荧光标记二抗的选择
如何制作荧光二抗
如何制作荧光二抗
荧光二抗是一种常用于生物实验的染色剂，它可以用来检测细胞、组织或蛋白质的存在和分布情况。
荧光二抗通常是用来在荧光显微镜下观察样品，所以其荧光强度很重要。
下面就介绍一下如何制作荧光二抗。
1.选择荧光二抗
首先，你需要选择合适的荧光二抗。
常用的荧光二抗有FITC、TRITC、Cy3等，这些荧光二抗的波长不同，可以用来检测不同的标记物。
你需要根据自己的实验需要选择合适的荧光二抗。
2.准备荧光二抗溶液
其次，你需要准备荧光二抗溶液。
通常，荧光二抗是以粉末形式存在的，你需要将其加入适当的溶剂中，按照说明书指定的浓度进行稀释。
常用的溶剂有PBS、DMSO等，你需要根据自己的实验需要选择合适的溶剂。
3.添加防腐剂
接着，你需要添加防腐剂。
荧光二抗易被氧化，所以溶液中需要添加防腐剂来防止荧光二抗的氧化。
常用的防腐剂有硫酸钠、抗坏血酸等。
你可以根据自己的实验需要选择合适的防腐剂。
4.进行质量控制
最后，你需要对制作的荧光二抗溶液进行质量控制。
你可以使用荧光显微镜或流式细胞仪等仪器对荧光二抗的荧光强度进行检测。
如果荧光强度不符合要求，你可以调整溶液浓度或更换溶剂来调节荧光强度。
以上就是关于如何制作荧光二抗的方法。
在制作荧光二抗时，你需要注意选择合适的荧光二抗和溶剂，并加入防腐剂，最后进行质量控制。
这样，你就可以制作出高质量的荧光二抗溶液，为你的实验提供可靠的检测数据。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项以下是免疫荧光双标操作方法及注意事项的详细介绍：方法：1.样品制备：a.细胞：将培养皿中的细胞用磷酸盐缓冲液洗涤，并以适当浓度悬浮于PBS（磷酸盐缓冲液）中。
b.组织：从动物体内取出组织样本，用PBS洗涤并切成适当大小的块。
2.固定：a.细胞：用适当浓度的乙醛在室温下固定细胞。
b.组织：用适当浓度的乙醛固定组织样本，然后在PBS中冲洗。
3.渗透：a.细胞和组织：将样本浸泡在PBS-T（含0.2%的肌凝蛋白酶）中，进行渗透处理，以增强抗体的渗透性。
4.阻断：a.使用几何草酸或明胶作为非特异性蛋白质的抗原来阻止非特异抗体的结合。
5.主抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的一抗（特异抗体），孵育样本，可以在室温或4°C条件下进行。
6.洗涤：a. 用PBS-T或TBST（含0.1%的Tween 20）进行多次洗涤，以去除未结合的一抗。
7.次抗体孵育：a.加入适当稀释倍数的二抗（荧光标记的抗体），与一抗结合后，通过固定区域与目标蛋白进行特异结合。
8.洗涤：a.用PBS-T或TBST进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。
9.核染色/细胞膜染色：a.加入DNA染色剂（如DAPI）或细胞膜标记（如细胞膜标记染料），用于定位目标蛋白。
10.显微镜观察：a.将样本放置在玻片上，用荧光显微镜观察并拍照或记录图像。
注意事项：1.温度控制：孵育和洗涤过程中，适当控制温度可以提高抗体结合的特异性和效率。
2.抗体稀释倍数：需要根据实验要求和试剂手册推荐的稀释倍数来使用抗体。
3.阻断剂的选择：根据实验要求选择适当的非特异性蛋白质抗原来阻断非特异抗体的结合。
4.试剂保存：将抗体和荧光标记物保存在适当的低温条件下，避免暴露在光和高温下。
5.孵育时间：一抗和二抗的孵育时间需要根据试剂手册推荐的时间来进行。
6.具体细胞/组织类型的处理：不同的细胞或组织在样品制备和处理过程可能需要略微不同的方法，可以参考试剂手册或已发表的方法。
Westernblot一抗和二抗的选择讲解学习
W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
教你如何选择二抗
*教你如何正确选择二抗通常情况下，某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择，如何能选择到最适合该实验的二抗，需要综合以下几个方面进行考虑：●一抗的物种来源一抗是在什么物种来源的，相应的二抗也要是抗该物种的抗体。
例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，那么你就应当选择抗小鼠的二抗，如果一抗是在兔体内制备的，那么二抗就应当是抗兔的抗体。
至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。
●一抗是属于哪个类或亚类二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体.单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM，或是抗小鼠IgG抗体。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
如果你不知道一抗是哪一类别或亚类，那么抗小鼠IgG是一个不错的选择，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。
二抗的特异性下面总结了几种具有不同特异性的二抗：针对整个抗体分子（H＋L）具有特异性：如抗IgG(H+L)，此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合，即与抗体分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分（见图5）均可反应，抗IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA），因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（kappa链或lambda 链）。
针对Fab片段具有特异性：这类抗体与重链轻链均可以结合，由于它们可以与轻链反应，它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。
这对Fc片段或重链具有特异性：这类抗体和重链的Fc部分反应，一次它们是类别特异性的（即gamma链特异性抗体只与IgG反应，mu链特异性抗体只识别IgM，依此类推）。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验，这名字听起来就很炫酷，对吧？其实它就是一个让我们能同时看到两种不同标记物的实验。
没错，就是让我们在显微镜下像变魔术一样，看到细胞中的不同成分。
为了能让这个实验顺利进行，我们得好好挑选一抗和二抗，别小看这两个“小家伙”，它们可是实验成功的关键哦。
接下来，我们就来聊聊挑选一抗和二抗的那些事儿。
1. 选择一抗的基本要求首先，一抗是我们的“主角”，它负责直接和目标抗原结合。
为了让实验更靠谱，我们在挑选一抗的时候有几个基本要求。
首先，得确保一抗的特异性。
简单来说，就是一抗要能够准确地识别目标抗原，不会跟其他东西搭上关系。
你可以把它想象成找一个能只看中你家猫的侦探，千万别让它误认成了邻居家的狗狗。
此外，一抗的亲和力也很重要。
亲和力高的话，一抗就能牢牢地抓住目标抗原，不容易掉链子。
就像是找一个有“强烈吸引力”的好朋友一样，这样才能在关键时刻依靠得住。
1.1 一抗的来源选择一抗时，来源也要考虑清楚。
市面上的一抗分为很多种，有的是从小鼠身上提取的，有的是从兔子身上提取的，甚至还有从山羊身上提取的。
每种来源的一抗都有自己的优点和缺点。
例如，小鼠单克隆抗体常常具有高度的特异性，但可能在某些实验条件下效果不如其他来源的抗体好。
像兔子或者山羊的抗体则可能在灵敏度上表现得更好。
了解这些，才能找到最适合你实验的一抗。
1.2 一抗的纯度一抗的纯度也不能忽视。
想象一下，如果你的试剂里混杂了很多其他东西，就像是在派对上有太多不认识的人一样，肯定会让实验结果变得扑朔迷离。
因此，选择纯度高的一抗非常重要，它能让你减少实验中的干扰，提高结果的准确性。
选择纯度高的一抗，就像在举办一个小型的、只有好友参与的派对，所有人都知道自己干嘛的，大家都玩得开心。
2. 选择二抗的基本要求说完了一抗，接下来咱们聊聊二抗。
二抗是我们的“帮手”，它负责和一抗结合，并且带上荧光标记。
二抗的选择也有讲究，首先是它的特异性。
免疫荧光染色质量影响因素分析
免疫荧光染色质量影响因素分析免疫荧光染色是一种常用的细胞或组织分析方法，它能够通过特异性的抗体与目标蛋白结合，然后再使用荧光标记的二抗来检测目标蛋白的分布及表达水平。
免疫荧光染色技术具有灵敏度高、特异性好等优点，因此被广泛应用于生物医学研究领域。
免疫荧光染色的质量受多方面因素的影响，本文将对这些影响因素进行分析。
一、抗体的选择抗体的选择对于免疫荧光染色的结果至关重要。
需要选择具有高亲和力和特异性的抗体来保证染色的准确性和可靠性。
抗体的工艺制备和保存也会影响染色的质量，因此需要选择合适的抗体生产商或来源，并严格按照抗体的使用说明进行保存和使用。
二、样品的固定和预处理样品的固定和预处理对于免疫荧光染色的结果影响也较大。
不同类型的样品需要采用不同的固定和预处理方法，以确保目标抗原的完整性和可溶性。
在固定和预处理过程中，需要注意避免抗原损失或降解，同时保证样品的完整性和稳定性。
三、荧光标记的二抗选择荧光标记的二抗用于检测抗体与目标蛋白的结合情况，因此对于染色结果具有重要影响。
在选择荧光标记的二抗时，需要考虑其荧光标记物的稳定性和亮度，以及与抗体结合的效率和特异性。
四、染色试剂的质量免疫荧光染色过程中所使用的染色试剂的质量也会对染色结果产生影响。
染色缓冲液的pH值和离子强度、染色溶液的稀释比例等都会对染色的结果产生影响，因此需要选择高质量的染色试剂，并严格按照使用说明进行操作。
五、免疫荧光染色条件的控制免疫荧光染色过程中，温度、时间、光照等条件的控制也会对染色结果产生影响。
需要根据样品类型和抗体特性等因素，选择适当的染色条件，并严格控制每一步操作的执行。
六、荧光显微镜的性能和参数对于免疫荧光染色结果的观察和分析，荧光显微镜的性能和参数也会产生影响。
荧光显微镜的分辨率、亮度、对比度等参数会影响染色结果的清晰度和准确性，因此需要保证荧光显微镜的性能和参数处于最佳状态。
免疫荧光染色的质量受多方面因素的影响，包括抗体的选择、样品的处理、染色试剂的质量、染色条件的控制以及荧光显微镜的性能和参数等。
免疫荧光双标操作方法及注意事项【范本模板】
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色.双重免疫荧光标记法（double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法.(1）直接法双重免疫荧光标记:将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B）以适当比例混合，滴加在标本上孵育,然后洗去未结合的荧光抗体,在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠,但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察,从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下:1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定.3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS （1：1）。
条件许可,建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久.5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光.6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照.二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照:（1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物；(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物；(3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit—FITC(绿）和donkey anti—rat-Tex-Red(红）.2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧据一抗种属及类型-如何选择二抗?如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。
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荧光标记二抗的选择荧光标记二抗的选择-FITC/Rhodamine/Texas Red/Cy/PE/AMCA一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP)，荧光基团(FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine)和生物素。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术)中通常使用荧光标记的二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。
其中荧光素是具有光致荧光特性的染料，荧光染料种类很多，目前常用于荧光标记二抗有以下几种：【异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)荧光标记二抗】FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。
FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。
由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。
FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。
【四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC)，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)荧光标记二抗】这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长(550, 570, 596nm)和最大发射波长(570, 590, 620nm)。
尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。
在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。
氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激发波长。
因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白(PE)耦联基团要比罗丹明好。
TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。
最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。
因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。
【菁类染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)】Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。
Cy2和FITC 使用相同的滤波片。
由于Cy2比FITC在光下更稳定。
要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。
Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。
Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。
因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。
Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。
Cy3可以和荧光素一起作双标。
Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。
Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。
在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。
Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。
由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。
通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。
在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。
使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。
【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。
当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。
藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。
藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。
【Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)】耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。
对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。
由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。
AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。
由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。
AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。
且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。
如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。
注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。
另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。
例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。
如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。
流式细胞术多色荧光分析指南2009年6月11日流式细胞术多色荧光检测是目前精细鉴定细胞亚群及分析不同细胞亚群功能的重要手段，在国际和国内均得以广泛应用。
然而，面对种类繁多的荧光染料，如何知道这些染料是否适合您所拥有的流式细胞仪，以及这些染料间的颜色补偿究竟有多大呢？下面提供两个表格谨供参考，希望能给您带来一丝感悟。
1荧光素激发波长 (nm) 发射波长(nm) 长通滤片带通滤片eFluor TM450 405, 407 450 -- 440/40, 450/50 Pacific Blue 405, 407 455 -- 440/40, 450/50 eFluor TM605NC355, 405, 407 605 595LP 605/40eFluor TM625NC355, 405, 407 625 595LP 605/50eFluor TM650NC355, 405, 407 650 630LP 660/40FITC 488 518 -- 530/30Alexa Fluor® 488 488 519 -- 530/30PE 488 575 550LP 575/26, 585/40PE-Cy5 488 667 635LP 670/14, 695/40 PE-Cy5.5 488 695 685LP 695/40PerCP-Cy5.5 488 695 685LP 695/40, 710/40 PE-Cy7 488 785 735LP 780/60, 780/40 APC 633, 635, 640 660 -- 660/20Alexa Fluor® 647 633, 635, 640 668 -- 660/20Alexa Fluor® 700 633, 635, 640 723 685LP 710/40, 710/50, 720/45APC-eFluor TM780 633, 635, 640 780 735LP 780/60APC-Alexa Fluor®750633, 635, 640 775 735LP 780/60 注释:1.以eFluor TM450为例: 最大激发波长为405 nm或407 nm, 最大发射波长为450 nm, 流式细胞仪检测时无需长通滤片(LP, Long Pass), 而需440/40 (即检测波长范围为440 + 20 nm)或450/50 (即检测波长范围为440 + 25 nm)的带通滤片 (BP, Band Pass)。
2.以eFluor TM605NC为例: 最大激发波长为335 nm, 405 nm或407 nm, 最大发射波长为605 nm,流式细胞仪检测时需595LP长通滤片(即大于595 nm的光可透过滤片, 而小于595 nm的光被滤片反射),和605/40 (即检测波长范围为605 + 20 nm)的带通滤片。
2FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC AlexaFluor®APC-AlexaFluor® 750eFluor TM450eFluor TM605NCeFluor TM650NC700FITC 1.10 0.00 0.08 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 PE 16.52 0.01 1.62 0.00 0.00 0.00 0.00 0.41 0.00 PerCP-Cy5.5 3.37 27.52 3.50 0.74 5.29 0.16 0.00 0.06 31.83 PE-Cy7 0.27 2.01 11.48 0.11 0.86 1.86 0.00 0.00 0.08 APC 0.00 0.01 2.19 0.05 0.62 22.80 0.00 0.06 77.17Alexa Fluor®0.00 0.00 19.35 0.11 29.46 8.84 0.00 0.00 5.83 700APC-Alexa0.09 0.00 3.09 5.34 5.10 25.70 0.01 0.03 0.00 Fluor® 750eFluor TM450 0.27 0.00 0.00 0.00 0.00 0.06 0.22 0.15 0.09 eFluor TM605NC 1.51 16.99 0.00 0.02 0.03 0.32 0.00 1.47 6.02 eFluor TM650NC0.24 1.02 1.43 0.01 1.06 0.00 0.44 0.00 1.02 注释:1.表中数值表示各荧光检测通道间的颜色补偿值 (compensation), 单位为%。