补肾通脉方对伴胰岛素抵抗的多囊卵巢综合征大鼠IRS1表达的影响

１．３动物的分组和处理
２１日龄动物普食适应性喂养２ ｄ。随机分为正 常组和造模组。其中正常组１３只。造模组第２３日
龄起连续２０ ｄ颈背部皮下注射硫酸普拉睾酮钠９ ｍｇ／１００ ｇ体重＋０．３ ｍｌ。注射用水，正常组大鼠同 期注射等量溶剂。正常组予普通饲料８０ ｄ，造模组 同期予高脂高卡饲料。喂养第７０天起晨行连续阴 道涂片１０ ｄ，观察涂片周期变化。第８ｌ天尾静脉采 血测空腹血糖（ｆａｓｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｇｌｕｃｏｓｅ，ＦＰＧ）和空 腹胰岛素（ｆａｓｔｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｆｉｎｓ），计算胰岛素敏感指 数（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＩＳＩ），ＩＳＩ采用李光伟 等…提出的方法：ＩＳＩ＝ｌｎＥｌ／（ＦＰＧ×Ｆｉｎｓ）］。造模 组取ＩＳＩ小于正常组ＩＳＩ均值减１．９６倍标准差、且 阴道涂片无周期变化者为ｌＲ的ＰＣＯＳ大鼠。将１Ｒ 的ＰＣＯＳ大鼠随机分为模型组和中药组。模燃组大 鼠２７只，中药组大鼠２３只。中药组连续２周灌服 补肾通脉浸膏１２．２５ ｇ／（ｋｇ·ｄ），同期模型组和正 常组灌服等量生理盐水。随机选取正常组５只， 模型组１２只，中药组１０只大鼠于动情后期禁食 １２ ｈ后门静脉推注胰岛素（５ Ｕ／ｋｇ），３ ｒａｉｎ后依次 取肝脏、卵巢及卵巢旁脂肪。各组余下部分在动 情后期禁食１２ ｈ后处死，分别取卜述组织。肝脏、 脂肪迅速冻存于液氮，留以检测ＩＲＳ－１的ｍＲＮＡ 和蛋白水平。卵巢用４％多聚甲醛固定，以行免疫 组化检测。
ｌ材料与方法
１．１买验动物 ２１日龄清洁级雌性ＳＤ大鼠及基础饲料均购自
华中科技大学同济医学院实验动物学部。高脂高卡 饲料依文献资料汀·略加改动后配制。其中脂肪类（以 饱和脂肪酸为主）占总热卡含量的６１％，蛋白质占 １９％，碳水化合物占２０％。
１．２药物和试剂
硫酸普拉睾酮钠由江苏联环药业股份有限公司 提供。注射用水由滨湖制药厂提供。补肾通脉方由 武汉市同济医院中药房提供，按水煎醇沉的工艺路 线提取浸膏，由华中科技大学同济医学院中西医结 合研究所制备，浓度为ｉ００％（１ ｇ生药／１ ｍＬ）。 ＩＲＳ一１引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成并纯 化。１３－ａｃｔｉｎ引物由上海生工生物工程有限公司合 成并纯化。考马斯亮蓝Ｇ２５０蛋白测定试剂盒购自 南京建成生物技术有限公司。兔抗多克隆ＩＲＳ－１抗 体、多克隆ｐ－ａｃｔｉｎ抗体均购自Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。 ＳＰ试剂盒（兔抗ＳＰ及小鼠抗ＳＰ试剂盒）购自北京 中杉公司。
Ｘｉｅ Ｙａｎｇ，Ｈｕａｎｇ Ｄｏｎｇｍｅｉ△，Ｌｉ Ｑｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。Ｔｏｎｇｊｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００３０。Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｕｓｈｅｎ Ｔｏｎｇｍａｉ ｒｅｃｉｐｅ（ＢＳＴＭＲ）ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－１（ＩＲ孓１）ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔａｒｇｅｔ—ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＣ（）Ｓ）ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＩＲ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１．４检测指标和方法
１．４．１ ＩＲ§１ ｍＲＮＡ的表达 采用ＲＴ—ＰＣＲ检 测。取各组大鼠胰岛素刺激前后肝脏和脂肪组织各 １００ ｇ，用Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，用ＲＮＡ紫外分光光 度计检测ＲＮＡ浓度和纯度。目的因子引物序列见 表ｌ，引物序列参照文献Ｅ８３。ＩＲｓ－１的ＰＣＲ反应时 序为：９４℃变性３０ ｓ，５５‘Ｃ退火３０ ｓ，７２‘Ｃ延伸６０ Ｓ， ３５个循环后７２℃延伸７ ｒａｉｎ，４℃保存。Ｂ—ａｃｔｉｎ反 应时序为：９４℃变性５０ ｓ，５５℃退火５５ Ｓ，７２℃延伸 ５０ ｓ，３１个循环后７２℃延伸１０ ｒａｉｎ，４℃保存。产物 各取５弘Ｉ。加６×上样缓冲液ｌ ｐＬ，１．７％琼脂糖凝 胶电泳（６０ Ｖ，２５ ｍｉｎ），拍照后用Ｑｕａｎｔｉｔｙｏｎｅ软件 分析系统分析各条带灰度值。
中图法分类号Ｒ７１１．７５
ＤＯｌ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—０７４１．２０１０．０２．００６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｂｕｓｈｅｎ Ｔｏｎｇｍａｉ Ｒｅｃｉｐｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲＳ一１ ｉｎ Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ Ｏｖａｒｉａｎ Ｒａｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
万方数据
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华中科技大学学报（医学版） ２０１０年４月第３９卷第２期
准：超声检查存在多囊卵巢，临床或生化上的雄激素 过多症，无排卵性月经失调，符合上述３项中任意２ 项、并排除其他病因者可以诊断为ＰＣ（）ＳＥ ２｜。
据统计，７５％肥胖的ＰＣＯＳ患者和３５％非肥胖 的ＰＣＯＳ患者均伴有胰岛素抵抗（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔ— ａｎｃｅ。ＩＲ），ＩＲ被认为是ＰＣ（）Ｓ的重要病理特征∞Ｊ。 多项实验研究表明在患有ＰＣＯＳ的女性中，胰岛素 活性在经典靶器官（肝脏和脂肪组织等）中缺失从而 引起胰岛素抵抗¨Ｊ。另外，胰岛素受体还存在于卵 巢各种细胞中，表明卵巢也是胰岛素作用的一个重 要靶器官。许多研究证实任何譬ｔ－ｘ寸改善ＰＣＯＳ患者 胰岛素抵抗的治疗都町降低睾酮水平和改善排卵功 能＿Ｊ，目前临床ＰＣ（）Ｓ的治疗越来越注重纠正 ＩＲＺ６ｊ。中药补肾通脉方为华中科技大学同济医学 院附属同济医院中西医结合科治疗ＩＲ的Ｉ临床经验 方。为进一步探讨补肾通脉方通过改善ＩＲ治疗Ｐ— ＣＯＳ的作用机制，本实验用硫酸普拉睾酮钠加高脂 高卡饮食诱导伴１Ｒ的ＰＣＯＳ大鼠，观察了补肾通 脉方对肝脏和脂肪组织中胰岛素受体底物一１（ｉｎｓｕ— ｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－１，ＩＲＳ一１）ｍＲＮＡ的表达，以 及肝脏、脂肪和卵巢组织中蛋白表达的影响。
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ； ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； Ｂｕｓｈｅｎ Ｔｏｎｇｍａｉ ｒｅｃｉｐｅ； ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－１
多囊卵巢综合征（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ｓｙｎ— ｄｒｏｍｅ，ＰＣＯＳ）在育龄期妇女发病率为５％～
Ｔｗｅｎｔｙ－ｔｈｒｅｅ－ｄａｙ—ｏｌｄ ｆｅｍａｌｅ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｗｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ｐｒａｓｔｅｒｏｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ［９ ｍｇ／（ｉ００ ｇ·ｄ）］ｆｏｒ ２０ ｄａｙｓ．ａｎｄ ｆｅｄ ｏｎ ｈｉｇｈ—ｆａｔ ｆｏｒａｇｅ ｆｏｒ ８０ ｄａｙｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐ（：（）Ｓ ｗｉｔｈ ＩＲ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＰＣ‘ＯＳ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ（２７ ｒａｔｓ）ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ（２３ ｒａｔｓ）．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ。ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ １３ ｒａｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｇｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ＢＳＴＭＲ．Ａ ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｇｉｖｅｎ ｉｎｓｕ— ｌｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｒｔａｌ ｖｅｉｎ ｉｎ ｌａｔｅ ｅｓｔｒｕｓ，ｗｈｅｒｅａｓ ｒｅｓｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｄｉｄｎ’ｔ ｒｅｃｅｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １ｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＲＳ－１ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＲＳ－ｌ ｉｎ ｏｖａｒｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｏｒｌＴｌａｌ ｇｒｏｕｐ．ｔｈｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲＳ－１ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ，ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲ孓１ ｉｎ ｏｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｍａｒｋｅｄｌｙ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｏｓｅ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉ— ｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ａｆｔｅｒ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲＳ－ｌ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ １ｉｖｅｒ ａｎｄ ｆａｔｔｙ ｔｉｓｓｕｅｓ。ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲ§１ ｉｎ ｏｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ（Ｐ＜Ｏ．０５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＢＳＴＭＲ ｃｏｕｌｄ ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＲ孓ｌ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＢＳＴＭＲ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＰＣＯＳ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ＩＲ．
蛋白表达，均明显低于正常组（均Ｐ＜０．０５）。中药组均显著高于模型组（均Ｐ＜０．０５）。各组ＩＲ守１的表达在胰岛索刺激