DNA提取及常见问题分析解析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法
高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法DNA提取是分子生物学研究中常用的重要实验步骤，其目的是从细胞或组织样本中提取出高质量的DNA。
然而，在DNA提取的过程中，常常会遇到一些问题导致低产或低效的情况。
本文将针对高产高效DNA提取手段常见问题进行原因诊断和策略定位，帮助科研人员解决相关的实验难题。
1. 低DNA产量的问题：低DNA产量可能是由以下几个方面的原因导致的：1.1 样本因素：- 细胞或组织样本中DNA含量本身较低；- 样本存储不当，导致DNA降解；- 样本含有DNA酶或其他污染物。
1.2 提取步骤因素：- 细胞或组织裂解效果不理想；- DNA粘附在某些物质上无法充分溶解；- 溶解缓冲液中的离子浓度或pH值不适宜；- DNA提取试剂的质量不过关。
针对低DNA产量的原因，可以采取以下策略定位和改进措施：- 重新评估样本的储存条件和处理方式，确保样本质量良好；- 优化细胞或组织的裂解过程，可尝试使用化学物质、酶或高温等方法增强裂解效果；- 使用高纯度的蛋白酶K等去除DNA酶或其他污染物；- 确保溶解缓冲液具有合适的离子浓度和pH值，可根据实际情况进行调整；- 选择质量可靠的DNA提取试剂盒，确保试剂的活性和纯度。
2. 低DNA提取效率的问题：低DNA提取效率可能是由以下几个方面的原因导致的：2.1 样本因素：- 样本中DNA含量较低；- 样本中存在DNA降解酶。
2.2 提取步骤因素：- DNA在某些步骤中流失或粘附在器具壁上；- 某些试剂的浓度不适宜。
为了提高DNA提取效率，可以采取以下策略定位和改进措施：- 使用高质量的样本，确保样本中已有DNA的充足量；- 添加DNase酶抑制剂或其他方法抑制DNA降解酶的活性；- 定期更换或清洗使用的器具，防止DNA的流失或粘附；- 审查并校正提取试剂的浓度，确保试剂与样本反应的适宜性。
3. 其他常见问题与策略定位：除了低产量和低效率的问题外，还有其他常见的DNA提取相关实验问题，例如：3.1 DNA质量下降：- 样本的存储时间过长，导致DNA降解；- 提取试剂的质量不过关。
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
质粒DNA提取实验常见问题解答
质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
DNA提取常见问题
DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
基因组提取常见问题解析
基因组提取常见问题解析一、引言基因组提取是生物实验中的一项基本技术，主要用于获取生物体的DNA或RNA。
在基因组提取过程中，可能会遇到各种问题，这些问题可能会影响提取的效率和纯度，进而影响后续的实验结果。
本文将对基因组提取过程中的常见问题进行解析，旨在帮助实验人员更好地进行实验操作。
二、基因组提取过程中的常见问题1.样本制备问题样本制备是基因组提取的第一步，也是最关键的一步。
在这一步中，实验人员需要将生物样本进行处理，以便后续的提取过程。
然而，样本制备过程中可能会出现一些问题，例如样本量不足、样本被污染、样本中的DNA已经被降解等。
这些问题都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
2.DNA提取方法DNA提取方法的选择和使用也是影响基因组提取质量的重要因素。
不同的生物样本需要不同的提取方法，如果选择不当或者使用不当，都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
此外，不同的提取方法也有其各自的局限性，例如耗时、耗力、提取的DNA量少等。
3.基因组损失和降解基因组损失和降解是基因组提取过程中最常见的问题之一。
在提取过程中，由于各种原因（如机械力、化学反应、酶活性等），DNA可能会被损失或者降解，这会导致提取的基因组不完整或者质量不高。
此外，DNA损失和降解还可能影响后续的实验结果，例如PCR 扩增、测序等。
4.杂质和污染物在基因组提取过程中，杂质和污染物是不可避免的。
这些杂质和污染物可能来源于生物样本本身、提取溶液、实验室环境等。
这些杂质和污染物可能会影响提取的基因组的质量和纯度，进而影响后续的实验结果。
因此，实验人员需要采取有效的措施去除这些杂质和污染物。
DNA提取纯化用到的常见问题集
DNA提取纯化用到的常见问题集分享】DNA提取纯化用到的常见问题集Q1: 抽提DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?A1: 酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性剂的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%-15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA ，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA 。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿1:1混合使用。
Q2：为什么用酚与氯仿抽提DNA 时，还要加少量的异戊醇?A2：在抽提DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊醇的比例为24:1。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为251，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
Q3：植物基因组DNA提取时遇到多糖成分的干扰，DNA提取纯化质量一直不高，如何消除多糖的影响？A3：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA 成胶冻状。
而CTAB DNA提取纯化法可基本上除去多糖。
如果是植物材料本身含糖量比较高，可尝试以下方法：1、在DNA未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。
可用缓冲液如：100 mmol/L Tris –HCl (pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol。
DNA和RNA提取原理及常见问题分析
硅质材料的吸附 或用异丙醇沉淀浓缩RNA。 经DEPC 处理的水溶解RNA
材料准备及裂解
RNA的提取
尽量使用新鲜材料，条件允许的情况下现取现提 组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组 织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理。 对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入 专门的RNA样品储存液中保存（动物的脾脏及消化系统中RNA 非常容易降解，同时DNA的含量丰富，操作应格外的快速小 心）。 液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻 底而迅速地匀浆。
杂质的抽提
RNA的提取
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖 和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中 对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机 溶剂抽提
RNA的沉淀和溶解
RNA的提取
含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖 等杂质 或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集 沉淀，70％乙醇洗涤，晾干 用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA 样品收集后或需长期保存时应置于－70℃ 或加入RNase抑制 剂，分装使用
提取RNA的注意事项
经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase，会导致RNase污染。 使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。 应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。 使用有效的RAase抑制剂
DNA提取常见问题
问题二：DNA降解。 原因
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第二部分：DNA提取方法简介
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法
其它
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
SDS 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55 ～ 65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 Tris-HCl EDTA NaC （pH8.0） （pH8.0）l 100 mM 20 mM CTAB PVP40 β-巯基乙 醇 2%（V/V） 使用前加 入
SDS法DNA提取缓冲液
组份 Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ）NaCl SDS
终浓 度
10 mM
20 mM
0.4M
2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成 Nhomakorabea淀析出，因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
组份 TrisEDTA HCl （pH8.0）NaCl （pH8.0） CTAB β-巯基乙 醇 0.1% （V/V）使 用前加入
组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解
含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
细胞裂解
基因组DNA的提取
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡
终浓度
100 mM
20 mM
2%(W/ 1.4M V)
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
核酸提取及常见问题分析 （一）——DNA
主讲人：张蕾
09年8月12日
内容
第一部分：前言 第二部分：DNA提取方法简介
第三部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
前言
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。
磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
基因组DNA－其它方法
浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
细胞器DNA－差速离心法
核酸分离、纯化
多糖的去除：
高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体 积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。
用多糖水解酶将多糖降解。
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
差速离心法原理
是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、 冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有： 吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• • •
阴离子交换树脂
低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
核酸分离、纯化
基因组DNA的提取
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体 系
采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔
离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方 法
核酸分离、纯化
蛋白质的去除：
酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理
终浓 度
1.4 M
3%(W/ V)
5%(W/ V)
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
裂解液
酒精沉淀
植物材料
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
第三部分：DNA提取常见问题、 第二部分： 原因分析及其对策
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）