免疫标记技术及分析应用
免疫学检测技术及应用
划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。
免疫标记技术的应用
免疫标记技术的应用免疫标记技术是一种重要的实验技术，其主要应用于生物学、医学等领域中。
以下是免疫标记技术的主要应用及其特点：1. 免疫印迹技术免疫印迹技术又称为Western blotting，是一种检测蛋白质的方法。
该技术主要应用于检测蛋白质的表达、定位及重组蛋白的纯化等研究领域。
与传统的蛋白质检测方法相比，免疫印迹技术具有高灵敏度和高特异性的特点。
2. 免疫组化技术免疫组化技术是一种基于免疫标记技术的细胞和组织学研究方法，用于检测蛋白质在组织或细胞中的分布、表达水平及其定位。
该技术可用于研究肿瘤、癌症等多种疾病的发生机制、转移及预后等方面，具有高度特异性和敏感性。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种利用激光光散射和荧光技术对细胞进行分析和排序的方法。
该技术可用于研究细胞的免疫特性、组成、功能及化学性质等方面。
流式细胞术具有高通量、高特异性和高灵敏度等特点，广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和肿瘤学等领域。
4. 免疫沉淀技术免疫沉淀技术是一种重要的蛋白质相互作用研究方法。
该技术利用抗体将目标蛋白质与其他蛋白质结合，然后通过沉淀和检测蛋白质相互作用。
免疫沉淀技术可用于研究蛋白质的复合物组成、相互作用、调控和信号传递等方面，具有高度特异性和敏感性。
5. 免疫荧光技术免疫荧光技术是一种基于荧光染料和抗体的免疫标记技术。
该技术可用于研究细胞或组织内特定蛋白质及其亚细胞定位、表达水平等方面。
免疫荧光技术具有高分辨率、高特异性和高灵敏度的优点，广泛应用于细胞学、免疫学、感染病原体检测等领域。
总之，免疫标记技术是现代生物医学研究中不可或缺的实验技术之一。
其应用范围广泛、技术手段多样、具有高度特异性和敏感性等优点，成为了生物学及医学领域的重要研究工具。
免疫标记技术的原理应用
免疫标记技术的原理应用1. 什么是免疫标记技术？免疫标记技术（Immune Labeling Techniques）是一种利用抗体与待检测物质特异性结合的原理，通过对待检测物质进行标记，从而实现疾病诊断、研究细胞功能、鉴定蛋白质等目的的一种技术手段。
2. 免疫标记技术的原理免疫标记技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
抗体是一种高度特异性的蛋白质，能够结合到目标分子（抗原）上，形成抗原-抗体复合物。
在免疫标记技术中，通常使用荧光染料、放射性同位素、酶等标记抗体或者直接标记抗原来实现标记。
3. 免疫标记技术的应用领域免疫标记技术在生物医学研究、药物研发等领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：•免疫组织化学：免疫标记技术可以用于标记和检测组织中特定细胞或者蛋白质的表达，帮助研究组织的结构和功能，以及相关疾病的诊断和治疗。
•流式细胞术：免疫标记技术可以用于标记和检测特定细胞类型和分子的表达，帮助研究细胞的免疫功能、疾病诊断和治疗效果评估。
•免疫印迹（Western blotting）：免疫标记技术可以用于研究蛋白质的表达水平和相互作用，帮助研究蛋白质功能、疾病机制和药物研发。
•免疫组化：免疫标记技术可以用于标记和检测肿瘤标志物、炎症标志物等，帮助研究疾病诊断、治疗效果评估和预后判断。
•分子生物学实验：免疫标记技术可以用于检测和定量特定蛋白质的表达水平，帮助研究基因功能、信号转导和细胞周期等。
4. 免疫标记技术的优势免疫标记技术具有以下几个优势：•高度特异性：免疫标记技术通过抗体与抗原的特异性结合，可以准确地标记和检测特定分子或者细胞。
•高灵敏度：免疫标记技术通常采用放射性同位素、酶或者荧光等标记物，具有很高的检测灵敏度。
•广泛适用性：免疫标记技术可以应用于不同的样本类型，包括组织、细胞、血清等，适用于各种实验条件。
•定量和定位分析：免疫标记技术不仅可以检测目标分子的表达水平，还可以用于研究分子定位和相互作用。
标记免疫分析临床
标记免疫分析临床标记免疫分析（Immunoassay）是一种基于免疫学原理的生物分析方法，广泛应用于临床诊断和研究领域。
通过标记特定抗原或抗体，结合其与靶分子的特异性相互作用，标记免疫分析能够准确检测和定量分析目标分子的存在和浓度。
在标记免疫分析中，通常使用荧光、酶、金颗粒等标记物作为信号发生器。
这些标记物能与目标分子或抗体发生特异性结合，并通过其特性来输出检测结果。
标记免疫分析的灵敏度高、专一性强，且具有高通量性和自动化程度高的优势，因此在临床应用中得到了广泛的应用。
一、标记免疫分析在临床诊断中的应用1. 临床生化指标检测标记免疫分析在临床生化指标检测中具有广泛的应用，如血糖、血脂、肝肾功能、心脏标志物等。
通过检测相关指标的浓度变化，可以快速准确地评估患者的健康状况以及疾病的进展情况，提供临床决策的依据。
2. 肿瘤标志物检测标记免疫分析在肿瘤标志物检测中扮演重要角色。
通过检测特定肿瘤标志物的浓度变化，可以帮助医生判断肿瘤的存在与否、疗效评估及预后预测等。
例如，CA125在卵巢癌的早期筛查和监测中具有重要意义。
3. 传染病诊断标记免疫分析对于传染病的诊断与监测也有着重要的作用。
例如，HIV、乙肝病毒等病原体的抗体检测，用于早期发现感染，以采取相应的预防和治疗措施。
标记免疫分析可以提供高灵敏度和高特异性的检测结果，有助于及早干预和控制传染病的传播。
二、标记免疫分析在疾病研究中的应用1. 免疫相关疾病的研究标记免疫分析在免疫相关疾病的研究中发挥着重要作用。
例如，自身免疫病的发病机制研究、药物治疗的监测和疗效评估等都离不开标记免疫分析。
通过检测某些自身抗体或免疫相关因子的变化，可以深入了解疾病的发生和发展过程，为新药研发和治疗提供理论依据。
2. 药物代谢及药物监测在药物研究和临床应用中，标记免疫分析可以用于检测药物及其代谢产物的浓度。
通过测定药物浓度的定量变化，可以评估药物的吸收、分布、代谢和排泄过程，进而调整药物剂量、制定个体化治疗方案，提高疗效、减少副作用。
免疫标记技术及分析应用
将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结 合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于 固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下 催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜 色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正 比。
精品课件
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
精品课件
3. 夹心法：
+
+
+
双抗体夹心法 双抗体夹精品心课件法是检测抗原最常用的方法
精品课件
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
精品课件
缺点： 标记反应较难掌握，在操作
过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
精品课件
一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标
记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物
易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的 常影用响酶（用于均相测定的酶标底抗物原与抗体结合后
显色
辣酶根活过性氧出化现物抑酶 制或激邻苯活二）胺；、无H2害O2 ；稳定，价橙廉、 黄易色得。
四甲基联苯胺、
H2O2
蓝色
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
临床常用标记免疫技术及特点
临床常用标记免疫技术及特点1.引言1.1 概述标记免疫技术是现代生物医学领域中常用的一种实验方法，其通过在生物样本中引入特定的标记物，来检测、定量或分析目标物质的存在和性质。
这些标记物可以是荧光染料、放射性同位素、酶或其他具有特异性的物质。
在临床医学中，标记免疫技术具有广泛的应用，可以用于诊断疾病、评估治疗效果、研究疾病机制等方面。
常用的标记免疫技术包括免疫荧光染色、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)等。
免疫荧光染色技术是一种利用特异性抗体与标记物结合后发出荧光信号的技术。
通过荧光显微镜观察样本中的荧光信号，可以定位、鉴定并定量分析目标物质。
这种技术具有高灵敏度、高特异性和高分辨率的特点。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是一种利用特异性抗体与酶结合后，通过酶催化反应来产生可定量的信号的技术。
ELISA技术可以用于检测血清中的免疫球蛋白、抗原、抗体等多种生物分子，并可定量测定其浓度。
ELISA 技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点。
放射免疫测定(RIA)是一种利用放射性同位素标记分子，通过测量放射性同位素放出的射线来定量目标物质的技术。
RIA技术在测定极低浓度物质或微量物质时具有非常高的敏感性和特异性。
然而由于放射性同位素标记物的安全性和环境污染问题，RIA技术在临床实验室中的应用受到了限制。
总之，标记免疫技术在临床医学中具有重要的应用价值，可以帮助医生准确、快速地诊断疾病，评估治疗效果，深入研究疾病的发生机制。
随着科学技术的不断进步，标记免疫技术也在不断发展，将为临床医学带来更多的突破和进展。
1.2文章结构文章结构部分：本篇文章主要介绍临床常用标记免疫技术及其特点。
文章结构如下：第一部分为引言，包括概述、文章结构和目的。
在概述中，将介绍免疫技术在临床应用中的重要性和广泛应用的背景。
在文章结构部分，将详细说明本篇文章的章节分布和内容安排。
在目的部分，将说明本文的目的和意义，为读者明确文章的目标。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
标记免疫分析技术的发展及时间分辨荧光免疫技术的临床应用
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抗体的所在部位，或在µg、甚至ng水平 上对其进行定量。
33
将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合， 酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相 载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化 底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的 物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。
3
免疫标记技术
分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧
光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免 疫测定。
特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位
4
免疫标记技术
反应类型
实验技术
结果判断
标记免疫反应 荧光免疫技术 检测荧光现象
放射免疫技术 检测放射性强度
酶免疫技术 检测酶底物显色 发光免疫技术 检测发光强度
14
荧光显微镜
利用一定波长的激发 光对样品进行激发，产 生一定波长的荧光，对 样品结构或其组分进行 定性、定位、定量观察 检测。
15
荧光显微镜的种类
透射式
落射式
16
荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
分色镜
汞灯
17
流式细胞仪
18
荧光酶标仪
19
（1）直接荧光染色法
将荧光素标记在特异性抗体上，直接检 测抗原。 优点：简单、快速、特异性高。 缺点：敏感性差。
液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）
6
第二节
7
将抗体或抗原标记以荧光素，然后与 相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物 在一定波长光的激发下可产生荧光，借助 荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。
当出现荧光时，表明标记抗体存在， 相应的抗原也存在。
8
9
抗体的荧光素标记
FITC 异硫氰酸荧光素
❖标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫 氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结 合成荧光抗体。 ❖标记方法:
搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。 标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。
透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。 标记比较匀， 非特异染色较低。
34
优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于 普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素 污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且 仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。
碱性磷酸酶
对硝基苯磷酸酯
黄色
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二、 标记方法 酶结合物
技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗 原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较 少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原 的聚合物。
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戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶
改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟
基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRPCH2-NH-IgG
速度、震板功能、温度控制、定性和定量 的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、 405nm
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44
返回
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免疫标记技术
放射物标记技术
酶标技术
免疫荧光技术
ELISA 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术
双抗体夹心法
竞争法
双抗原夹心法
间接法
金免疫技术 检测金颗粒沉淀
5
免疫标记技术
用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免
疫学诊断的敏感性
放 125I射、性131同I 位素：酶：碱辣性根磷过酸氧酶化物酶、
荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿 色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明 （红色荧光）
放射免疫检测法（RIA） 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA）
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缺点： 标记反应较难掌握，在操作
过程中容易引起酶、抗原或抗体 的失活。
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一、常用的酶及其底物
酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记
后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判
定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响
常（用用酶于均相测定底的物酶标抗原与抗显体色结合后酶活性 辣出根现过抑氧制化或物激酶 活邻）四苯；甲二基无胺联害、苯；H胺2稳O、2定H，2O2价橙廉蓝黄、色色易得。
10
பைடு நூலகம் 常 用 的 荧 光 素
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11
12
荧光抗体的纯化
❖去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过 滤 ❖去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子 交换层析法 ❖去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或 固相抗原吸收
13
荧光检测仪
（1）荧光显微镜 （2）荧光分光光度计 （3）流式细胞仪 （4）荧光偏振光分析仪
40
三、酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色
葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法
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2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法
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四、酶标仪（酶联免疫检测仪）
比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测
缺点：操作流程长、干扰因素多、 非特异性荧光多，补体易失活、需 新鲜制备不方便。
28
29
30
第三节
Enzyme Immunoassay（EIA）
31
就是将抗原和抗体的特异性免 疫反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。
32
抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光
20
直接法
间接法
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23
（2）间接荧光染色法
将荧光素标记在第二抗体（抗抗体） 上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特 异性抗体。
24
直接法
间接法
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26
（3）补体荧光染色法
将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3 抗体），检测抗原抗体复合物。
27
优点：可检测所有的抗原抗体系统， 具通用性；敏感性高。
第七章 免疫标记技术及分析应用
第一节 免疫标记技术 第二节 免疫荧光技术 第三节 免疫酶技术 第四节 放射免疫技术 第五节 免疫胶体金标记技术
1
第一节 免疫标记技术
用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、 胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记 抗体或抗原进行的抗原抗体反应。
2
荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电 子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对 实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。
双位一点法
其他标记技术
48
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay