第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备
蛋白组学二维电泳
第一向等电聚焦与IPG胶条的剥离
聚焦程序设置
剥离IPG胶条
根据蛋白质的等电点设置等电聚焦程 序。
聚焦完成后，将IPG胶条从聚焦盘上 剥离下来。
开始聚焦
施加电压，使蛋白质在IPG胶条上分 离。
第二向SDS-PAGE电泳
转移蛋白质
将IPG胶条上的蛋白质转移 到SDS-PAGE凝胶上。
开始电泳
施加电压，使蛋白质在凝 胶上分离。
02
二维电泳技术原理
蛋白质的等电点与分子量
蛋白质的等电点
蛋白质是两性电解质，在特定的 pH环境中，蛋白质分子呈电中性 状态，这个pH值就称为该蛋白质 的等电点。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量是指其分子的大 小，通常以道尔顿为单位表示。
固相pH梯度技术
原理
通过在电泳过程中保持恒定的电流， 使蛋白质根据其等电点在电场中移动 ，从而实现分离。
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蛋白质翻译后修饰的研究
总结词
详细描述
二维电泳在蛋白质翻译后修饰的研究中具有 重要价值，通过分离和鉴定修饰后的蛋白质， 可以了解蛋白质的修饰类型和修饰位点。
二维电泳能够分离出各种翻译后修饰的蛋白 质，如磷酸化、泛素化、糖基化等。通过质 谱等技术对这些蛋白质进行鉴定和修饰位点 的确定，可以深入了解蛋白质的修饰类型、 修饰位点和功能调控。这些结果有助于揭示 生命过程的调控机制和疾病发生发展的机维 的基础，能够将复杂的蛋白质混合物 分离成多个条带。
双向凝胶电泳技术
原理
结合了等电聚焦和SDS-PAGE两种技术，首先根据蛋白质的等电点进行分离， 然后再根据分子量进行分离。
应用
双向凝胶电泳技术能够全面地展示细胞或组织中蛋白质的表达情况，为后续的 蛋白质组学研究提供基础。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点1.选择适合的样品预处理方法：蛋白质样品预处理的方法包括提取、富集和纯化等。
常见的方法有溶细胞法、组织破碎法和亲和层析法等。
根据具体实验目的和样品特点，选择适合的方法进行样品预处理是确保蛋白质样品质量的重要因素。
2. 选择合适的蛋白质溶液：根据目的不同，选择适于蛋白质分离的缓冲液和胶液。
常用的缓冲液有Tris-Glycine、Tris-Tricine和Tris-Acetate等，常用的胶液有聚丙烯酰胺凝胶和聚丙烯酰胺/聚丙烯酰胺共聚物凝胶等。
根据蛋白质的特性和实验要求，选择合适的缓冲液和胶液可以提高分离效果和样品质量。
3. 蛋白质样品质量检测：在进行双向电泳实验前，需要对蛋白质样品进行质量检测。
常见的检测方法包括BCA法、Lowry法和Bradford法等。
这些方法可以测定样品中的蛋白质浓度，以确保实验的准确性和可重复性。
4.样品处理与加载：在进行双向电泳实验时，需要将蛋白质样品进行处理和加载，以便进行分离和鉴定。
样品处理的方法包括蛋白质还原、脱脂和蛋白质标记等。
蛋白质还原可使用还原剂如二巯基乙酸、巴布威和三丁基磺酸等，蛋白质脱脂可使用胰酶和胰酶胰凝乳酶等。
加载样品时，需要控制样品数量和均匀性，避免过多或过少的加载，以避免样品定位和分离差异。
5.电泳条件的优化：电泳条件的选择和优化是双向电泳实验的关键。
根据样品特性和实验目的，调整电场强度、升温速率和电泳时间等参数，以获得较好的分离效果。
此外，还需要注意电泳温度的控制，避免样品的热失活和电场影响。
6.截胶和染色：双向电泳实验结束后，需要进行截胶和染色步骤，以检测和鉴定分离的蛋白质。
截胶可使用染色剂如胭脂红和银染等，染色后可以通过人工或自动扫描仪对蛋白质进行定量和定位。
7. 数据分析和解释：双向电泳实验获得的数据需要进行分析和解释。
常见的数据分析方法包括质谱分析、2D胶电泳图像比较和蛋白质鉴定工具（如万得鉴定和Mascot等）。
双向电泳蛋白样品的制备
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双向电泳样品制备： 双向电泳样品制备：
一、蛋白质提取原则： 、蛋白质提取原则： 二、样本裂解方式： 样本裂解方式： 三、2D蛋白裂解液组成及作用： 2D蛋白裂解液组成及作用： 蛋白裂解液组成及作用
蛋白酶抑制 PMSF,AEBSF,EDTA,多肽蛋白酶抑制剂， 剂 磷酸酶酶抑制剂
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三、双向电泳样本制备裂解液组成及作用
1、变性剂： 变性剂： (1) 作用：改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质的肽链伸展 开来，充分暴露疏水中心。 (2) 分类：脲，硫脲，或两者的混合物可以增加蛋白质的溶解性，特 别是膜蛋白。必须避免将含有尿素的溶液加热到30度以上， 因为这样会使其水解为氰酸盐，修饰蛋白质，改变蛋白质的 电荷。
用甲醇配制0.1M的醋酸铵
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冻融裂解
去垢剂裂解
组织培养细 胞
酶裂解
植物组织 细菌细胞 真菌细胞
二、双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式 双向电泳样本裂解方式——剧烈裂解方式 ——
破碎方法 超声波法： 超声波法 适用材料 细胞悬浮液 带细胞壁的 微生物 固体组织 微生物 原理 通过超声波发生器产生的超声波剪切力将细胞破碎，但必 须注意减少热量的产生和泡沫的形成。 在高压情况下通过小孔对细胞施加压力产生的剪切力破碎细 胞 利用研杵手工将它们破碎
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五、双向电泳样本制备实例——动物样本 双向电泳样本制备实例 动物样本
二维电泳原理和方法
如果样本较多地集中在高端和低端pH梯度，或者在较窄的pH梯度内分离大量蛋白质， 应使用Ettan IPGphor Manifold胶条槽和7、11、13、18或24 cm的Байду номын сангаасmmobiline DryStrip干胶条，上 样可采用样品杯、溶胀盘、或纸桥，详见2.3~2.5节。
MultiphorⅡ电泳系统（图7）具有多种功能，可进行几种不同的电泳。对于双向电泳，它既 可用于第一向IEF电泳，也可用于第二向SDS-PAGE电泳。干胶条进行溶胀时既可以含有样本， 也可以不含样本，溶胀在溶胀盘内进行。溶胀后，胶条被转移到电泳仪上进行第一向等电聚焦 （IEF）。
MultiphorⅡ电泳系统。这两种系统均可以通过升级配件而进一步改善 IEF 电泳性能。 Ettan IPGphor3 等电聚焦系统（图 1）是一种 IEF 电泳专用系统，电泳在 Immobiline DryStrip
干胶条上进行，该系统已经过升级，操作简单，可轻松完成第一向电泳分离。Ettan IPGphor3 等电聚焦系统的一贯特点是高速，可重复性好，高通量。该系统配备了高安全性的高压电源（根
概述
关于本手册
本手册旨在介绍高分辨率双向（2-D）电泳的操作方法。 本手册共分七章： 第一章介绍样品制备和蛋白定量的方法。 第二章具体介绍双向电泳中第一向的操作过程，重点介绍EttanTM IPGphorTM 3等电聚焦系 统。 第三章包括采用各种垂直凝胶电泳系统进行固相pH梯度（IPG）胶条的第二向电泳的一般方 法。 第四章介绍使用平板Multiphor TM Ⅱ电泳系统进行第一向和第二向电泳的方法。 第五章讨论双向电泳结果的图像与分析。 第六章介绍双向荧光差异凝胶电泳（2-D DIGE）的优势与使用技术。 第七章描述双向凝胶电泳的常见问题与解决方法。涉及具体技术的故障排除方法请见相关 章节。 本手册介绍的操作程序使用Amersham Biosciences公司的产品，该公司现为GE Healthcare公 司的一部分（下文均称GE Healthcare）。备选设备及照片见表1。产品订购信息见第155页。 根据样本类型和研究性质的不同，本手册所介绍的操作步骤可能须调整或优化。
第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备
三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ 蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail） ）
fluoride， 苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluoride， PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L ， 抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶， 抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在 水溶液中迅速失活 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L AEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L ， AEBSF的抑制活性与PMSF相近 的抑制活性与PMSF相近， AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于 水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点 水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点
四、蛋白沉淀步骤
1、硫酸铵沉淀（盐析） 硫酸铵沉淀（盐析） 原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合， 原理：在高盐溶液中，蛋白质倾向于聚合，并从 溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸） 溶液中沉淀下来，许多潜在的杂质（如核酸）将 保持在溶液中 步骤：蛋白浓度大于1mg/ml，缓冲液浓度大于 步骤：蛋白浓度大于1mg/ml， 1mg/ml 50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和， EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和 50mmol/L，并含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和， 搅拌10~30min 10~30min， 搅拌10~30min，通过离心沉淀蛋白 只能预分离或富集蛋白， 只能预分离或富集蛋白，残存的硫酸铵会干扰等 电聚焦 硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯 基有敏感作用
7、酚类组分 通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白 应用还原剂防止苯酚的氧化 通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白 用抑制剂灭活多酚氧化酶 PVP或PVPP吸收酚来清除酚组分 PVP或PVPP吸收酚来清除酚组分
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1一、蛋白质组学概论随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式─“生物大科学”。
这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。
过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。
因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Disco very Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-drive n Science)。
显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。
如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。
它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。
点此下载本文的PDF全文：双向电泳(two-dimensional electrophores is).pdf蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。
蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（express ion proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional proteomics）。
双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳原理及实验步骤
银染（Silver Stain Plus™ stain）
荧光染色（SYPRO® Ruby protein gel stain）
适用于质谱的染色方法
考马斯亮蓝染色
银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。
快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。
聚焦时间的优化
IEF的基本条件
Stemp 1
Stemp 2
Stemp 3
total
voltage
Time
Volt-Hours
Ramp
250
20min
－－－
Linear
4000
4000
2hr
－－－
－－－
10,000V-hr
Linear
Rapid
5 hr
14,000V-hr
7 cm
Stemp 1
Stemp 2
双向电泳样品的溶解
是成功进行双向电泳的最关键因素之一 溶解的目标： 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除； 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。
02
样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
Amount
8M urea
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
50mM DTT or 2mM TBP
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
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5、用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀
杂质含量高的植物样品很有效 蛋白质被提取到饱和酚中，然后在甲醇中用醋酸
铵从酚相中沉淀蛋白 此法较复杂，并且耗时较多
五、清除影响二维电泳图谱的杂质
1、盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子 在IPG胶条中，盐离子可导致溶液的电导率增大 胶条中的盐离子可能导致较大区域不能聚焦 透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/重悬进行脱盐
第三章二维电泳的蛋白质提取与样品制备
制备目的
完全溶解 解离 变性 还原蛋白
选择细胞破碎方法、蛋白解聚、溶解方法、去 污剂和裂解液的成分
样品制备原则
尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白 丢失
细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解， 低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解
样品裂解液应该制备，并且分装冻存-80℃，勿 反复冻融已制备好的样品
通过超速离心清除所有的杂质 加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化
而修饰蛋白
第一节细胞裂解方法
温和裂解方法 剧烈裂解方法 用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解 蛋白沉淀步骤 清除影响二维电泳图谱杂质 裂解液组分
2、三氯醋酸（TCA）沉淀
原理
③ 随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大， TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳 前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎 片，而且随时间的延长这一作用愈加明显
④ 电泳图谱显示，BSA 、HSA 单体谱带有较明显的展宽现 象，这可能是由于TCA 的结合，使SDS 与蛋白质的结合 量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成 迁移率的不一致
亮抑酶肽（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸 和半胱氨酸蛋白酶；胃蛋白酶抑制剂 （pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑酶肽 （aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁 抑制剂（bestatin）能抑制氨基多肽酶
2、三氯醋酸（TCA）沉淀 原理
① 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐 ② 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴 露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀
溶细胞酶
酵母
在等渗溶液中处理细胞
二、剧烈裂解法
超声裂解法
细胞样品 通过切应力裂解细胞 迅速超声重悬细胞，并在冰上冷却
弗氏压碎器（French Pressure cell）
含有细胞壁的微生物 在高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力
研磨法
固体组织、微生物 冻存于液氮中，随后研磨成粉末
优点： 分辨能力比盐析法高， 沉淀不用脱盐，过滤较为容易
在常温下，沉淀的蛋白质往往引起变性
4、在丙酮中用TCA沉淀
两者联合更加有效 10%TCA在丙酮中重悬裂解的样品溶液(含有
0.01%β-巯基乙醇溶液或20mmol/L DTT)，至少20℃沉淀45min 仍然存在难再溶现象
机械匀浆法
固体组织 将组织切成小片，加入预冷的匀浆缓冲液，简
单匀浆，通过过滤或离心获得裂解液
玻璃珠匀浆法
细胞悬液、微生物 剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁
三、蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（protease inhibitor cocktail）
苯甲基磺酰氟 (Pheylmethylsulfonyl fluoride， PMSF)：不可逆的抑制剂，使用浓度为1mmol/L ， 抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但在 水溶液中迅速失活
处理
样品中太多盐离子干扰IEF 丙酮沉淀去除盐和杂质
A.蛋白提取物 未经处理
B.经脱盐处理
C.商品化试剂 盒沉淀处理
带电荷杂质
样品不纯
2、内源性小分子（如核酸、代谢物和磷脂）
带负电荷，能发生偏阳极侧的聚焦不全 TCA/丙酮沉淀除去这类物质特别有效
3、离子去污剂
与多肽形成复合物 不能正确聚焦 重泡胀溶液可稀释含SDS样品 丙酮沉淀可去除部分SDS 高温下沉淀将最大限度除去SDS,但在-20℃沉淀会
更完全
4 、核酸（RNA、DNA）
核酸增加样品的黏度，并导致背景弥散 高分子质量的核酸能阻滞凝胶孔径 核酸可通过电稳态相互作用与蛋白结合，阻碍聚
焦 核酸也将被银染染色，导致高背景 DNase/RNase A混合物处理 超离
5、多糖
阻碍凝胶孔径、导致沉淀、延长聚焦时间、出现 水平条纹、与蛋白质形成复合物
硫酸铵或苯酚/醋酸铵沉淀，随后离心 超速离心
6、脂类
膜蛋白与脂类形成复合物，降低溶解性，影响等 电点和分子量
脂类与去污剂形成复合物，减低其效率 强变性剂和去污剂最大程度减少蛋白与脂类的相
互作用
7、酚类组分
通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白 应用还原剂防止苯酚的氧化 通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白 用抑制剂灭活多酚氧化酶 PVP或PVPP吸收酚来清除酚组分
2、三氯醋酸（TCA）沉淀
有效的沉淀方法：将TCA加到提取液中，终 浓度高达10~20%，冰上沉淀30min；组织 样可直接用10~20%TCA进行匀浆；最后用 丙酮清洗沉淀，以除去TCA
蛋白质再溶解很困难，且不能完全再溶
3、丙酮沉淀
沉淀机理：降低水的介电常数，导致具有表面水 层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出
一、温和裂解法
组成较简单样品 渗透裂解
血细胞、组织培养细胞 低渗溶液悬浮细胞
冻融裂解
细菌、组织培养细胞 液氮迅速冷冻细胞，随后在37 ℃融化，反复几次
去污剂裂解
组织细胞
溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物
酶裂解法
消化细胞壁
溶菌酶
细菌
纤维素酶、果胶酶
植物
AEBSF ：丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L ， AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于 水而且毒性低，AEBSF可能改变蛋白的等电点
EDTA，EGTA：使用浓度为1mmol/L，通过鳌 合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金 属蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制剂：使用浓度为2-20ug/ml