黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

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黄颡鱼FZD家族4个基因的克隆、组织表达及对铜的响应

２１７６、３２４３、２５０９ｆ￣３０２１ｂｐ，其中ＯＲＦ长度分别为ｌ６５２、２０８４、１６４９和２１６ｌｂｐ，编码５５ｌ、６９５、５５０和５８６个氨基酸。氨基酸序列比对和系统树分析显示，４种基因十分保
守，黄颡鱼与斑点叉尾鲴亲缘关系最近。组织表达分析显示，４种基因的ｍＲＮＡ在脑、脾脏、肾脏、鳃、心脏、肌肉、脂肪、肝脏及卵巢等组织中都有表达，而其表达量不尽相同。ＦＺＤ家族基因对铜的响应研究表明，在暴露２８ｄ时，ｆｚｄ３ａｍＲＮＡ水平随着铜浓度的增加而增加，但￣Ｃｚｄ２、ｆｚｄ４￣ｆｚｄｌ０基因表达各个处理组无显著性差异；在５６ｄ，厂Ｚｄ２
张丽晗，罗智，有文静，李丹丹，吴坤，潘亚雄
（华中农业大学水产学院，动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉４３００７０）
摘要：实验采用ＲＴ—ＰＣＲ和ＲＡＣＥ克、ｆｚｄ３ａ、和１０基因，其ｃＤＮＡ全长分别为
铜是包括鱼类在内的脊椎动物必需的微量元素之一，广泛地参与体内的许多生化过程，然而，过量的铜对生物体是有毒的。与其他脊
椎动物不同，鱼类可以经由鳃从水中吸收铜。前期研究发现水体铜暴露能影响黄颡鱼（Ｐｅｌｔｅｏ．ｂａｇｒｕｓｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）的卵巢发育和激素分泌 ¨”。鉴于ＦＺＤ家族基因和蛋白对卵巢发育的重要作用，实验假设ＦＺＤ家族成员介导了铜影响黄颡鱼卵巢发育和激素分泌的调控。所以，作为深入解析这些成员功能的第一步，本实验首先克隆了黄颡鱼、ｆｚｄ３ａ、￣ｚｄ４７ｆ１］ｆｚｄｌ０基因全长的ｃＤＮＡ序列，探讨了它们的组织表达模式，研究了水体铜暴露对这些基因ｍＲＮＡ表达的影响，为深入研究ＦＺＤ家族基因在鱼类卵巢发育和激素分泌中的作用奠定基础。

黄颡鱼免疫球蛋白 M基因的克隆与组织表达分析

第28卷第6期大连海洋大学学报Vol.28No.6 2013年12月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Dec.2013文章编号:2095-1388(2013)06-0515-07黄颡鱼免疫球蛋白M基因的克隆与组织表达分析叶仕根,费阳春,李强,李华(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023)摘要:根据GenBank中登录的免疫球蛋白M(IgM)基因编码氨基酸的保守序列以及鱼类密码子的偏好性设计简并引物,提取黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco脾脏总RNA,经RT-PCR扩增首次获得了黄颡鱼IgM的部分序列(675bp)㊂以β-actin为内参基因,通过Real-time PCR法分析了黄颡鱼IgM基因的组织分布特点㊂结果表明,在黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁中肾㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠道中均检测到IgM基因的表达,头肾和脾脏是IgM表达的主要部位,肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠道和肝胰脏等组织中表达量居中,肌肉中表达量最低㊂经鮰爱德华菌Edwardsiella ictaluri胞外产物免疫后,头肾㊁脾脏和肝胰脏中IgM基因表达呈现不同的变化规律㊂关键词:黄颡鱼;IgM;克隆;组织分布中图分类号:Q786 文献标志码:A 免疫球蛋白(Immunoglobulins,Ig)是有颌类脊椎动物所特有的介导体液免疫的重要效应分子,在脊椎动物特异性免疫系统中起着关键作用㊂Ig 分子包括重链和轻链两部分,根据重链恒定区化学结构的差异,可将Ig划分为多种类型㊂不同动物所拥有的Ig种类不同,目前已报道的硬骨鱼类Ig 有IgM㊁IgD㊁IgZ/T和IgM-IgZ嵌合体等几种类型[1-5]㊂有报道指出,病原菌感染可明显提高鳜鱼IgM的表达水平,而IgD和IgZ无明显变化[6],内毒素刺激则可增加鲤IgM-IgZ嵌合体基因的转录[5],这说明不同类型的Ig有不同的免疫应答机制㊂在这些Ig分子中,IgM存在于所有有颌类脊椎动物中,其重链代表了从软骨鱼类到哺乳类的一个连续进化的过程[7]㊂同时,IgM也是鱼类最先表达的抗体,在体液免疫尤其是抵抗细菌性抗原侵扰方面起着重要作用[8-9]㊂目前,已有多种鱼类IgM 重链基因被克隆鉴定,诸如模式鱼类斑马鱼Danio rerio[10]和一些重要的经济鱼类[11-17]㊂这些研究结果显示,不同鱼类的IgM重链之间存在基因数目差异和序列特异性,同时不同鱼类IgM基因的组织分布也存在差异㊂黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco是重要的经济鱼类之一,然而对其IgM基因的研究至今尚未见报道㊂本研究中,作者根据GenBank数据库中登录的黄颡鱼近缘物种的IgM重链序列信息,通过设计简并引物克隆IgM重链基因的部分片段,同时采用Re⁃al-time PCR方法研究黄颡鱼IgM重链基因在各组织中的表达情况以及经胞外产物(OMPs)免疫刺激后的变化规律,以期为黄颡鱼的抗感染机制和免疫防治技术研究提供理论依据,对了解鱼类免疫应答的分子机制以及免疫系统的起源与进化等具有重要意义㊂1　材料与方法1.1　材料试验用黄颡鱼体质量为35~50g,购自辽宁营口某黄颡鱼养殖场,驯养一周后用于试验㊂Trizol总RNA提取试剂盒㊁M-MLV反转录酶㊁荧光定量PCR试剂盒SYBR®Green SuperMix-UDG 试剂盒等购自上海Invitrogen公司;pMD18-T载体㊁Taq DNA聚合酶㊁DNA Marker均购自宝生物(大连)工程有限公司;引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成㊂1.2　方法1.2.1　IgM重链基因核心序列的扩增　黄颡鱼暂　收稿日期:2013-03-13　基金项目:国家十二五”科技支撑计划项目(2011BAD13B03)　作者简介:叶仕根(1976-),男,副教授㊂E-mail:yedlsy@ 通信作者:李华(1958-),女,教授㊂E-mail:lihua@养一周后,随机挑选2尾,取其脾脏,按照试剂盒说明书方法提取黄颡鱼脾脏总RNA㊂选用经电泳和紫外分析检测条带清晰㊁完整性好的RNA用于后续的反转录和PCR扩增㊂取4μL(约2μg)总RNA悬液,使用M-MLV反转录酶和oligo(dT) 18于37℃下进行反转录,所得cDNA于-20℃下保存备用㊂根据NCBI中已登录的鱼类免疫球蛋白重链恒定(CH)区氨基酸保守序列设计简并引物[13],正向引物F′为5′CCNACNCARACNGAY⁃ATHGAY3′,反向引物R′为5′NYTNACNTGYTAY⁃GTNAARGA3′,其中N为G㊁A㊁T或C;Y为T 或C;R为G或A,W为A或T㊂在此基础上,参照鱼类密码子偏好性[18]对引物做进一步修改,去掉一些鱼类较少使用的密码子,针对性地降低引物的简并度㊂修改后的正向引物IgM-F为5′CCAAC⁃CCAAACAGAMATAGAC3′,反向引物IgM-R为5′TCTTTWACATAGCAAGTCAGG3′,引物简并度由1 536㊁4096下降至2㊂以cDNA第一链为模板进行PCR扩增,将所得目的条带回收纯化并与PMD-18T载体连接,转化至DH5α中,经菌落PCR和酶切鉴定后,送北京六合华大基因科技股份有限公司测序㊂1.2.2　序列分析　参照李颖等[19]的方法,将测序得到的序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm. /blast)进行相似性搜索和比对,并提交GenBank㊂采用Expasy网站的Prosite在线工具(ht⁃tp:///prosite.html)进行编码蛋白质的保守结构域分析,用Clustal X1.8和DNA6.0程序进行氨基酸序列同源性分析和作图㊂1.2.3　IgM重链基因组织表达量的检测　随机选取3尾黄颡鱼,分别取肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁肾脏㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠等8个组织,液氮速冻后按上述方法提取各组织总RNA并反转录得到cDNA㊂根据 1.2.1”和 1.2.2”节中获得的IgM重链基因序列设计实时定量PCR引物,正向引物IgM-F1为5′AGAGCCAGAAGTGAGCATTA 3′,反向引物IgM-R1为5′CTTGGCAGGTGTATGT⁃GG3′㊂根据黄颡鱼β-actin基因的序列(GenBank 登录号:EU161066.1)设计实时定量PCR内参引物,正向引物ACTIN-F为5′GATCCGGTATGTG⁃CAAGGCT3′,反向引物ACTIN-R为5′TGC⁃CAGATCTTCTCCATATCA3′(表1)㊂引物合成后,以cDNA第一链为模板进行PCR扩增,经E.B染色,用15g/L琼脂糖电泳检验其特异性㊂表1　基因克隆与组织表达分析所用引物序列Tab.1　Sequences of the primers used in the gene cloning and tissue expression引物primer 序列sequence产物长度length/bp 用途application IgM-F5′CCAACCCAAACAGAMATAGAC3′675IgM基因克隆的上游简并引物IgM-R5′TCTTTWACATAGCAAGTCAGG3′675IgM基因克隆的下游简并引物IgM-F15′AGAGCCAGAAGTGAGCATTA3′216IgM Real-time PCR上游引物IgM-R15′CTTGGCAGGTGTATGTGG3′216IgM Real-time PCR下游游引物ACTIN-F5′GATCCGGTATGTGCAAGGCT3′203ACTIN Real-time PCR上游引物ACTIN-R5′TGCCAGATCTTCTCCATATCA3′203ACTIN Real-time PCR下游引物荧光定量PCR参照刘俊等[20]的方法,并作适当修改㊂采用2 △△CT法计算基因在各组织中的表达量:　△△CT=(CT IgM x-CT actin x)-(CT IgM0-CT actin0),其中:CT为样品管中荧光强度达到特定阈值时的扩增循环数;x表示8个待测组织中的任一组织; 0表示8个待测组织中相对表达量最低的组织㊂用SYBR Green qPCR试剂盒,在Step one定量PCR仪上进行实时定量扩增㊂首先将反转录获得的cDNA 模板以及引物浓度进行优化,将CT值调整为20左右㊂扩增反应程序为:95℃下预变性2min;95℃下变性30s,62℃下退火30s,共进行40个循环㊂每个样品均进行IgM和β-actin表达量的测定㊂每个样本同时设立3个平行管,每次反应均设置熔解曲线分析,以验证扩增反应的特异性㊂反应完成后,系统软件将自动给出每个样本扩增的IgM和β-actin基因的CT值,在此基础上进一步进行基因表达差异的分析㊂1.2.4　鮰爱德华菌OMPs免疫对IgM基因表达的影响　取大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室分离保存的黄颡鱼病原菌鮰爱德华菌A86,经扩大培养后,参照李强等[21]的方法提取OMPs㊂调整OMPs浓度为1mg/mL,与弗氏完全佐剂等体积混合后腹腔注射免疫黄颡鱼30尾(100μL/尾)㊂分别于免疫接种后第4㊁8㊁14㊁21和28天随机选取3尾鱼,取其肝胰脏㊁脾脏和头肾组织,液氮速冻后按照上述方法提取各组织总RNA 并反转录得到cDNA㊂另随机选取3尾未免疫鱼,取其肝脏㊁脾脏和头肾组织作为免疫前对照㊂采用IgM-F1/R1进行IgM基因表达的实时定量扩增,615大连海洋大学学报第28卷ACTIN-F /R 用作内参基因扩增引物,试验方法和数据计算同 1.2.3”节㊂2　结果2.1　脾脏RNA 质量和定量PCR 引物特异性验证黄颡鱼脾脏总RNA 经甲醛变性凝胶电泳分析,可见28S RNA 和18S RNA 两条清晰条带,亮度在2∶1左右,用核酸紫外分析仪检测样品的OD 260nm /OD 280nm 值为1.8~2.0,表明RNA 质量较好,无蛋白质㊁酚等污染(图1)㊂对黄颡鱼IgM 基因表达分析引物IgM-F1/R1和内参基因β-actin 引物ACTIN-F /R 扩增产物的熔解曲线分析表明,均呈现单一峰值(84.38㊁84.97℃),说明PCR 产物单一,无非特异性扩增,引物特异性强(图2)㊂图1　黄颡鱼脾脏总RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis of the total RNA inspleen of the yellow catfish2.2　黄颡鱼IgM 重链基因恒定区的基因克隆以脾脏总RNA 反转录得到的cDNA 为模板,以IgM-F /R 为引物进行PCR 扩增,扩增产物经凝胶电泳检测得到一条约为700bp 且与预期扩增片段大小相符的条带(图3)㊂条带经切胶回收后连接pMD-18T 载体,再经PCR 扩增和酶切鉴定初步确认后送交测序,最终获得一段675bp 的序列并提交GenBank (GenBank 登录号:JQ067604.1)㊂2.3　黄颡鱼IgM 重链基因恒定区的序列分析分析发现,黄颡鱼IgM 重链基因恒定区序列共编码225个氨基酸残基(GenBank 登录号:AEY79771),包含4个保守的半胱氨酸残基(图4,第15㊁74㊁120㊁172位,加框表示)㊂进一步分析发现,黄颡鱼IgM 重链基因恒定区第15㊁74㊁120㊁172位半胱氨酸残基的分布符合IgC (免疫球蛋白恒定区)结构域的特征(C-X(n)-C,X 为任意氨基酸残基),可分别形成两个二硫键,组成两个包含89个氨基酸残基的IgC 结构域(图4,第1~89位和第98~176位氨基酸残基,下划线表示)㊂经Blast 搜索和序列比对分析显示,其编码氨基酸与瓦式黄颡鱼㊁大鳍鳠㊁斑点叉尾鮰㊁草鱼和斑马鱼等鱼类IgM 重链基因编码氨基酸序列的相似度为56%~88%(表2,图5),与鱼类IgM 基因具有较高同源性㊂表2　黄颡鱼IgM 部分序列与其他鱼类IgM 氨基酸序列的一致性和相似度比较Tab.2　Similarity and identity of deduced amino acid se⁃quence of IgM in yellow catfish Peltebagrus ful⁃vidraco ,with other fishes 物种 species一致性/%identity相似度/%similarity黄颡鱼Peltebagrus fulvidraco --瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachellii 7588大鳍鳠Hemibagrus macropterus 6275斑点叉尾鮰Ictalurus punectatus 4867草鱼Ctenopharyngodon idella 3956斑马鱼Danio rerio37562.4　黄颡鱼IgM 基因的组织表达以β-actin 为内参基因,黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏㊁头肾㊁肾脏㊁鳃㊁肌肉㊁皮肤和肠道等8个组织中IgM 基因表达情况如图6所示㊂从图6可见,IgM基因在黄颡鱼各检测组织中均有表达,但各组织间的表达水平存在较大差异㊂各组织中表达量由高到低依次为头肾㊁脾脏㊁肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠道㊁肝胰脏和肌肉,头肾和脾脏中IgM 基因的表达量明显高于其他组织,分别为表达量最低的肌肉组织的10.3和10.1倍;肾脏㊁鳃㊁皮肤㊁肠和肝胰脏中IgM 基因的表达量居中,分别为肌肉组织的5.3㊁3.7㊁3.0㊁2.7和2.2倍㊂2.5　OMPs 免疫对黄颡鱼IgM 基因表达的影响由于样品保存不当(从液氮取出时,装有样品的EP 管因温差过大炸裂),免疫前的黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾组织样品未能用于IgM 基因表达的定量检测㊂因此,各组织IgM 基因表达变化情况均采用免疫后(第4天)首次取样为初始表达水平,并以此为基准进行比较㊂以β-actin 为内参基因,经OMPs 免疫后,黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾组织(使用专用冻存管保存于液氮中)IgM 基因的表达情况如图7所示㊂从图7可见:黄颡鱼肝胰脏㊁脾脏和头肾中IgM 基因的表达呈现出不同的变化规律,与脾脏和头肾相比,肝胰脏中IgM 基因表715第6期叶仕根,等:黄颡鱼免疫球蛋白M 基因的克隆与组织表达分析达在整个取样过程中变化不太明显,最高表达(免疫后第21天)和最低表达(第14天)分别为初始水平的1.06㊁0.81倍;3个组织中,头肾和脾脏中IgM 基因表达变化规律较为相似,均为短暂图2　Real-time PCR 扩增产物的熔解曲线分析Fig.2　Melting curves of the PCR products of IgM-F1/R1and ACTIN-F /R注:M 为DL 2000DNA Marker;1~8分别为8对不同简并引物扩增的PCR 产物,其中第6道(引物为IgM-F /R)有特异性扩增产物Note:M,DL 2000DNA Marker;Lane 1-8,PCR products by dif⁃ferent degenerate primers,nes 6,PCR of IgM se⁃quence in yellow catfish products by degenerate primers IgM-F /R图3　用简并引物扩增黄颡鱼IgM 序列的PCR 产物电泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of PCR products ofIgM sequence by degenerate primers in yellowcatfish图4　黄颡鱼IgM 部分序列编码氨基酸的分析Fig.4　Deduced amino acid sequences by IgM from yellow catfish Peltebagrusfulvidraco图5　黄颡鱼IgM 部分序列与其他鱼类IgM 重链氨基酸序列的比较分析Fig.5　Comparison of multiple amino acid sequences of IgM in yellow catfish Peltebagrus fulvidraco ,with other fishes815大连海洋大学学报第28卷注:1)Hp 肝胰脏;Sp 脾脏;Hk 头肾;Ki 肾脏;Gi 鳃;Sk 皮肤;In 肠;Mu 肌肉㊂2)使用β-actin 为内参,数据分析采用2 △△CT 法处理,图中相对表达倍数指各组织以最低表达量组织为基准的表达倍数,下同Note:1)Hp,hepatopancreas;Sp,spleen;Hk,head kidney;Ki,kidney;Gi,gill;Sk,skin;In,intestine;Mu,muscle.2)Expression levels were assessed using the β-actin as endogenous con⁃trol,and measured on the basis of the minimum in tissues by2△△CTmethod,et sequentia图6　Real-time PCR 检测黄颡鱼IgM 基因的组织分布Fig.6　Expression levels of IgM gene in various tissuesdetected by Real-timePCR图7　OMPs 免疫对黄颡鱼各组织IgM 表达的影响Fig.7　Expression levels of IgM gene in various tissuesof yellow catfish challenged by OMPs detected by Real-time PCR下降(第8天)后再升高,最高表达分别出现在第14天和21天;脾脏IgM 基因表达的最高值和最低值分别为初始水平的2.90和0.71倍,头肾IgM 基因表达的最高值和最低值分别为初始水平的2.21和0.82倍;脾脏和头肾组织中IgM 基因表达自免疫后第14天到第28天试验结束时均维持了较高的表达水平,分别为初始表达水平的1.84~2.90和1.92~2.21倍㊂3　讨论本研究中,通过RT -PCR 方法首次成功克隆了黄颡鱼IgM 重链基因恒定区部分cDNA 序列㊂该序列编码氨基酸中包含4个保守的半胱氨酸残基,可分别形成两个二硫键,组成两个IgC (Ig 恒定区)结构域㊂同源性分析发现,其编码氨基酸与瓦式黄颡鱼㊁大鳍鳠㊁斑点叉尾鮰㊁草鱼和斑马鱼等鱼类的IgM 重链基因编码氨基酸序列的相似度为56%~88%,具有较高的同源性㊂在获得黄颡鱼IgM 重链基因部分序列的基础上,采用Real -time PCR 方法检测了IgM 重链基因在黄颡鱼不同组织中的表达情况以及经OMPs 免疫后其在各组织中表达的变化规律,为黄颡鱼乃至其他鱼类的抗感染机制和疾病防治研究等提供了理论依据㊂在新基因的克隆中,根据近缘物种相关蛋白氨基酸序列的保守区域设计简并引物是常用的方法之一㊂但由于密码子的简并性和摇摆性,常常使得设计出来的引物简并度非常高,不利于PCR 扩增反应的进行㊂张晓峰等[18]研究发现,鱼类密码子与其他生物一样具有明显的偏好性,即编码同一种氨基酸的密码子在翻译成蛋白质时并非均一使用,通常是某些密码子被优先使用,某一物种或某一基因通常会倾向于使用一种或几种特定的同义密码子,即所谓的最优密码子,此现象被称为密码子偏性㊂本研究中,参照鱼类密码子偏好性对引物进行了针对性修改,使两条引物的简并度分别由1536㊁4096下降至2,提高了引物的扩增效率,成功克隆到黄颡鱼IgM 基因重链恒定区的部分cDNA 序列㊂Real-time PCR 分析表明,黄颡鱼头肾和脾脏是IgM 基因mRNA 的主要分布组织,其表达量显著高于其他组织㊂本研究结果与李春涛等[22]对大鳍鳠以及王欣欣等[23]对草鱼IgM 基因mRNA 分布情况的研究结果类似㊂胡瑜兰[24]和彭博[25]研究发现,斑马鱼和鲫的头肾中免疫球蛋白具有较高表达水平㊂头肾和脾脏中较高的IgM 基因mRNA 或免疫球蛋白表达水平与其抗体产生细胞发生的主要器官的功能是相适应的,这从侧面证实了头肾和脾脏是鱼类免疫的主要场所[26-27]㊂值得注意是,作为鱼类造血器官之一,黄颡鱼肾脏中也有较高的IgM 基因mRNA 表达水平,为头肾和脾脏的50%左右㊂但这与欧洲鳗鲡[16]和大鳍鳠[22]肾脏中IgM 基因mRNA 表达水平高于脾脏中的研究结果有一定差异㊂这可能与物种差异㊁动物机体状况㊁环境等因915第6期叶仕根,等:黄颡鱼免疫球蛋白M 基因的克隆与组织表达分析素有关,如季节变化会影响鱼体内免疫球蛋白的表达水平,夏季高于冬季;运输会影响斑点叉尾鮰对抗原刺激的应答反应[28-29]㊂上述结果表明,头肾㊁脾脏和肾脏是鱼类IgM基因mRNA和免疫球蛋白表达的主要场所㊂此外,本研究中还发现,黄颡鱼肌肉组织中IgM基因mRNA的表达水平是所有被检测组织中最低的,这与对欧洲鳗鲡的研究结果一致㊂肌肉组织中IgM低表达可能与肌肉组织中MHC表达量较低有关[30]㊂因为MHC在免疫应答的启动和免疫调节中发挥重要作用,肌肉组织中较低的MHC表达量使得其自身难以具备产生免疫反应的分子基础[31]㊂由于样本保存的原因,本研究中免疫前样品未能用于IgM基因表达的定量分析㊂研究表明,鳜和大鳍鳠经嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后以及剑尾鱼经溶藻弧菌灭活疫苗免疫后,其IgM基因表达水平在第6~10天后显著升高,但在前期如第3天(剑尾鱼)㊁第4天(鳜)和第5天(大鳍鳠)变化并不十分明显[22,32-33]㊂因此,本研究中免疫后(第4㊁8㊁14㊁21天)样品中的IgM基因表达情况仍能反映出其变化规律㊂经OMPs免疫后,黄颡鱼脾脏和头肾中IgM基因表达变化趋势相似,均为先小幅降低(第8天)后升高,且自第14天起维持在较高表达水平㊂这与嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后,大鳍鳠脾脏和头肾中IgM基因表达持续升高并维持在较高的表达水平的结果一致[22]㊂但与鳜经嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫后,头肾和脾脏中转录水平峰值出现在第7天,至第28天时鳜头肾中转录水平下降到免疫前水平而脾脏仍维持在较高表达水平的研究结果有一定差异[33]㊂这可能与物种和取样时间长短有一定关系㊂Zilberg等[34]研究发现,对斑点叉尾鮰注射鮰爱德华菌后,其血细胞㊁脾脏和头肾中IgM基因表达量在13d内均显著增加㊂Raida等[35]研究发现,对虹鳟注射鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri后,其脾脏和头肾中IgM基因表达量在21d内都有增加㊂这些结果表明,鱼类IgM 分子在3周内可以识别细菌抗原[6]㊂尽管在未经免疫刺激的情况下,肝胰脏中IgM基因表达水平较低(仅为头肾或脾脏的1/4左右),作为鱼类重要的代谢器官,肝脏组成细胞参与肝脏免疫调节[36],其仍然可能在免疫防御中发挥重要作用㊂然而,本研究结果表明,经OMPs免疫后黄颡鱼肝胰脏中IgM基因表达量无明显变化㊂作者的另一研究发现,经鮰爱德华菌OMPs免疫可显著提升黄颡鱼肝胰脏中CAT㊁AKP和SOD活性(另文发表)㊂这些结果表明,鱼类特异性免疫防御更多的是与脾脏㊁头肾等组织相关,肝胰脏更多的是通过增加一些免疫酶的活性来发挥免疫防御作用,主要参与机体的非特异性免疫防御,但其详细机制仍有待于进一步探讨㊂综上所述,本研究中成功克隆到了黄颡鱼IgM 基因的部分序列,并检测了其组织分布模式和经OMPs免疫后的变化规律,研究结果将有助于对黄颡鱼IgM结构与功能的理解,为鱼类的免疫防治技术和分子免疫应答机制研究提供了基础资料㊂参考文献:[1]　Pilstrom L,Bengten E.Immunoglobulin in fish-genes,expressionand structure[J].Fish&Shellfish Immunol,1996,6:243-262.[2]　Saha N R,Suetake H,Kikuchi K,et al.Fugu immunoglobulin D:ahighly unusual gene with unprecedented duplications in its constant region[J].Immunogenetics,2004,56:438-447.[3]　Danilova N,Bussmann J,Jekosch K,et al.The immunoglobulinheavy-chain locus in zebrafish:identification and expression of a previously unknown isotype,immunoglobulin Z[J].Nat Immnol, 2005,6(3):295-302.[4]　Hansen J D,Landis E D,Phillips R B.Discovery of a unique Igheavy-chain isotype(IgT)in 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瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白基因cDNA片段的克隆及分析

中图分类号：ｓ６９６文献标识码：Ａ文章编号：６１７（０２０－５－７１７３４０２１）３０９０２
Ｍｏｅｕａｌｎｎｎｎｌｓｆｆｔｃｄｂｎｉｇｐｏｅｎｐｒｉｌｌｃｌｒｃｏｉｇａｄａａｙｉｏａｔａｉｉｄｎｒｔｉａｔｓｙａ
ｅＤＮＡｎａｒａｂｅａｆｓｉｄｋｂｒｌｃｔｈ，Ｐｅｔｏａｕａｈｌｉｌｂｇｒｓｖｃｅｌｅｉ
ＱＮＣｕｎｊ，ＣＥｉｉＩｒｈｏ，ＵＮＹＮｉｇ，ＩＮｕ－ｉＩｈａ－ｅｉＨＮＬ— ａ，Ｌ－ａＹａ，ＡＧＹｎＪＡＧＸｅｑｎｑｏＥｃ
ａａｙｉｈｗａｖｒａｄｈａｔＦＰｗｒｉｌｘｒｓｅｎＨｅｄａｉｏｅｔｓｅ．ｎｌｓｓｖｒａｄｐｓｉｕｓｄｈｌｎｅｄｎｓ
８％ｉｏａｉｏｉａｆＣｐ／ｕａｐｏＰｒｏｅｈａｔＦＰｃｎｉｔｆ２ｐｗｉ６ｂ＇ｎｒｎｌｔｄｒｇｏ１ｎｃｍｐｒｎｗｔｔｔｏｙｒｓｃｒ／．ａｔｆｔｅｒＡＢｏｓｓｅｏ５ｂｔ２ｐ３－ｔａｓａｅｅｉｎ，ｓｈｈｎｈｄ４ｈｕ
Ｐｋ口九似ｃｅ．ＰｒｆｔｅｌｅＡＢＰｃｎｉｔｆ３ｐｅｃｄｒｔｉ１ａｎｃｄ，ａｄｈｄａｖｒｌｉｅｔｙｏｅＵＪ硪ｌａｔｈｖｒＦｏｉｏｓｓｅｏ３５ｂｎｏｅａｐｏｅｎｏ１１ｍｉｏａｉｓｎａｌｏｅａｌｄｎｔｄｄｆｌｉｆ

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析梁宏伟;曹磊;李忠;邹桂伟【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(043)003【摘要】[目的]克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin,SS)基因cDNA全长序列,分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律.[方法]以黄颡鱼脑组织为材料,根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鲴SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列,再根据中间保守区序列设计2对引物,分别用于扩增5 '端和3'端序列,将扩增得到的中间保守区序列、5'端和3 '端序列拼接后得到黄颡鱼SS 基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析.用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较,并构建系统发育树.用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段(1～20 d)的表达特征.采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征.[结果]黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp,其中5 '端非翻译区139 bp,3'端非翻译区211 bp,开放阅读框为345 bp,编码114个氨基酸.黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高,为98％.系统发育树结果显示,黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支.SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达,并持续至胚胎孵化出膜,且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);在出膜后的1～20 d,SS基因在黄颡鱼中稳定表达;在成鱼的各个组织中,SS基因只在脑组织中特异性表达.[结论]初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律,推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能.【总页数】8页(P43-50)【作者】梁宏伟;曹磊;李忠;邹桂伟【作者单位】中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北武汉430223;淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉430070;中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北武汉430223;华中农业大学水产学院,湖北武汉430070;中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北武汉430223;华中农业大学水产学院,湖北武汉430070;中国水产科学研究院长江水产研究所,湖北武汉430223;华中农业大学水产学院,湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】S965.199;Q786【相关文献】1.杂交黄颡鱼hsp70基因核心序列的克隆、表达及其在高温应激下的组织表达 [J], 朱凌威;杨世勇;张朝阳;刘钊;李良玉;唐洪;赵仲孟;陈雨薇;武佳韵;黄小丽2.黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体 [J], 李石竹;方文宇;骆明飞;卢建国3.黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体 [J], 李石竹;方文宇;骆明飞;卢建国4.生长抑素基因在大肠杆菌pThioHis表达系统中的克隆与表达 [J], 刘永庆;潘杰彦;陈溥言;杜念兴;赵国屏;褚仲海;邓芳;杨胜利5.生长抑素(SS)基因在大肠杆菌pT7ZZ表达系统中的克隆与表达 [J], 陈溥言;杜念兴;赵国屏;邓芳;乌宇音;杨胜利;刘永庆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黄颡鱼MSTN基因多态性及其与生长性状的相关性分析

ＺＨＵＹｕａＹｕｎ，，ＡＮＧｎｇＷｎ．ａ一ＬＩＨｏ —
ＺＨＡＮＧＺｈｉＷｅ一ＺＯＵ — ｉ，．ＧｕｉＷｅ．ｉ，
１ＦｓｅｉｏｌｇＨｕｚｏｇＡｒｃｌｒｌｉｒｉ，ｕａ３００Ｃｉａ．ｉｒｓＣｌｅｏａｈｎｇｉｕｔａｖｓｙＷｈｎ４０７，ｈｎ；ｈｅｅｆｕＵｎｅｔ２ＹｎｔｖｒｓｅｉｅｅｒｈｎｔｕｅＣｉｅｅｃｄｍＦｓｅｃｎｅ，ｕａ３２３Ｃｉａ．ａｇｚＲｉｈｒｅＲｓａｃｓｉｔ，ｈｎｓａｅｙｏｉｒＳｉｃｓＷｈｎ４０２，ｈｎ；ｅｅＦｉｓＩｔＡｆｈｙｅ
基因型雌性个体的全长、体长、体高、体厚、头长、尾柄高、尾柄厚和体重也显著大于Ｄ基因型（＜．）ＤＰ０５。ｏ
由此推断，基因型是影响雌性黄颡鱼生长性状的有利基因型，ＤＤ基因型是影响雌性黄颡鱼生长性状的不利
基因型，可以尝试利用这两个位点对雌性黄颡鱼进行标记辅助选育。
ｄｌｔｎｓｅａｄｔｔｔｉｓＴ０３ｅ，０２ｎ１６Ｇ，ｏｇｎｔｐｓＥｎＦｗｅｅｆｕｄｉｅｔｉｅｅｏｉｎｍｕａｔ（１０ｄｌＧ１２ＡａｄＴ０３）ｔｅｏｙｅ（ＥａｄＥ）ｒｎｔｒｉｔｗｏｎｓｅｗｏｎｈｈｄｅｏｉｅｍｔｎｓｅＴ３Ｃ．ｈｄｖｄａｔｅｏｐｓＡｈｄａｌｅｖｌａｅｎｉｉｕｌｗｉｅｇｎｘｎｗｔｏｕａｔｉ（１２）ＴｅｎｉｉｕｌｗｉｇｎｔｅＡａａｒａｕｔｎｈｄｖｄａｓｔｔｅ一ｈｎｔｉｓｈｙｇｅｈｔｉｈｈ

基于PacBio平台的黄颡鱼全长转录组测序及分析

收稿日期：2021-10-15基金项目：国家自然科学基金项目（3190210143）作者简介：王家琪（1996-），男，河南长垣人，硕士，主要从事鱼类性控传育种研究，（电话）135****6869（电子信箱）********************；通信作者，梅洁（1981-），男，湖北黄梅人，教授，博士，主要从事鱼类遗传育种研究，（电话）************（电子信箱）近年来，转录组学技术广泛应用于水产动物繁育、营养、发育和免疫等各研究［1］。

目前，转录组测序应用最广的是二代测序技术（RNA-Seq ），二代转录组测序具有测序通量高、成本低的优势。

尽管二代测序技术读取准确率高，但读长相对较短，给后续序列组装、拼接以及注释等带来困难［2］。

而基于基于PacBio 平台的黄颡鱼全长转录组测序及分析王家琪，熊阳，韩庆庆，皇培培，梅洁（华中农业大学水产学院，武汉430070）摘要：为进一步丰富黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco ）信息数据库，采用PacBio 测序平台对黄颡鱼的肝脏、肾、背部肌肉、脑、脾、心脏、皮肤、血液、鳃、性腺等组织进行全长转录组混样测序。

共获得685574个全长非嵌合（Full-length non-chimeric read ，FLNC ）序列，通过与黄颡鱼基因组比对分析，共获得72509个非冗余isoforms ，平均长度为2918bp 。

共鉴定到3169个LncRNA 、45872个可变剪接事件、4881个基因存在可变多聚腺苷酸化位点和304个融合基因。

将12492个新基因与NR 、GO 、KEGG 、KOG 和Swwassprot 5个公共数据库进行比对，成功注释了7233个isoforms 。

GO 分析发现，新基因主要集中于细胞过程（Cellular process ）、细胞组分（Cell ）和结合功能（Binding ）。

KEGG pathway 分析显示，新基因主要在信号转导（Signal transduction ）和免疫系统（Immune system ）信号通路中得到富集，此外，涉及黄颡鱼生殖与繁殖相关的内分泌系统代谢途径包括催产素信号通路、雌二醇信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、促性腺激素释放激素信号通路和卵巢类固醇合成。

黄颡鱼甘露糖受体基因的克隆和功能分析

黄颡鱼甘露糖受体基因的克隆和功能分析刘小玲;王虹;樊启学;兰江风;林蠡【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2017(041)007【摘要】甘露糖受体(MR)隶属凝集素超家族,主要表达于巨噬细胞和未成熟的树突状细胞表面.MR不仅在先天免疫防御中发挥重要作用,还通过参与抗原呈递,激活T淋巴细胞,启动获得性免疫应答过程.本研究采用同源克隆技术获得黄颡鱼甘露糖受体(pfMR)基因,采用荧光定量PCR技术检测MR在正常黄颡鱼体内的分布情况,采用鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞和甘露聚糖封闭MR方法研究黄颡鱼MR在抗细菌感染中的作用.结果显示,pfMR同团头鲂、草鱼、斑马鱼和尼罗罗非鱼的MR聚为一支.pfMR在所检测的12个组织中均有分布,其在肾脏、脾脏和肌肉组织中表达量较高,在血液中表达量较少.鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞后,pfMR、IL-1β和TNF-a均被细菌诱导表达,超氧阴离子和一氧化氮的含量也上升,超氧阴离子在感染30 min后即显著上升,一氧化氮在感染12 h后才显著上升.甘露聚糖竞争结合MR,显著抑制巨噬细胞内化GFP标签的鲖爱德华菌,加入EDTA减少内化的荧光强度,加入Ca2+使内化的荧光强度回升.研究表明,黄颡鱼头肾巨噬细胞MR参与鲖爱德华菌的识别和内吞过程,而且依赖Ca2+.%Mannose receptor (MR) is a member of C-lectin family. It is mainly expressed on the surface of macrophage and immature dendritic cells. It has been shown that MR not only plays a significant role in innate immune responses, but also initiates acquired immune responses through processing and presenting antigensto activate T cells. In this study, we cloned and characterizedpf MR ofChinese yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco). The expression profiles of pfMR mRNA in different tissues of P. fulvidraco were assessed by real-time quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR). To investigate the role of pfMR participating in the antibacterial infection, yellow catfish head kidney macrophages were infected with Edwardsiella ictaluri and competition binding test of mannan to MR was carried out. The phylogenetic tree analysis showed that MR of P. fulvidraco, Megalobrama amblycephala,Ctenopharyngodon idella,Danio rerio, and Oreochromis niloticus formed a clade. The mRNA of pfMR was expressed in all detected tissues with higher level in the kidney, spleen and muscle, and lowest expression in the blood. The expressions of pfMR,IL-1β and TNF-a mRNAs were all increased in cultured primary head-kidney macrophages after E. ictaluri infection. The infection of E. ictaluri also resulted in the over-expression of large number of superoxide anion () and nitric oxide (NO) in the macrophages. The infection of E. ictaluri could significantly activate the production of at 30 min post treatment, while the amount of NO in the macrophage was significantly elevated at 12 h post treatment. Mannan significantly inhibited the engulfed GFP-E. ictaluri by macrophages through competition binding to MR. The engulfed GFP-E. ictaluri was significantly reduced by addition of EDTA, and restored by addition of Ca2+. The present study indicated that MR in head kidney macrophages of yellow catfish mediated phagocytosis of E. ictaluri and it was Ca2+-dependent.【总页数】8页(P1036-1043)【作者】刘小玲;王虹;樊启学;兰江风;林蠡【作者单位】华中农业大学水产学院,水生动物医学系,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,水生动物医学系,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,水生动物医学系,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,池塘健康养殖湖北省工程实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,水生动物医学系,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,池塘健康养殖湖北省工程实验室,湖北武汉 430070;华中农业大学水产学院,农业部淡水生物繁育重点实验室,湖北武汉 430070【正文语种】中文【中图分类】Q785;S965【相关文献】1.百子莲赤霉素受体基因ApGID1全长的克隆及功能分析 [J], 岳建华;张荻;申晓辉2.黄颡鱼促甲状腺激素受体基因的克隆及其对饲料中添加碘化钾的表达反应 [J], 王春玲;章宏塔;高有领;钱国英3.淇河鲫甘露糖受体基因克隆及嗜水气单胞菌感染对其基因表达的影响 [J], 王俊丽;闫潇;卢荣华;秦超彬;梁丽娜;刘燕琴;聂国兴4.黄颡鱼促卵泡激素受体基因的克隆及其在雌鱼生殖周期中的表达 [J], 刘淼;温海深;何峰;李吉方5.黄颡鱼促黄体激素受体基因克隆及在雌鱼繁殖周期中的表达 [J], 刘淼;温海深;何峰;李吉方;马瑞芹;胡健;母伟杰;张远青;祁保霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析PPT课件

5’RACE扩增
3’RACE扩增
拼接cDNA全长分析
保守区扩增
5
结果及分析
1、肌肉总RNA的提取结果
RNA条带清晰，表明 RNA无明显降解，可用于逆转录cDNA。
图1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼肌肉总RNA
6
2、cDNA模板检测结果
M
1
2
在200-300bp之间有一条明显条带而阴性对照未扩增出条带，证明反转录反应成功， cDNA模板可用。
➢ 同时感谢课题组的全体老师和同学给予的鼓励和无私的帮助！
21
大黄鱼Rac基因cDNA全长克隆及分析
1
主要内容
❖ 研究背景与意义 ❖ 技术路线 ❖ 结果与分析 ❖ 结论 ❖ 致谢语
2
研究背景与意义
❖大黄鱼属于硬骨鱼纲鲈形目石首鱼科黄鱼属,又名黄花鱼、黄瓜鱼、大黄花鱼，是我国特有的经济鱼种，也是福建省的主要养殖种类。
➢随着养殖规模扩大、世代增加，病害问题越来越趋严重，给养殖业造成了巨大的经济损失，阻碍了大黄鱼养殖业的持续发展。因此，从其自身的抗病力入手，提高鱼体自身的免疫力来抵抗病原微生物的侵袭是一个很好的途径。
2:以PCR产物为模板的阳性对照；
3-6：菌落PCR
10
皮肌炎图片——皮肌炎的症状表现
❖ 皮肌炎是一种引起皮肤、肌肉、心、肺、肾等多脏器严重损害的，全身性疾病，而且不少患者同时伴有恶性肿瘤。它的1症状表现如下：
❖ 1、早期皮肌炎患者，还往往伴有全身不适症状，如-全身肌肉酸痛，软弱无力，上楼梯时感觉两腿费力；举手梳理头发时，举高手臂很吃力；抬头转头缓慢而费力。
5、 3’RACE第一轮PCR结果
第一轮扩增得到一条较亮的1100bp左右的条带，阴性对照无条带.

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黄颡鱼ＤＭＲ因ｃＡＴ１基ＤＮ全长克隆及其表达分析
李林梁宏伟李忠。罗相忠。。朱媛媛邹桂伟Ｌ张志伟
１农业部淡水生物多样性保护与利用重点开放实验室／．中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉４０２；３２３２华中农业大学水产学院，．武汉４０７；３中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，３００．无锡２４８１０１
基因一样，含有一个Ｄ结构域（Ｍ—ｏｉ）上市规格小、整齐，都ＭＤｄｍａ，ｎ不在一定程度上影响了其市场发以锌指结构与特异的ＤＮＡ序列结合，节目的基展前景。本研究采用Ｒ－Ｃ调ＴＰＲ及ＲＣＡＥ技术，在黄因转录，而调控性别的决定与分化［。ＤＭＲＴ１颡鱼中分离出了Ｄ从１］Ｔ１基因，利用实时荧光定并
基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的１１ｄ仔鱼均有表达，～５且在胚后发育的第３１天表达量最高；在成
体，只在雄性精巢中特异性表达，其他组织均无表达，且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高，明该基因可能表
在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。
关键词黄颡鱼；ＤＭＲＴ基因；ｃＮＡ末端快速扩增（ＡＣ；因克隆；光定量；１ＤＲＥ）基荧表达分析
Ｑ８；８７１Ｑ７６文献标识码Ａ文章编号１０－４１２１）２０２—７００２２（０２０—２００中图分类号
ＤＭＲＴ（ｏｂｅｅｎａ一ｒｌｔｄｔａ — ｄｕｌｓｘａｄｍｂ３ｅａｅｒｎ
ｔｂｇｕｌｋｒ。因其具有食性杂、ｅａｒｓｅｅ）ｏＢｅ易驯养、无产研究所窑湾试验场。在胚胎发育阶段对受精卵进肌间刺、肉味鲜美、养价值高等优点，成为我国行连续取样，营而每期各取２Ｏ粒；后发育１５胚～１ｄ连
是ＤＭＲＴ基因家族成员之一，继发现于哺乳量ＰＲ技术对其在胚胎发育阶段、后发育阶段、相Ｃ胚
类［鱼类［鸟类［爬行类［及两栖类［动物中，雌雄成体阶段及性腺发育阶段的表达进行了研究，、、、］。］被认为是目前已知最为保守的一个与性别分化相关以期为黄颡鱼早期性别鉴定、性育种及其性别决单的基因，该基因在性别分化期的雄性性腺及雄性成定机制研究提供参考。体的精巢中特异性表达，于雄性性腺的形成和功对
江河湖泊中一种较为名贵的小型经济鱼类。但在自

ｓｒｔｎａｔｒ基因家族是一个与性别决定和分化然水域中，ｃｉｉｃ）ｐｏｆｏ黄颡鱼生长速度较慢，同龄性成熟的个且相关的基因家族，广泛参与生物的性别发育过程，体雌雄差异显著，其雄性个体明显大于雌性个体，生长编码产物与果蝇的ｄｕｌｓｘ基因和线虫的ｍａ一速度雄性比雌性个体快３以上［，往造成养殖ｏｂｅｅｂ３０／９６７往］
阶段的表达情况进行研究。结果表明，黄颡鱼ＤＭＲＴ１基因ｃＮＡ序列全长１３１ｂ，中５端非翻译区３Ｄ８ｐ其Ｏ
ｂ，ｐ３端非翻译区４４ｂＥ５ｐ不包括ｐｌ（］开放阅读框８５ｂ，ｏｙＡ），８ｐ编码２５个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表９
能维持具有重要作用。
１材料与方法
料
黄颡鱼（ｅｔｏａｒｓｕｖｄａｏ，于鲇形目１１材Ｐｌｂｇｕｆｌｉｒｃ）属ｅ．（ｉｒｏｍｅ）鳞科（ａｒａ）黄颡鱼属（ｅ— ＳｌｉｒｓｕｆＢｇｉｅｄＰｌ
试验所用材料取自中国水产科学研究院长江水
明，黄颡鱼ＤＭＲ基因与革胡子鲶同源性最高（８％）与黑鲷、Ｔ１为１，虹鳟、马鱼、斑青蝣的同源性分别为６、０５、４和５，９６２与小鼠、人的同源性较低，别为４和４。实时荧光定量Ｒ－Ｃ分２４ＴＰＲ分析表明：ＤＭＲＴ１
第３卷第２期１
２１０２年４月
华
中
农
业
大
学
学
报
Ｖｏ．１Ｎｏ２１３．
Ａｐ．２１，２￣２６ｒ０２２０２
ＪｕｎｌｆＨｕｚｏｇＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉｏｒａａｈｎｒｃｌｕａｉｅｓｔｏｙ
摘要利用Ｒ－ＣＴＰＲ和ｃＡ末端快速扩增技术（ａｉａｌｃｔｎｏＤＤＮｒｐｄｍｐｉａｉｆＮＡｎｓＲＥ克隆了黄颡鱼ｉｆｏｃｅｄ，Ａｃ）ＤＭＲＴ基因ｃＮＡ全长序列，１Ｄ并利用实时荧光定量Ｒ－ＣＴＰＲ技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育
收稿日期：０１０—７２１－５１基金项目：国家“ ６ ” ８３计划（ｏ１Ａｏ４１和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目２ｌＡ１ｏＯ）李林，硕士研究生．研究方向：鱼类遗传育种．Ｅｍａｌｌｉ－ｙｚ１３ｃｒ－ｉ：ｉｎｚｆ６．ｏｌ＠ｎ