PCR常见问题
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
PCR检测常见问题与解决途径
PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。
尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。
为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。
一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因与其解决方法予以综述。
一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。
如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水与其它溶液被PCR核酸模板污染。
3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。
因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时与污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具与试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性与具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
PCR常见问题分析及对策
PCR反应常见问题汇总（转自tiangen）----PCR常见问题分析及对策1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR仪常见问题
1. 反应后反应管壁出现液滴？可能原因：运行程序前没有开启热盖加热功能解决方法：开启热盖加热功能可能原因：反应结束后低温保存时间过久解决方法：运行结束后，热盖将自动关闭，所以冷凝会自然出现，这不会对实验结果产生影响，将反应管置于离心机上瞬时离心使液滴回到管子底部即可。
2. 使用的微孔板，反应后反应液有明显蒸发？解决方法：确保使用高质量的微孔板，反应前要严格密封解决方法：确保盖紧热盖，适当提高热盖的温度解决方法：增大反应体积3. 使用PCR管，反应后部分PCR管内反应液有明显蒸发？解决方法：确保使用高质量的PCR管或使用我们推荐的PCR管解决方法：在样品台的四角放置四个同样的空PCR管，以保证热盖压在各PCR管上的压力均匀4. 为什么在不同型号的PCR仪上扩增出的条带亮度有差异？答：不同PCR仪所用的优化的升降温策略不同，所以当将在一类PCR仪上使用的PCR步骤参数转移到另一类PCR仪上时，要进行试验优化。
5. 在PCR实验结束后我的样品可以一直放在PCR仪中低温保存吗？答：但我们推荐当程序运行结束后，及时取出样品并停止仪器运行，而不要把仪器当“冰箱”使用。
低温保存时温度尽量设定的比较高，如8℃，这可以延长仪器的使用寿命。
6. 模拟管和样品台控温模式有什么差别？答：如果采用样品台控温模式，当样品台升降温到目标温度时，由于传热延迟，样品管内样品仍等待需要较长后的时间才能达到目标温度，所以当步骤时间不超过30s时，最好用模拟管控温模式；如果要用样品台控温模式，请将步骤时间延长一倍。
常见故障下面以PE480PCR仪为例，介绍PCR仪器使用过程中遇到的基本故障以及排除方法。
1．打开电源但是仪器不响应这种情况很可能是由于电源线脱落或者没有插紧而致，将电源线重新插入插座即可排除故障。
2．屏幕无显示且马达与风扇不启动这种情况很可能是总保险丝被熔断而造成的，更换保险丝即可排除故障，更换准确型号保险丝是所有用电仪器常见的故障排除办法，需要注意的是更换时一定要严格按照使用说明书来进行，或者邀请生产厂家维修工程师来完成。
PCR常见问题分析及对策
.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题
1. 2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 2+浓度偏高 Mg 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3. 4. 5. 6.
重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA DNA或加大模板的用量 模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer Buffer或调整浓度 2. 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（ 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 体和链内二级结构） 管新引物 降低退火温度、 4. 降低退火温度、延长延伸时间
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶 聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 增强剂
PCR Master Mix
特 点
快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 可扩增低至2 特异性强 稳定性好 降低PCR反应的要求， 降低PCR反应的要求，增强特异性 PCR反应的要求 长期放置活性无改变
是除了好的引物设计之外， 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性 最重要的方法之一。 最重要的方法之一。
策略之四
使用PCR增强剂
甲酰胺， 的增强剂。 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当 ，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 的增强剂
其可能的机理是降低熔解温度， 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅 助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性）问题1 :无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间M 样品样品正对照问题2:非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3:拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4:假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
PCR常见问题分析及解决策略
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
提高PCR特异性最重要的方法之一。
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
现象：正对照有条带，而样品则无
PCR常见问题
Answer：1.引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。
此时需重新设计引物。
2.为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；3.为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。
Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）Answer:1.条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。
2.DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。
3.对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。
4.酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
5.PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。
6.Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。
7.如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。
Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象Answer：1.当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR2.若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度3.酶量过多，则适当减少酶量4.Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度5.退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）6.循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。
PCR反应常见问题汇总
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．常规程序
将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。
在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。
重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。
最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。
2．复性（退火）和延伸温度
复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。
具体的温度主要由引物的Tm值决定。
延伸温度绝大多数设定为72℃。
如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。
3．反应时间
变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。
复性时间有30秒种一般是足够的。
延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。
4．循环次数
循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。
平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。
原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。
5．PCR反应液的配制
PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。
常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。
对于使用为时，有时会扩增不出产物。
在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服这个问题。
按照常规的方法配制反应体系，有时会出现非特异性扩增的问题。
热启动（hotstart）PCR 操作方式可较好解决这一问题。
将dNTP、缓冲液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蜡珠（如AmpliWaxPCRQam100），加热熔化，再冷却，使蜡将溶液封住，最后加入模板和
DNA聚合酶等剩余成分。
只有当PCR反应进入高温阶段后，蜡层熔化，所有反应成分才会混合在一起。
PCR不出现扩增条带
楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下：PCR反应的关键环节有:1模板核酸的制备，2引物的质量与特异性，3.酶的质量，4. Mg2+ 浓度，5.物理原因，6.靶序列变异。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究,最后写出了调整顺序。
1.模板：(1)模板中含有杂蛋白质，(2)模板中含有Taq酶抑制剂，(3)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，(4)在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
(5)模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
3.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。
(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
4.Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL。
或100μL，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
5.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
6.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
一般的调整顺序：若PCR反应后无任何产物，可先调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。
然后调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。
再往后，重新提取DNA模板、换酶和改变反应体积。
最后这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。