
原生质体悬浮液，
300mmol/L山梨醇+ 100mmol/LCaCl2
140mmol/L蔗糖+ 140mmol/L山梨醇
第四节 植物原生质体融合
诱导不同来源的原生质体发生原生质体融合，是获得体细胞 杂种的唯一途径
一、体细胞杂种植物
1、科间（融合）杂种 融合产物可以进行细胞分裂，但亲本之一的染色体会选择性 地消失。 2、属间（融合）杂种
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体的分离
植物原生质体(plant protoplasts)是植物细胞核以外的细胞质组成，它们可以通过去核反应获得。
原生质体可以分离出来，是植物胚性转化的一种重要方法，可以用来分离和获得植物细胞和细胞器的活性。
植物原生质体的分离可以采用不同的方法，以下是常用的几种方法：
一是用果胶酶和裂解酶将细胞膜降解，使细胞质中的内质网结构改变，使原生质体从细胞壁中分离出来。
二是用保护剂处理和胞质囊泡技术。
保护剂处理，把细胞质和细胞膜充分溶解，裂解出原生质体；而胞质囊泡技术，是通过用氯仿（等其他溶剂）将细胞膜脱落，或者将细胞膜和细胞质分开，使原生质体分离出来。
三是用低温处理，低温能使细胞膜结构改变，形成小孔，使原生质体从小孔中流出。
四是运用低温抗体介导的细胞膜破裂，在低温下用抗体对细胞膜特异性地结合，从而实现细胞膜的改变，使原生质体分离出来。
以上几种方法通常都能有效地获得植物原生质体。
另外，还可以采用全自动分离系统，自动化地破碎、清洗细胞，最终得到原生质体。
- 1 -。
植物原生质体分离和活性鉴定
植物原生质体分离和活性鉴定实验目的1.学习植物细胞原生质体分离纯化的方法。
2.了解原生质体活性鉴定的原理。
实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。
其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
实验材料、用品材料：绿豆,烟草幼苗叶片等。
绿豆烟草幼苗试剂：(1)酶解液(绿豆)：1%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。
(2)13%CPW洗涤液(绿豆)：27.2mg/L KH2PO4,101.0mg/LKNO3,1480.0mg/LCaCl2.2H2O,246.0mg/L MgSO4,0.16mg/LKI ,0.025mg/L CuSO4.5H2O,13%(W/V)甘露醇,pH 6.0。
(3)酶解液(烟草)：用01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠配制2％(W／V)纤维素酶,1％ (W／V)果胶酶,005 mmol／L氯化钙,0.6 mol／L甘露醇,pH 6.0。
(4)洗涤液(烟草)：0.2 mol／L氯化钙, 加有01％2-N-吗啡啉乙磺酸钠,pH 6.0。
实验五植物原生质体的分离和培养
实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。
实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。
在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。
植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。
分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。
其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。
原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。
酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。
渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。
酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。
游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。
实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。
2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。
⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。
细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。
三、试剂1. 70％酒精。
2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。
3. 灭菌蒸馏⽔。
4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。
5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。
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实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶解时酶液的组成及浓度如何确定 ③ 研究原生质体的意义是什么？
植物原生质体的分离和融合
生质所包围的“裸露细胞”，是开 展基础研究的理想材料。其中酶解 法分离原生质体是一个常用的技术， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 半纤维素和果胶质组成，因而使用 纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能 降解细胞壁成分，除去细胞壁。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有 醚键而具负极性，与水、蛋白质和 碳水化合物等一些正极化基团能形 成氢键，当PEG分子足够长时，可阼 为邻近原生质表面之间的分子桥而 使之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可 在一些负极化基团和PEG之间形成桥， 因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜 上的PEG分子可被洗脱．这样将引起 电荷的紊乱和再分布． 从而引起原生质体融合：高Ca高pH 由于增加了质膜的流动性，因而也 大大提高了融合频率，洗涤时的渗 透压冲击对融合也可能起作用。
取滤液（两支）离心5分钟(1000rpm),弃上清
（关键）向沉淀中加入0.16M CaCl2溶液1-2毫 升，摇晃使沉淀悬浮，用注射器在离心管底部 注入6-8ml22%蔗糖溶液，
洗涤（0.24M CaCl2溶液），再次离心 （1000rpm离心2-5分钟），弃上清液 稀释（向沉淀中加入0.16M CaCl2溶液1-2毫 升，摇晃使沉淀悬浮） 取一滴与载玻片上，盖片显微观察，也可在 荧光显微镜下检查其纯度
许多化学、物理学和生物学方法可
诱导原主质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有效的融合方法是聚 乙二醇(PEG)法。高Ca高pH法和电融 合法：PEG作为一种高分子化合物， 20～50％的浓度能对原生质体产生 瞬间冲击效应，原生质体很快发生 收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进 行清洗．使原生质体融合得以完成。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
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实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
实验9 植物原生质体的分离与 纯化
实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶Байду номын сангаас时酶液的组成及浓度如何确定？ ③ 研究原生质体的意义是什么？
4 纯化： 1 ）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心 管中。 2 ）纯化 - 漂浮法：用比原生质体比重大的 20% 蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的 表面。（还有沉降法）
过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体 弃上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮 在一新离心管中加入6~8 ml的20%蔗糖盐溶液，将原生 质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面 1000rpm，3min离心，漂浮原生质体 原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于 另一离心管中